Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

39 страниц

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Документ предназначен для для специалистов ветеринарных лабораторий санэпидстанций, ветеринарных и медицинских врачей, научных работников.

 Скачать PDF

Оглавление

1. Диагностика сибирской язвы

     1.1. Общие положения

     1.2. Взятие и пересылка патологического материала для исследования

     1.3. Порядок проведения исследования

     1.4. Кожная аллергическая проба с антраксином

     1.5. Выдача заключения по результатам исследования

     1.6. Сроки исследования

2. Обнаружение возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды

     2.1. Цель исследования

     2.2. Взятие материала для исследования

     2.3. Подготовка проб к исследованию

     2.4. Методы обогащения проб и бактериологическое исследование

     2.5. Постановка и учет реакции диск-преципитации

     2.6. Идентификация культур

     2.7. Учет результатов идентификации культур

     2.8. Определение вирулентности сибиреязвенных культур

3. Требования к режиму работы и передаче выделенных культур

Приложение

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ У ЖИВОТНЫХ И ЛЮДЕЙ, ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ В СЫРЬЕ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ (методические указания)

МОСКВА ВО "АГРОПРОМИЗДАТ" 1989

УДК 616-07.616.981.51 (083.131)

Редактор Г. А. Зайцева

Методические указания разработаны Ю. А. Малаховым, Н. Г. Ипатенко, Н. Т. Татаринцевым, докторами ветеринарных наук; А. А. Маничевым, кандидатом ветеринарных наук (Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов) ; Б. Л. Черкасским, доктором медицинских наук; А. Г. Кнопом, кандидатом медицинских наук (Институт эпидемиологии АМН СССР); В. А. Гавриловым, А. В. Никитиным, кандидатами ветеринарных наук (Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии) ; А. А. Харькевичем (Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко); Б. И. Антоновым (Центральная ветеринарная лаборатория) ; В. А. Седовым, кандидатом ветеринарных наук (Госагропром СССР); Ю. И. Соркиным, кандидатом медицинских наук (Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока); Н. П. Буравцевой, кандидатом медицинских наук (Научно-исследовательский противочумный институт Кавказа и Закавказья).

Утверждены Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР и Главным управлением карантинных инфекций Минздрава СССР (утв. 01 сентября 1986 г.).

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу "Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы" (утв. 7 мая 1979 г.), "Методические указания по обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды" (утв. 1 ноября 1979 г.), "Временные методические указания по постановке реакции диск-преципитации при диагностике сибирской язвы и идентификации ее возбудителя" (утв. 24 июня 1980 г.), в "Инструкции и методических указаниях по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей" (утв. 15 июля 1980 г.) раздел "Лабораторные исследования при сибирской язве".

Предназначены для специалистов ветеринарных лабораторий санэпидстанций, ветеринарных и медицинских врачей, научных работников.

Ответственные за выпуск: В. А. Седов (Главное управление ветеринарии Госагропрома СССР); А. А. Маничев (лаборатория контроля и стандартизации анаэробных и сибиреязвенных препаратов ВГНКИ).

©Государственный агропромышленный комитет СССР, 1989

культуральныз свойства;

патогенность для лабораторных животных (гибель хотя бы одного из двух лабораторных животных, зараженных суспензией из исходного патологического материала или полученной культурой возбудителя, с последующим выделением ее из органов мыши или морской свинки).

При наличии в мазках характерных морфологических и культуральных свойств и капсул из исходного патологического материала дальнейшее изучение культуры не проводят.

В случае получения нечетких результатов по одному из двух первых свойств, не дожидаясь результатов био^ пробы, определяют чувствительность культуры к сибиреязвенному бактериофагу и пенициллину.

1.3.5.2.    Чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу.

Фаготипирование проводят одним из следующих методов: стекающей капли, пробирочным или микрометодом с использованием сибиреязвенных бактериофагов "К"-ВИЭВ и "Гамма-MBA" в соответствии с наставлениями по применению указанных фагов.

1.3.5.3.    Чувствительность к пенициллину (тест "жемчужного ожерелья"). Агар с пенициллином (приложение, п. 4) и без него разливают в чашки Петри и после застывания пробиркой с ровными краями делают насечки агара или вырезают пластинки (1,5 х 1,5 см), которые переносят на предметные стекла и помещают в чашки Петри.

На каждую пластинку бактериологической петлей наносят трехчасовую бульонную культуру. Чашки Петри закрывают крышками и помещают в термостат. Через 1—3 ч посевы просматривают под микроскопом с сухой (объектив х 40) и иммерсионной системами. Перед просмотром зону роста культуры накрывают покровным стеклом. Сибиреязвенные микробы на МПА с пеницилли-

11

ном принимают шаровидную форму, а цепочки имеют вид жемчужного ожерелья. Спорообразующие сапрофитные аэробные микробы в аналогичных условиях вырастают в виде обычных форм. На агаре без пенициллина сибиреязвенные микробы образуют длинные цепочки, состоящие из типичных палочек.

При отрицательном результате микроскопии инкубацию посевов продолжают до 6 ч, после чего исследуют повторно и делают заключительный учет теста.

Выделенную культуру относят к Вас. anthracis при наличии капсул в мазках из исходного патологического материала или органов павшего зараженного животного и других характерных морфологических культуральных свойств возбудителя; при отсутствии капсул, но наличии других характерных морфологических и культуральных свойств возбудителя, чувствительности его к сибиреязвенному фагу и пенициллину.

1.4. КОЖНАЯ АЛЛЕРГИЧЕСКАЯ ПРОБА

С АНТРАКСИНОМ

Проба основана на способности организма больного и переболевшего человека отвечать аллергической реакцией в виде гиперемии кожи и образования инфильтрата на месте введения препарата. Реакция может появляться уже с первых дней заболевания, но у подавляющего числа больных она наблюдается на 5—7-е сутки заболевания.

1.4.1. Реакцию ставят на внутренней поверхности верхней трети предплечья: 0,1 мл антраксина при помощи шприца с тонкой иглой вводят строго внутрикожно с соблюдением правил асептики. В кожу другого предплечья (в качестве контроля) вторым шприцем с тонкой иглой инъецируют такое же количество стерильного 0,9 %-ного раствора натрия хлорида.

12

Реакцию учитывают через 24 и 48 ч в соответствии с наставлением по применению препарата.

1.4.2.    Положительную антраксиновую пробу не принимают во внимание у лиц, вакцинированных против сибирской язвы в течение предшествовавших 12 мес или переболевших ею.

1.4.3.    Получение положительной пробы с антраксином не исключает необходимости обязательного бактериологического исследования больного, а также предполагаемого источника и факторов передачи.

1.5. ВЫДАЧА ЗАКЛЮЧЕНИЯ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ

ИССЛЕДОВАНИЯ

1.5.1.    Диагноз сибирской язвы у животного считают установленным в одном из следующих случаев:

гибели хотя бы одного лабораторного животного из двух, зараженных суспензией из исходного патологического материала, с последующим выделением из его органов культуры Вас. anthracis даже при отсутствии роста культуры возбудителя из патологического материала;

получения положительной реакции преципитации при исследовании загнившего исходного патологического материала;

получения положительной реакции преципитации при наличии характерной клинической картины и патологических изменений у свиней даже при отсутствии культуры возбудителя в высевах из исходного патологического материала и отрицательном результате биопробы.

1.5.2.    Диагноз сибирской язвы у человека считают установленным при наличии соответствующей клинической картины, эпидемиологического анамнеза, подтвержденных одним из перечисленных способов:

выделения из патологического материала культуры Вас. anthracis и гибели хотя бы одного из двух зараженных

13

лабораторных животных и выделением из его органов культуры со свойствами, характерными для возбудителя сибирской язвы;

гибели хотя бы одного лабораторного животного из двух, зараженных исходным материалом, с последующим выделением из его органов культуры Вас. anthracis;

выделения вирулентной культуры Вас. anthracis из предполагаемого источника или фактора передачи; положительной антраксиновой пробы.

1.6. СРОКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроскопического — в день поступления материала, бактериологического — до трех суток, биологического — до десяти суток.

2. ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ В СЫРЬЕ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

2.1. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования объектов внешней среды и сырья животного происхождения проводят:

при необходимости установить или подтвердить источник или фактор передачи возбудителя инфекции животному или человеку;

для выявления обсемененности возбудителем сибирской язвы отдельных объектов в случаях, предусмотренных соответствующими инструкциями;

в целях обнаружения возбудителя сибирской язвы в местах старых скотомогильников при строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работах, связанных с выемкой и перемещением грунта;

14

для подтверждения результатов исследования шкурок мерлушки и козлика в случаях положительной реакции преципитации.

2.2. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1.    Отбор проб шерсти. Для бактериологического исследования берут из разных мест упаковки не менее пяти образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее десяти образцов из разных мест каждой кипы, а также свернувшуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

2.2.2.    Отбор проб кожевенно-мехового сырья. Для исследования берут кусочки размером 3x3 см с периферических незагнивших и незаплесневевших участков шкурок рядом с местами, откуда брали пробы для контрольного исследования. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и из этих мест.

2.2.3.    Отбор проб кормов. Концентрированные корма (зерно, отруби, комбикорм) отбирают в зависимости от условий их хранения.

При наличии незатаренных кормов первичные пробы отбирают из расчета одна проба массой не менее 10 г на 4 м2 поверхности, но не менее пяти проб от каждого закрома, партии. Первичные пробы берут как из поверхностных, так и из глубоких слоев корма равномерно по всей площади.

При наличии затаренных кормов отбор проб проводят согласно следующей таблице.

Пробы отбирают сухим стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждого объекта (партии) щуп очищают и обжигают огнем паяльной лампы.

15

От какого числа упаковочных единиц отбирают пробы

Число упаковочных единиц

До 10

От 11 до 100 От 101 и больше

От каждой упаковочной единицы От 10 упаковочных единиц

От 10 упаковочных единиц и дополнительно по 3 от каждых 100 упаковочных единиц

Первичные пробы грубых кормов (сено, солома) берут из разных мест скирды (стога) при помощи ножниц и пинцета из расчета одна проба массой не менее 40 г на 4 м2 площади скирды.

Собранную зеленую массу берут, как и грубые корма, увеличив массу первичной пробы до 100 г.

Корнеплоды (клубнеплоды) в зависимости от величины отбирают из расчета одна—три штуки на 4 м2 площади бурта, отсека. С отобранных корнеплодов скальпелем в местах, где имеются остатки земли, срезают поверхностный слой, который используют для исследования.

Пробы силоса, хранящегося в ямах (траншеях), отбирают, как и пробы почвы (п. 2.2.4), вынутого из траншеи — как пробы зеленой массы.

В лабораторию направляют среднюю пробу, которую составляют из хорошо перемешанных первичных проб данной партии, емкости и т. п. Масса средней пробы должна быть не более 500 г.

2.2.4. Отбор проб почвы. Обследованию подлежат участки, подозреваемые в обсеменении возбудителем сибирской язвы. Обследуемую площадь разбивают на квадратные участки (сторона каждого не более 4 м). Почвенным буром отбирают пробы почвы массой 20— 30 г по углам и в центре каждого участка.

Пробы почвы с территории, подозреваемой в поверх-

I. Культура Вас. anthracis с МПБ. Окраска по Г раму И. Споры Вас. anthracis. Окраска по методу Пешкова «II. Споры Вас. anthracis. Окраска по методу Шеффера и Фултона




Культура Вас. anthraeis:

а — окраска по Ольту; 0 — окраска по Михину; в — окраска по Ребигеру


в

Рост бацилл сибирской язвы:

а — колония R-формы; б — колония S-формы; в — колония RO-фор-мы


Морфологически измененные формы Вас. anthracis, выделенные из подмел юстнык лимфатических узлов свиней. Окраска по Г раму


1. ДИАГНОСТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ У ЖИВОТНЫХ И ЛЮДЕЙ

1.1.    ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1.1.    Сибирская язва — острое инфекционное заболевание животных и человека, вызываемое Вас. anthracis, которая относится к роду Bacillus семейства Bacillaceae. Возбудитель сибирской язвы — неподвижная грамполо-жительная палочка, in vitro образует спору, а в организме восприимчивых животных и человека — капсулу и специфический экзотоксин, не обладает фосфатазной активностью, чувствительна к пенициллину, лизируется специфическими бактериофагами, патогенна для лабораторных животных.

1.1.2.    Исследование на сибирскую язву осуществляют при помощи микроскопии мазков из исходного патологического материала, высевов на питательные среды, постановки биопробы и при необходимости реакции преципитации, а у человека, кроме того, проведения антраксиновой пробы.

1.2.    ВЗЯТИЕ И ПЕРЕСЫЛКА ПАТОЛОГИЧЕСКОГО

МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.2.1. Взятие патологического материала от животных.

Для исследования в лабораторию направляют ухо, перевязанное у основания, или мазок крови, полученной из надреза уха; от трупов свиней — участки отечной соединительной ткани и заглоточные, подчелюстные, а также другие лимфатические узлы, в которых имеются характерные патологоанатомические изменения.

Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно его туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между перевязками. Место отреза уха на трупе прижигают.

3

б

Проба с бактериофагом:

а - в пробирках — метод стекающей капли; б — в чашках Петри микрометод

Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного (кроме трупов свиней), вскрытие прекращают и на исследование направляют часть селезенки.

Взятие материала от вынужденно убитых животных и его исследование проводят в соответствии с ГОСТ 21237—75 "Мясо. Методы бактериологического анализа" и действующими "Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов".

1.2.2.    Взятие материала от человека. При кожной форме болезни исследуют содержимое везикул, карбункулов, отделяемое язвы или отторгнутый струп. Перед взятием материала у больного (желательно до начала лечения) нужно осторожно очистить спиртом кожу вокруг пораженного места и поверхность карбункула.

В случаях септической формы берут 1 мл крови из вены, желательно в период лихорадки. Кровь (1—2 капли) высевают на питательные среды, а также из нее делают два тонких мазка на предметных стеклах.

У умерших берут части пораженных органов, тканей и обязательно кровь, селезенку.

1.2.3.    Направление патологического материала на исследование. Патологический материал, подлежащий исследованию, помещают в чистую посуду (пробирки, банки). Высушенные мазки кладут в чашки Петри, которые обертывают плотной бумагой. На упаковке делают надпись "Мазок нефиксирован!".

Посуду с патологическим материалом помещают во влагонепроницаемую тару, обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись "Верх, осторожно!" и направляют в лабораторию с нарочным.

Сопроводительные документы к патологическому материалу от животного заполняют в соответствии с требованиями "Ветеринарного законодательства".

4

На сопроводительной этикетке к патологическому материалу от человека указывают фамилию, имя, отчество больного (умершего), место и время взятия патологического материала, его наименование и предположительный диагноз.

1.3. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

В лаборатории проводят микроскопическое исследование исходного патологического материала, делают посевы на питательные среды, заражают лабораторных животных, при необходимости ставят реакцию преципитации, идентифицируют выделенные культуры.

Если ухо животного доставлено обескровленным, его обязательно исследуют и по реакции преципитации.

В случае доставки загнившего патологического материала его исследуют только по реакции преципитации.

1.3.1.    Микроскопическое (предварительное) исследование.

1.3.1.1.    Из доставленного патологического материала делают мазки, фиксируют этиловым спиртом с добавлением 3 % перекиси водорода (приложение, п. 1), окрашивают по Граму и на капсулу — по Ребигеру, Михину, Ольту или Романовскому-Гимзе; при наличии люми-несцирующих сывороток используют метод флуоресцирующих антител.

1.3.1.2.    В мазках, окрашенных по Граму, Вас. anthra-

cis — грамположительная палочка (прямая). Палочки располагаются короткими цепочками или попарно, концы их, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях (чаще в мазках от человека или свиней) форма микробов сибирской язвы может быть нехарактерной (короткие толстые или изогнутые, иногда зернистые палочки со вздутием Посередине или на конце, возможно наличие "теней” микробов).    5

1.3.1.3.    В окрашенных специальными методами мазках из свежего патологического материала сибиреязвенные палочки окружены капсулой, из несвежего — микробы несколько увеличены, концы их закруглены, морфологическая стройность бацилл нарушена (они как бы изъедены), иногда отмечаются "тени", а вместо капсул — сла-боокрашенные обрывки.

1.3.1.4.    Обрабатывают препараты люминесцирующими сыворотками в соответствии с наставлением по их применению.

Обнаружение в мазке специфического свечения позволяет подозревать наличие в исследуемой пробе возбудителя сибирской язвы.

По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

1.3.2. Посев на питательные среды.

Т.3.2.1. Посевы из исходного патологического материала делают в мясо-пептонный бульон (МПБ) и на мясо-пептонный агар (МПА) или бульон и агар Хоттингера (pH 7,4 ± 0,2). Одновременно можно делать посевы на дифференциально-диагностическую среду с 0,01 % фенолф-талеинфосфата натрия (приложение, п. 2), желатин, кровяной бульон и агар.

Посевы инкубируют 18—24 ч при температуре 37 ± ± 1 °С и при отсутствии роста выдерживают при той же температуре еще 48 ч.

Из свежего патологического материала можно одновременно делать посевы в систему для постановки реакции диск-преципитации (приложение, п. 3). При этом посев проводят пастеровской пипеткой в мясо-пептонный бульон, находящийся над слоем агарового геля. Не следует вносить в среду большое количество крови или крупные кусочки кровенаполненных органов, так как это затрудняет обнаружение специфического диска преципитации вследствие окрашивания геля. С посевами посту-

6

пают, как указано в п. 2.5. Полученные результаты оценивают, как и при реакции преципитации, поставленной общепринятым методом.

1.3.2.2.    После суточного роста сибиреязвенных микробов МП Б остается прозрачным, на дне образуется рыхлый осадок в виде комка ваты. При встряхивании пробирки бульон не мутнеет, осадок разбивается на мелкие хлопья. В отдельных случаях в МПБ появляется диффузный рост культуры (легкое помутнение), при встряхивании образуются муаровые волны.

Из бульонной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках из типичной бульонной культуры обнаруживают цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек, из бульонной культуры с диффузным ростом — отдельные или парно расположенные палочки.

1.3.2.3.    На плотных питательных средах возбудитель сибирской язвы образует плоские матово-серые шероховатые (R-форма) колонии. Центр их иногда затемнен, периферия бахромчатая с локонообразными отростками. Встречаются колонии с менее выраженной шероховатостью и без отростков, которые также подлежат дальнейшей идентификации.

Под малым увеличением микроскопа (в 10—60 раз) колонии имеют вид локонов, состоящих из сплетений длинных нитей микробов, получивших название "головы медузы", "львиной гривы".

Культуры, выросшие на дифференциально-диагностической среде, обрабатывают парами аммиака (приложение, п. 2) и для дальнейшего исследования отбирают только бесцветные колонии.

При посеве уколом в столбик 10—12 %-ной желатины бациллы на вторые—пятые сутки образуют в ней желтовато-белый стержень. От него под прямым углом отходят нежные боковые отростки — от коротких к более длинным

7

по мере приближения к поверхности среды (лучшие условия аэрации), что напоминает перевернутую елочку. Постепенно верхний слой желатины разжижается, принимая сначала форму воронки, затем мешочка.

Гемолиз в бульоне с кровью происходит очень медленно, на кровяном агаре он, как правило, не наблюдается.

1.3.2.4. При получении смешанной культуры возбудителя сибирской язвы выделяют путем дробного рассева на плотные питательные среды в чашках Петри, отсева отдельных колоний, заражения белых мышей.

Из шероховатых колоний, выросших на плотной питательной среде, а также из бесцветных колоний на дифференциально-диагностической среде делают мазки и пересев в МП Б и на МПА для дальнейшей их идентификации.

Изучаемые культуры вместо МПБ можно пересевать в систему для постановки реакции диск-преципитации. В этом случае дальнейшую работу проводят только с культурами, давшими положительные или нечеткие результаты (приложение, п. 3).

1.3.3. Биологическое исследование (биопроба).

1.3.3.1.    Исследуемый патологический материал (в день поступления) суспендируют в небольшом объеме 0,9 %-ного раствора натрия хлорида, вводят двум белым мышам в дозе 0,2—0,5 мл под кожу спины ближе к корню хвоста или 0,5—1,0 мл двум морским свинкам подкожно в области живота. Гибель зараженных животных наступает через одни—трое суток, иногда позже.

1.3.3.2.    Павших животных вскрывают, делают мазки и посевы на питательные среды из крови сердца, селезенки, печени, инфильтрата на месте инъекции исследуемого материала.

1.3.3.3.    При биологическом исследовании необходимо учитывать, что лабораторные животные, зараженные суспензией из патологического исходного материала свиней,

могут погибнуть от сопутствующей патогенной микрофлоры, чаще пастерелл. В этих случаях бактериологическое исследование на сибирскую язву продолжают и проводят повторное заражение животных выделенными культурами, имеющими культуральные свойства, характерные для Вас. anthracis.

1.3.3.4.    В случаях, если чистая культура возбудителя из посевов исходного патологического материала на питательные среды получена до наступления гибели лабораторных животных, зараженных суточной бульонной культурой, заражают дополнительно двух мышей или морских свинок в дозах, указанных в п. 1.3.3.1.

1.3.3.5.    Наблюдение за лабораторными животными, зараженными суспензией из исходного патологического материала или культурой возбудителя, ведут в течение десяти суток.

1.3.4. Реакция преципитации.

1.3.4.1.    Перед постановкой реакции свежий патологический материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18—20 ч, несвежий экстрагируют сразу.

1.3.4.2.    Экстрагирование проводят горячим и холодным способами. При этом следует учитывать, что в экстрактах, полученных горячим способом, меньше пре-ципитиногенов.

Горячий способ: кусочки исследуемого патологического материала (1—2 г) помещают в пробирку или колбу, заливают 0,9 %-ным раствором натрия хлорида в соотношении 1:10 и кипятят 30—40 мин в водяной бане.

Холодный способ: кусочки патологического материала (1—2 г) растирают в ступке с песком, переносят в колбу или баночку, заливают 0,9 %-ным раствором натрия хлорида (с добавлением 0,3 % кристаллического фенола) в соотношении 1:10 и оставляют на 16—18 ч при температуре 20 ± 2 °С.

Полученные экстракты фильтруют через асбестовую

9

вату до прозрачного состояния, причем первые капли фильтрата удаляют.

1.3.4.3.    Реакцию преципитации ставят путем наслаивания или подслаивания. При наслаивании в уленгутовс-кую пробирку наливают 0,2—0,3 мл прозрачной преципи-тирующей сибиреязвенной сыворотки, затем осторожно наслаивают равное количество экстракта так, чтобы между компонентами была ясно выраженная граница (тонкая прямая линия).

При подслаивании в уленгутовскую пробирку сначала вносят 0,2—0,3 мл экстракта, затем под него осторожно пастеровской пипеткой подслаивают равное количество преципитирующей сыворотки.

Если при соединении компонентов резко выраженная граница между ними отсутствует, реакцию ставят повторно.

Одновременно ставят контроль преципитирующей сибиреязвенной сыворотки со стандартным сибиреязвенным антигеном. При положительной реакции в течение 1—2 мин после соединения компонентов появляется характерное кольцо.

1.3.4.4.    Реакцию преципитации считают положительной, если через 1—2 мин и не позже, чем через 15 мин, на границе между компонентами появится тонкое беловатое кольцо.

При отрицательном результате реакции преципитации с экстрактом, полученным горячим способом, реакцию ставят повторно с экстрактом, полученным холодным способом.

1.3.5. Идентификация возбудителя сибирской язвы.

1.3,5.1. Идентификацию возбудителя сибирской язвы проводят по следующим признакам:

морфология микроба, включая наличие капсул в мазках из исходного патологического материала или органов павших подопытных животных;

10