Глэвнбгй Государственный санитарный врач Республики Беларусь, заместитель минщгтай^здравоохранения

2000 г.

МЕТОД

по определению аминокислот в продуктах питания с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

мви,МН

Минск 2000 г.

Содержание:

1.    НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ.....................................................................................................3

2.    НОРМЫ ПОГРЕШНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ.....................................................................................................4

3.    СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ

.......................................................................................................................................................................................4

3.1.    Средства измерений:.....................................................................................................................................4

3.2.    Вспомогательные устройства:...................................................................................................................5

3.3.    Материалы:......................................................................................................................................................5

4.    МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ.........................................................................................................................................6

5.    ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ....................................................................................................................6

6.    ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРА....................................................................................6

7.    УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ....................................................................................................6

8.    ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ......................................................................................6

8.1.    ПОДГОТОВКА ИЗМЕРИТЕЛЬНОЙ АППАРАТУРЫ...................................................................................................6

8.2.    Получение бидистиллированной воды.....................................................................................................7

8.2.1 .ПРИГОТОВЛЕНИЕ БУФЕРНЫХ РАСТВОРОВ И РЕАКТИВОВ.................................................................................7

8.3.    Приготовление градуировочных растворов.............................................................................................8

8.3.1.    Приготовление градуировочных растворов смеси 17 аминокислот без триптофана..................8

8.3.2.    Приготовление градуировочных растворов триптофана...................................................................8

8.4.    ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ ГРАДУИРОВОЧНЫХ РАСТВОРОВ АМИНОКИСЛОТ......................................................9

8.5.1.    Контроль градуировочного графика.....................................................................................................10

8.5.2.    Оперативный контроль градуировочного графика...........................................................................10

8.6.    Отбор проб, подготовка анализируемых образцов...............................................................................11

8.6.1.    Кислотный гидролиз продуктов.............................................................................................................11

8.6.2.    Щелочной гидролиз продуктов..............................................................................................................11

8.7.    ПОЛУЧЕНИЕ ДАБС ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ.......................................................................................11

9.    ВЫПОЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ.......................................................................................................................12

10.    ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ............................................................................................12

11.    ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ.......................................................................................13

12. КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ МВИ............................................................................................................13

12.1.    Средства контроля погрешности методики выполнения измерений..............................................13

12.2.    Порядок проведения контроля сходимости.........................................................................................13

12.3.    Порядок проведения контроля воспроизводимости..........................................................................14

12.4.    Порядок проведения контроля точности..............................................................................................14

ПРИЛОЖЕНИЕ1..............................................................................................................................................17

ПРИЛОЖЕНИЕ 2..............................................................................................................................................18

ПРИЛОЖЕНИЕ 3..............................................................................................................................................19

ПРИЛОЖЕНИЕ 4..................................................................................................................................................20

2

8.6. Отбор проб, подготовка анализируемых образцов

Отбор проб для исследования проводят согласно НД, регламентирующей анализ показателей качества для соответствующего продукта.

Мясомолочные продукты (колбаса, сыр, мясо) берут в количестве 10 г с погрешностью ± 0,01 г и измельчают на миксере. На взвешенном бумажном фильтре взвешивают навеску пробы 1 ± 0,001 г и промывают 40 см³ смеси хлороформ : метанол в соотношении 2:1 для удаления жира. Затем подсушивают бумажный фильтр в сушильном шкафу при температуре 100 °С в течение 1 часа, и после остывания фильтра в эксикаторе взвешивают снова с погрешностью ± 0,001 г. Из высушенной пробы берут навеску 0,00130 г с погрешностью + 0,00005 г и помещают в виалу объемом 2 см³ для гидролиза белка.

Продукты хлебобулочные (хлеб, мука, зерно) и соевые продукты ( мука соевая, изолят и концентрат соевый) измельчают в кофемолке до пылевидного состояния, затем навески в количестве 0,00130 г с погрешностью + 0,00005 г отбирают в виалы объемом 2 см³ для гидролиза.

8.6.1. Кислотный гидролиз продуктов

Отобранные навески проб по п.8.6 заливают 1 см³ 6 М раствора соляной кислоты. Виалы помещают в гидролизный сосуд (см. рис.2, приложение 3), который продувается азотом для удаления следов кислорода. Затем с помощью вакуумного насоса откачивают азот при разрежении не выше 1,35 кПа в течение 5 минут и герметично закрывают гидролизный сосуд. Гидролиз проводят при температуре 110 °С в течение 24 часов. После гидролиза из пробирок удаляют соляную кислоту, её отдувают азотом при слабом подогревании пробирки на песчаной бане. Температура выпаривания не должна превышать 150 “С.

Далее по п. 8.7.

8.6.2. Щелочной гидролиз продуктов

Щелочной гидролиз проводят для последующего определения аминокислоты триптофан. Для этого из подготовленных по п.8.6 проб продуктов отбирают в виалу объемом 2см³ навеску 0,0100 г с погрешностью ±0,00005г, добавляют 0,2 г + 0,01 гидроокиси бария и заливают 1см³ бидистиллированной воды. Виалу помещают в гидролизный сосуд, который продувается азотом для удаления следов кислорода. Затем с помощью вакуумного насоса откачивают азот при разрежении не выше 1,35 кПа в течение 5 минут и герметично закрывают гидролизный сосуд. Щелочной гидролиз проводят при температуре 105 °С в течении 16 часов. После гидролиза содержимое из виалы переливают в пробирки объёмом 5 см³, тщательно обмывают виалу и доводят бидистиллированной водой объём до 5 см³. Для осаждения гидроокиси бария водный раствор продувают углекислым газом в течение 5 минут. Проверяют значение pH индикаторной бумагой, среда должна быть нейтральной. Если среда будет щелочной, пробу еще раз продувают углекислым газом в течение 5 минут и приступают к получению ДАБС-производной. Далее по п. 8.7.

8.7. Получение ДАБС производных аминокислот

В табл. 5 приводится схема разбавления сухого остатка пробы для разных видов продуктов после гидролиза с соляной кислотой и упаривания ее досуха.

Таблица 5 Схема разбавления сухого остатка пробы продуктов после кислотного гидролиза

Название продуктов Объем разбавления бидистиллированной водой, упаренного гидролизата, см3 Объем разбавленного гидролизата для получения ДАБС производных аминокислот, мкл Хлебобулочные 2 20 Соевые и мясомолочные 10 20

Из разбавленного гидролизата аминокислот отбирают микрошприцем 0,02 см³ раствора и переносят в микропробирку на 1см³. Этот раствор упаривают досуха, подогревая пробирку, и отдувают слабым потоком азота. После этого добаляют 0,02 см³ раствора NaHC0₃ и 0,04 см³ раствора ДАБС- реактива. Для получения производных пробирку помещают в водяную баню на 12 минут при температуре 70 °С ± 1°С.

II

После охлаждения пробирки до комнатной температуры в нее добавляют 0,44 см³ буфера для разбавления ДАБС - производных аминокислот. Общий объём пробы составляет 0,5 см³.

9. Выполнение измерений

Подготовленную пробу (объем 0,5 см³) вводят в прибор в количестве 0,02 см³. Анализ проводят при тех же условиях что и калибровку (см. п.8.5). Вычисление площади аминокислот в пробе проводится системой регистрации, обработки и хранения спектрометрической информации.

10. Обработка результатов измерений

Массовую концентрацию каждой аминокислоты в пробе хлебобулочных и соевых продуктов рассчитывают по формуле:

_ уу₃*х_; м * v

^iViprobe ^V 2

где:

С_г концентрация аминокислоты в пробе мг/100 г;

V! - объем растворителя в котором растворена проба после гидролиза, см³;(2 или 10) V₂ - объем растворителя, отборанного для получения ДАБС-производных, см³;(0,02)

V₃ — объем растворителя в котором растворены ДАБС-производные, см³;(0,5)

М_ргоье - навеска пробы г ;(0,0013)

X - концентрация аминокислоты, полученная по градуировочному графику, 10"^в мг/см³; 100 - коэффициент пересчета концентрации аминокислоты на 100 г продукта.

Массовую концентрацию каждой аминокислоты в пробе мясо-молочных продуктов рассчитывают по формуле:

V * V *Х* М

с ₌ у, v₃ a ivi₂noo

' bWV^M,

Сг концентрация аминокислоты в пробе мг/100 г;

Vi — объем растворителя в котором растворена проба после гидролиза, см³;( 10)

V₂~ объем растворителя, отборанного для получения ДАБС-производных, см³;(0,02)

V₃ - объем растворителя в котором растворены ДАБС-производные, см³;(0,5)

Мprobe - навеска обезжиренной пробы, взятой на гидролиз, г; (0,0013)

М] - навеска пробы до обезжиривания, г; (1,0)

М₂ - масса обезжиренной пробы, г;

X - концентрация аминокислоты, полученная по градуировочному графику, 10"⁶ мг/см³; 100 — коэффициент пересчета концентрации аминокислоты на 100 г продукта.

За результат анализа пробы принимают среднее арифметическое из концентраций каждой аминокислоты, найденное в двух параллельных пробах. Вычисление проводят до третьего знака с последующим округлением до второго знака после запятой. Допустимое расхождение между параллейными пробами не должно превышать значения сходимости приведенное в таблицах 10-12 методики. Гарантированный результат анализа представляют в следующем виде:

С,=С_ов.±Д„_ро,МВИ    где:    С_ор=^^-

А_Проб. МВИ — относительная суммарная погрешность методики ;

Сц — концентрация аминокислоты в первой пробе;

C₂i — концентрация аминокислоты во второй пробе;

С_ср - средняя концентрация аминокислоты, найденная по результатам анализов двух параллельных проб.

12

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют записью в журнале по форме, приведенной в табл. 6.

Таблица 6

Дата: Наименование объекта исследований: Название аминокислот МршЬе м, м2 V, Ъ v3 Ci Аспарагиновая Глютаминовая Серин Треонин Глицин Аланин Аргинин Пролин Валин Метионин Лейцин Изолейцин Фенилаланин Цистеин Лизин Гистидин Тирозин триптофан

где:

М_ргоЬе - навеска обезжиренной пробы, взятой на гидролиз, г;

Mj - навеска пробы до обезжиривания, г; (

М2 - масса обезжиренной пробы, г

V] - объем растворителя в котором растворена проба после гидролиза, см³;

V₂ — объем растворителя, отборанного для получения ДАБС-производных, см³;

V₃ — объем растворителя в котором растворены ДАБС-производные, см³;

Ci ■ массовая концентрация аминокислоты в пробе (мг/100 г продукта).

12,Контроль погрешности МВИ

Контроль погрешности МВИ осуществляется с целью оперативной информации о качестве измерений рабочих проб и для принятия оперативных мер, предупреждающих ухудшение точности результатов.

В процессе внутреннего оперативного контроля определяются показатели сходимости, воспроизводимости и точности.

12.1. Средства контроля погрешности методики выполнения измерений

В качестве средств контроля в процессе определения показателей качества результатов анализа применяются:

-рабочие пробы для определения показателей сходимости и воспроизводимости;

-рабочие пробы с добавкой при определении показателей точности.

Результаты контроля воспроизводимости и точности фиксируются в соответствии с установленной системой регистрации контроля правильности выполнения измерений, результаты контроля сходимости выполняются для каждого анализа и фиксируются в рабочих журналах исполнителей.

12.2. Порядок проведения контроля сходимости

Контроль сходимости результатов измерений проводится при получении каждого результата измерения, предусматривающего проведение параллельных определений. Контроль сходимости заключается

13

в сравнении фактической сходимости результатов параллельных определений, полученных при анализе рабочей пробы, с нормативом сходимости - d

Норматив сходимости d смотри в приложении 4, табл. 10-12 .

Сходимость результатов параллельных определений рассчитывается по формулам:

d *2

d, (отн)% =- •    100

d_k оти -Относительная фактическая сходимость dt —фактическая сходимость параллельных определений;

Х_1пшх -максимальный результат из параллельных измерений;

Х_1№т -минимальный результат из параллельных измерений;

Бели d_komH>d, то сходимость результатов параллельных определений признается неудовлетворительной и анализ повторяется.

12.3. Порядок проведения контроля воспроизводимости

Контроль воспроизводимости результатов измерений проводится не реже 2-3 раз в месяц с использованием рабочих проб. Контроль воспроизводимости обязателен при смене партии реактивов, посуды, после ремонта оборудования, существенных изменений условий выполнения измерений.

Контроль воспроизводимости проводится путем сравнения результата контрольной процедуры D_h равного расхождению двух результатов измерений - первичного и повторного - содержания аминокислот в одной и той же рабочей пробе с нормативом воспроизводимости D. (приложение 4, табл. 10-12 )

Первичный и повторный результат измерений должен быть получен в разных условиях, например, двумя операторами в один день или одним оператором в два последующих дня и т.д.

D_k рассчитывается по формулам:

D_k=Xi-X2,    D_komn.%    =    —^к    — *100    где

*    (Х1+Х2)

DyOmn.-относительное значение параметра воспроизводимости;

X1 - первичный результат измерения рабочей пробы;

Хг - повторный результат измерения рабочей пробы.

Величины XI и Xi должны быть получены с соблюдением условий сходимости.

Норматив воспроизводимости D приведен в приложение 4, табл 10-12.

Бели D_komu. < D, то воспроизводимость контрольных измерений признается

удовлетворительной. В этом случае воспроизводимость результатов измерений рабочих проб, полученных в условиях, соответствующих требованиям МВИ, признается удовлетворительной.

В случае превышения норматива воспроизводимости, когда £>_котн. >D, контроль повторяют. При повторном превышении указанного норматива должны быть выяснены и устранены причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля воспроизводимости.

12.4. Порядок проведения контроля точности

Контроль точности результатов измерений осуществляется с использованием метода добавок. Образцами для контроля точности являются рабочие пробы и эти же пробы с добавкой градуировочной смеси аминокислот. К пробе с добавкой предъявляются следующие требования:

-добавка должна вводиться в пробу на самой ранней стадии измерений в целях проведения пробы с добавкой через все последующие стадии пробоподготовки и анализа;

Примечание: в целях уменьшения погрешности за счет неоднородности распределения вводимой добавки целесообразно рассчитанное количество добавки вносить непосредственно в подготовленную навеску пробы;

-количество вводимой добавки должно составлять 50-150% от установленного содержания аминокислот в пробе;

-проба с введенной добавкой не должна выходить за верхнюю границу определяемых концентраций аминокислот согласно МВИ.

В качестве добавки используется градуировочная смесь аминокислот с концентрацией 25*10'³

мг /см³ .

Для получения Проб с добавкой :

5*10'³ мг /1,3 мг-берется 0,2 см³ раствора с концентрацией 25» 10'³ мг /см³;

2,5*10'³ мг /1,3 мг - берется ОД см³ раствора с концентрацией 25*10'³ мг /см³;

1,25*10"³ мг/1,3 мг - берется 0,05 см³ раствора с концентрацией 25*10'³ мг /см³.

Для соевого изолята и всех хлебобулочных изделий применяется добавка 5*10'³ мг/1,3 мг, для соевого концентрата и соевой муки добавка в 2,5*10"³ мг/1,3 мг , для мясомолочных продуктов добавка в 1,25*10'³ мг/1,3мг.

Для определения точности анализа триптофана к навеске хлебобулочных продуктов 0,01 г±0,0001 г, а также к навеске колбасы вносится добавка градуировочной смеси триптофана из расчета 10*10'³ мг/10 мг, для мяса 20*10'³ мг/10 мг. Для сыра и всех соевых продуктов вносится добавка из расчета 70*10‘³ мг/10 мг. Эту добавку вносят из специально приготовленного раствора триптофана с концентрацией 100*10'³ мг /см³. Для получения проб с добавкой триптофана:

10*10"³ мг в пробу вносится 0,1 см³ раствора триптофана с концентрацией 100 мкг/см³ ;

20*10'³ мг вносится 0,2 см³ раствора;

70* 10'³ мг вносится 0,7 см³ раствора триптофана с концентрацией 100 *10'³ мг/см³.

После внесения добавки проба высушивается в токе инертного газа до удаления следов воды, а затем анализируется в соответствии с МВИ.

Контроль точности проводится по результатам измерений пробы до введения добавки (Х_пр) и после введения добавки смеси аминокислот (Х„_р__доб) концентрацией С_йп6 в исходную пробу. Разница (KJ между найденной (X_doS =Х_прдо5гХ_пр) и введенной С_дав концентрацией добавки не должна превышать по абсолютной величине значения норматива точности К.

Значения К_к и К рассчитываются по формулам:

К_я—\Х_Пр оо5 ~Х_пр ^-Сдао.|з    где

К_к - рассчитанный параметр точности;

Х_прдоб -содержание аминокислоты в пробе с добавкой;

Х„_р -содержание аминокислоты в исходной пробе;

С_д„в. -концентрация введенной добавки аминокислоты.

IX1,41Л — для доверительной вероятности Р=0,95;

К=\, 19Д -для доверительной вероятности Е=0,90, где Д - погрешность МВИ.

В том случае, когда погрешности определения аминокислоты в исходной пробе и пробе с добавкой различаются более чем на 30%, для расчета норматива точности используется следующая формула:

К — 0,84^ (АХ _пр )² + (АХ _{пр дпб})² - для доверительной вероятности Р=0,90;

)² + (АХ _{пр доб} )² - для доверительной вероятности Р=0,95,

где

К -норматив точности;

АХ_пр —погрешность определения содержания аминокислоты в исходной пробе;

АХ_пр дав. “Погрешность определения содержания аминокислоты в пробе с добавкой.

Если для расчета используются относительные значения погрешностей А_пт„, АХ„_{Р апт}, АХ„_Р ит„, то относительное значение К_кпт„ рассчитывается по формуле:

г,    „

от,, ь_йя(!

где

К_к -абсолютное значение К_к,

C,_;uq -значение добавки введенной в исходную пробу.

Точность контрольных измерений, а также точность результатов измерений рабочих проб,

выполненных в условиях соблюдения требований МВИ, признается удовлетворительной, если | < К .

Если \K_t'>K, то точность контрольных измерений признается неудовлетворительной и процедура контроля повторяется с использованием другой рабочей пробы. При повторном получении неудовлетворительных результатов контроля точности, выясняют и устраняют причины, приводящие к неудовлетворительному контролю:

15

Метод разработан в Республиканском научно-практическом центре по экспертной оценке качества и безопасности продуктов питания Министерства Здравоохранения РБ.

Разработчики:

Замдиректора по научной работе, д.м.н.

Зав.лаборатории физико-химических исследований, к.х.н. Ст.н.с. лаборатории физико -химических исследований

16

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. (информационное)

Перечень используемой документации

«Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.»

«Машины, приборы и другие технические изделия.

Исполнение для различных климатических районов. Категории, условия эксплуатации, хранения и транспортирования в части воздействия климатических факторов внешней среды. »

«Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия.»

«Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие требования.»

«Посуда и оборудование лабораторные стеклянные.»

«Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия.

«Калий марганцевокислый. Технические условия.

Плитка электрическая ЭИЧ 1-1,2/220. Общие технические условия.

Набор ареометров АОН-1. Общие технические условия.

Спирт метиловый. Общие технические условия.

«Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия.»

«Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения.»

Иономер лабораторный типа И-130.

Электроды стеклянные лабораторные ЭСЛ-43-07 Азот повышенной чистоты . Общие технические условия.

Силиконовые шланги, d 4 мм Хлороформ. Общие технические условия.

Сульфат натрия безводный. Общие технические условия.

Кислота соляная. Общие технические условия

Бикарбонат натрия NaHC0₃

Натрий гидроокись. Общие технические условия

17

ПРИЛОЖЕНИЕ 4.

Таблица 7 Значения точностных параметров методики для хлебобулочных изделий

Название аминокислот Случайная составляющая погрешности результата определений Sym% Доверительный интервал случайной составляющей погрешности измерений при п=5 Р=0,95, % Систематическая составляющая погрешности измерений, ©, % Относительная погрешность, Д МВИ, % Погрешность градуировочного графика Агр % Доверительные границы случайной составляющей погрешности градуировочного графика Еу, % Аспарагиновая 0,91 2,53 23,49 23,49 18,02 7,17 Глютаминовая 0,42 1,17 22,92 22,92 17,40 7,81 Серин 1,02 2,84 23,16 23,16 17,67 8,45 Треонин 1,25 3,78 22,55 22,55 17,00 6,87 Глицин 1,02 2,84 22,31 22,31 16,74 6,33 Аланин 0,81 2,25 22,63 22,63 17,09 7,17 Аргинин 0,83 2,31 22,76 22,76 17,23 7,45 Пролин 0,75 2,08 22,12 22,12 16,53 5,81 Валин 1,03 2,86 22,14 22,14 16,55 5,89 Метионин 5,99 16,65 26,68 26,68 16,33 5,14 Лейцин 0,78 2,17 20,36 20,36 14,54 4,78 Изолейцин 0,70 1,95 22,29 22,29 16,72 6,28 Фенилаланин 0,75 2,09 21,98 21,98 16,37 5,28 Цистеин 2,76 7,67 23,01 23,01 16,55 5,92 Лизин 0,94 2,61 22,12 22,12 16,53 5,75 Гистидин 2,29 6,37 22,09 22,09 16,49 5,56 Тирозин 1,50 4,16 20,33 20,33 14,90 4,25

20

1. Назначение и область применения

Метод предназначен для определения концентрации 18 аминокислот в продуктах питания с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением компьютерной системы регистрации, обработки и хранения информации

Краткая характеристика аминокислот.

L-Аланин CH₃CHNH₂COOH. Молекулярный вес-89,09. Из воды кристаллизуется в виде ромбовидных кристаллов. Растворимость в воде: 16,65 г на 100 г воды при 25 °С и 28,75 г при 75 °С, не растворим в эфире, уксусной кислоте. Температура плавления 297 °С с разложением. Без вкуса.

L-Аргинин C₆H₁₄0₂N₄ . Молекулярный вес-174,21.Из воды кристаллизуется в виде призм, из спирта в виде пластинок. Растворимость в воде: 15 г на 100 г воды при 21 °С, не растворим в спирте, эфире. Температура плавления 233 °С с потемнением. 238 °С с разложением. Без вкуса.

L-Аспарагиновая кислота C4H7O4N. Молекулярный вес-133,1. Из воды кристаллизуется, как окрашенные кристаллы в виде ромбовидных листочков. Растворимость в воде: 0,5 г на 100 г при 25 °С и 2,875 г при температуре 75 °С, растворимость в 100 г спирта - 0,000016 г при 25 °С. Температура плавления 269 °С с разложением. Слегка горький вкус.

L-Валин C_sHi.O2N. Молекулярный вес-117,15. Кристаллизуется из разбавленного спирта в виде листочков. Растворимость в воде: 8.85 г на 100 г воды при 25 °С и 10,24 г при 65 °С, слабо растворим в спирте, не растворим в эфире. Температура плавления 315 °С с разложением. Без вкуса.

L-Гисгидин С^Но0₇№ . Молекулярный вес-155,16, Кристаллизуется из разбавленного спирта и воды в виде листочков. Растворимость в воде: 4,16 г на 100 г воды при 25 °С, слабо растворим в спирте, не растворим в эфире. Температура плавления 287 °С с разложением. Слегка горький вкус.

L-Глицин С->НлОмТТ . Молекулярный вес-75,07. Белые моноклинные кристаллы. Растворимость в воде: 24,99 г на 100 г воды при 25 °С и 54,39 г при 75 °С, растворимость в 100 г 90% спирта составляет 0,043 г на 100 г спирта. Температура плавления 292 °С с разложением. Без вкуса.

L-Глютаминовая кислота C-PLCTN. Молекулярный вес-147,15. Белые иглоподобные кристаллы Растворимость в воде: 0,864 г на 100 г воды при 25 °С и 5,53 г при 75 °С, растворимость в 100 г 75% спирта составляет 0,00027 г. Температура плавления 249 °С с разложением. Мясной вкус.

L-Изолейцин С^Н_;3Q₇N .1 Молекулярный вес-31,17, кристаллизуется из спирта в виде листочков и пластинок. Растворимость в воде: 4,12 г на 100 i воды при 25 °С, растворим в горячей уксусной кислоте, не растворим в эфире. Температура плавления 285 °С с разложением и 6,08 г при 75 °С. Горький вкус.

L-Лейцин CLHnCLN. Молекулярный вес-131,17. Из воды кристаллизуется в виде окрашенных листочков. Растворимость в воде: 2,19 г на 100 г воды при 25 °С и 3,82 г при 75 °С, растворим в ледяной уксусной кислоте 10,9 г, не растворим в эфире Температура плавления 337 °С с разложением в закрытой трубке. Горьковатый вкус,

L-Лизин СдНмСЬЖ . Молекулярный вес -146,19. Из воды и разбавленного спирта кристаллизуется в виде игл и шестиугольных пластинок. Растворимость в воде:5,54 г на 100 г воды при температуре 25 “Си 15,31 г при температуре 75 °С, не растворим в эфире. Температура плавления 224 °С с разложением. Без вкуса.

L-Метионин С Л L .CANS. Молекулярный вес -149,21. Кристаллы в виде шестиугольных пластинок. Растворимость в воде: 3,5 г на 100 г воды при 25 °С, нерастворим в спирте, эфире. Температура плавления 283 °С с разложением, при температуре 278 °С темнеет. Пресный вкус.

L-Пролин СЛЛСЫТ Молекулярный вес -115,13. Из спирта кристаллизуется в виде игл, из воды - в виде призм. Растворимость в воде: 162,3 г на 100 г воды при 25 °С и 293,08 г при 65 °С, растворим в спирте 1,18 г при 21 °С, нерастворим в эфире, пропаноле, бутаноле. Температура плавления 222 °С с разложением. Без вкуса.

L-Серин CiLLCLN . Молекулярный вес-105,09. Кристаллы в виде шестиугольных пластинок или призм. Растворимость в воде:    25    г    на    100    г    воды    при    20    °С. Температура плавления 223-228 °С с разложением.

Слегка сладкий вкус.

L-Тирозин CoHnOiN. Молекулярный вес -181,199. Шелковистые игяоподобные кристаллы. Растворимость в воде:    0,045    г    на    100    г    воды    при    25 °С и 0,244 г при 75 °С. Растворим в щелочах, не

растворим в эфире, ацетоне. Температура плавления 242-244 °С с разложением. Горьковатый вкус.

L-Треопин СШдО-ТГ Молекулярный вес -119,12. Белые кристаллы. Растворимость в воде: 20,5 г на 100 г воды при 25 °С, не растворим в эфире, спирте. Температура плавления 235 °С при 253 °С разлагается. Слегка сладкий вкус.

L-Триптофан CnHnCLN-, . Молекулярный вес - 204,22. Из разбавленного спирта кристаллизуется в виде пластинок и листочков Растворимость в воде: 1,14 г на 100 г воды при 25 °С и 2,80 г при 75 °С, растворим в горячем пиридине, разбавленных щелочах, слабо растворим в спирте, не растворим в эфире, хлороформе. Температура плавления 281-282 °С. Пресный вкус.

L-Фенилаланин CoHnQ-iN М=165,19. Из воды кристаллизуется в виде листочков. Растворимость в воде:2,96 г на 100 г воды при 25 °С, нерастворим в спирте, в эфире. Температура плавления 283-284 °С с разложением. Слегка горький вкус.

Таблица 8 Значения точностных параметров методики для мясомолочных изделий

Название аминокислот Случайная составляющая погрешности результата определений Sym % Доверительный интервал случайной составляющей погрешности измерений при п=2 Р=0,95, % Систематическая составляющая погрешности измерений ,©,% Относительная погрешность, Д МВИ,% Аспарагиновая 0,81 2,25 23,49 23,49 Глютаминовая 0,80 2,22 22,92 22,92 Серин 0,94 2,61 23,16 23,16 Треонин 0,83 2,31 22,55 22,55 Г лицин 0,83 2,31 22,31 22,31 Аланин 1,12 3,11 22,63 22,63 Аргинин 0,83 2,31 22,76 22,76 Пролин 1,06 2,95 22,12 22,12 Валин 0,96 2,67 22,14 22,14 Метионин 1,19 3,31 21,94 21,94 Лейцин 0,86 2,39 20,36 20,36 Изолейцин 0,94 2,61 22,29 22,29 Фенилаланин 1,15 3,20 21,98 21,98 Цистеин 2,64 7,34 22,14 22,14 Лизин 0,73 2,03 22,12 22,12 Г истидин 1,12 3,11 22,09 22,09 Тирозин 1,05 2,92 22,10 22,10 Триптофан 1,86 5,18 20,33 20,33

Таблица 9 Значения точностных параметров методики для продуктов _переработки    сои_

Название Случайная Доверительный интервал Систематическая Относительная аминокислот составляющая случайной составляющей составляющая погрешность, Л погрешности погрешности измерений погрешности МВИ, % результата определений Syn ,% при п=2 Р=0,95, % измерений, ®, % Аспарагиновая 0,38 1,06 23,56 23,56 Глютаминовая 0,31 0,86 22,99 22,99 Серин 0,60 1,67 23,24 23,24 Треонин 0,66 1,83 22,63 22,63 Глицин 0,96 2,67 22,39 22,39 Аланин 0,66 1,83 22,71 22,71 Аргинин 0,59 1,64 22,84 22,84 Пролин 0,73 2,03 22,20 22,20 Валин 0,68 1,89 22,22 22,22 Метионин 0,66 1,83 22,02 22,02 Лейцин 0,92 2,56 20,45 20,45 Изолейцин 0,68 1,89 22,38 22,38 Фенилаланин 0,64 1,78 22,06 22,06 Цистеин 1,09 3,03 22,22 22,22 Лизин 0,63 1,75 22,20 22,20 Г истидин 0,78 2,17 22,17 22,17 Тирозин 0,86 2,39 22,19 22,19 Триптофан 1,47 4,09 20,33 20,33

21

L-Пистеин CiHiCbNS M=121,15. Кристаллический порошок. Хорошо растворим в воде и спирте, не растворим в этиловом эфире. Трудно определим из-за окисления в цистин. Без вкуса.

2. Нормы погрешности измерений

Метод выполнения измерений обеспечивает определение содержания аминокислот в диапазоне от 10 мг/100 г продукта до 20000 мг/100 г продукта в ниже перечисленных продуктах, в которых содержание белка колеблется от 6 до 95 %.

Хлебобулочные изделия - мука, хлеб, зерно (содержание белка 8-15 %);

Мясомолочные изделия - мясо, сыр, колбасы - (10 - 50 %);

Соевые изделия - соевая мука (обезжиренная), изолят, концентрат - (26 —95%).

Обязательным условием метода является предварительное определение концентрации белка в продукте ( метод Кьельдаля или с привлечением справочных данных). После проведения гидролиза рассчитывают объем воды в котором необходимо растворить гидролизат, чтобы концентрация белка находилась в диапазоне от 30-100*10"³ мг/мл. Из полученного объёма отбирают 0.02 см³ и получают ДАБС-производные аминокислот. Данный метод позволяет определить содержание аминокислот в продуктах с погрешностями, не превышающими значений, приведенных в табл. 1.

Таблица 1 Метрологические показатели метода определения аминокислот с помощью ВЭЖХ

Аминокислота Границы доверительного интервала случайной составляющей погрешности МВИ, Дхпр.,% п=2 Относительная суммарная погрешность Д.МВИ, % Хлебобу лочные Мясомолочные изделия Соевые изделия Хлебобулочные изделия Мясомолочные изделия Соевые изделия Аспарагиновая 2,53 2,25 1,06 23,49 23,49 23,56 Глютаминовая 1,17 2,22 0,86 22,92 22,92 22,99 Серин 2,84 2,61 1,67 23,16 23,16 23,24 Треонин 3,78 2,31 1,83 22,55 22,55 22,63 Глинин 2,84 2,31 2,67 22,31 22,31 22,39 Аланин 2,25 3,11 1.83 22,63 22,63 22,71 Аргинин 2,31 2,31 1,64 22,76 22,76 22,84 Пролин 2,08 2,95 2.03 22,12 22,12 22,20 Валин 2,86 2,67 1,89 22,14 22,14 22,22 Метионин 16,65 3,31 2,86 26,68 21,94 22,02 Лейцин 2,17 2,39 2,56 20,36 20.36 20,45 Изолейцин 1,95 2,61 1,89 22,29 22,29 22,38 Фенилаланин 2,09 3,20 1,78 21,98 21,98 22,06 Цистеин 7,67 7,34 3,03 23,01 22,14 22,22 Лизин 2,61 2,17 1,75 22,12 22,12 22,20 Г истидин 6,37 3,11 2,17 22,09 22,09 22,17 Тирозин 2,58 2,92 2,39 22,10 22,10 22,19 Триптофан 4,16 5,18 4,09 20,33 20,33 20,33

Нижний предел измерения составляет 2*Ю"7 мг аминокислоты в анализируемом объеме пробы (0,02 см3). Линейный диапазон определения всех аминокислот составляет от 25» 10"1 до 400» 10'1 мг/100г продукта.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений должны быть применены следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы:

3.1. Средства измерений:

Хроматограф жидкостной, снабженный

градиентной системой насосов и спектрофотометрическим детектором

Пипетка вместимостью 0,2-1,0 см³    BioHit    погрешность измерения объема

составаляет 0,5%, согласно техническому паспорту на пипетку

Цилиндры мерные 2-100 и    2-50    ГОСТ 1770-74

Колба круглодонная на 2 литра К-1-2000-29/32    ГОСТ 25336-82

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 2 - 5- ОД    ГОСТ 1770-74Е

2-10-0,1    ГОСТ 1770-74Е

Пипетка    2-2-25    ГОСТ 29169-91

Пипетка    2-2-10    ГОСТ 29169-91

Виала объемом 2 мл № 5182-0544 по каталогу 1976/1997г, фирмы «HEWLETT PACKARD »

3.2. Вспомогательные устройства:

Колонка хроматографическая длиной 250 мм, диаметр 4 мм с фазой ODS (Cis) или фазой IP Шкаф сушильный ШС-80    ТУ 64-1909-74

Баня песчаная

Плитка электрическая ЭИЧ    1-1,2/220    ГОСТ 1493-83

Мономер И-130    ТУ 25-0511.044-84

Измельчитель тканей РТ-2    (Одесский экспериментальный завод)

Ступка фарфоровая N 4,5    ГОСТ 9147-73

Гидролизный сосуд № по катологу-240043 фирмы «BECKMAN» 1988/1989 г.

Фильтры с синей полосой

Шпатель двойной Набор ареометров АОН-1 Набор индикаторной бумаги

3.3. Материалы:

Углекислый газ

Азот    осч

Силиконовые шланги, d 4 мм 3.4. Реактивы.

Вода дистиллированная Перманганат калия    хч

Спирт метиловый    чда

Ацетонитрил для ВЭЖХ Бария гидроокись    чда

Фосфат натрия Na₂HPCX(    GR

Спирт этиловый    чда

Хлороформ    хч

Диметилформамид для ВЭЖХ Сульфат натрия безводный    чда

Бикарбонат натрия NaHC0₃    чда

Кислота соляная    осч

Кислота лимонная безводная    GR

Натрий гидроокись    хч

фирма «Sigma»

GR-обозначение чистоты реактивов. В переводе, как реактив высокой гарантированной чистоты с содержанием основного вещества не менее 99%.

5

Фенилаланин GR фирма «Sigma» 99 % содержание основного вещества Цистеин GR фирма «Sigma» 99 % содержание основного вещества Лизин GR фирма «Sigma» 99 % содержание основного вещества Г истидин GR фирма «Sigma» 99 % содержание основного вещества Тирозин GR фирма «Sigma» 99 % содержание основного вещества Триптофан GR фирма «Sigma» 99 % содержание основного вещества

Могут быть использованы другие средства измерения и вспомогательные устройства по точности не уступающие рекомендуемым в методике, а также и реактивы, кроме ацетонитрила, диметилформамида, кислоты соляной, натрия гидроокиси и ДАБС - реактива.

4. Метод измерения

Метод определение содержания аминокислот в мясных и молочных продуктах основан на первоначальном удалениии липидов и жироподобных веществ путем экстракции их смесью органических растворителей, кислотном гидролизе белков, получении ДАБС—производных аминокислот и их хроматографировании.

В хлебобулочных изделиях и соевых продуктах - гидролиз белков, получение ДАБС-производных аминокислот и их разделение с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разделение аминокислот происходит в хроматографической колонке длиной 250 мм, диаметром 4,6 мм с фазой ODS (Си) или фазой IP. Для измерения концентрации аминокислот применяется спектрофотометрический детектор с работой в видимой области на длине волны 436 нм.

5.    Требования безопасности

При проведении измерений по данной методике должны выполняться требования следующих документов:

«Основные правила безопасной работы в химических лабораториях » М.: Химия, -1979 г.

Инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа,

Правила техники безопасности при эксплуатации электроустановок, Изд.-2Е, перераб. и доп., М. энергоатоммиздат, 1986, 144 с.

Правила техники безопасности при работе с сосудами под давлением.

6.    Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений могут быть допущены лица, имеющие высшее или среднее специальное образование, изучившие требования безопасности и настоящую методику и прошедшие подготовку для работы в качестве оператора жидкостного хроматографа.

7. Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории согласно ГОСТ 26703-87 должны быть соблюдены следующие условия:

20 ±5 ^иС

84,0-106,7 кПа (630-800 мм рт, ст.) 80 % при температуре 20 °С 220 ± 22 В 50 +1 Гц

8. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, получение бидистиллированной воды, приготовление рабочих буферов, реактивов и градуировочных растворов, установление градуировочной характеристики, отбор проб, подготовка к анализу и контроль погрешности измерений.

8.1. Подготовка измерительной аппаратуры

6

Включают хроматограф согласно инструкции по эксплуатации. Устанавливают рабочие режимы для детектора и насоса. Прокачивают через колонку смесь буферов в течение 0,5 часа до выхода прибора на режим и стабилизации процессов в колонке. Включают систему регистрации сигналов согласно инструкции по эксплуатации.

8.2. Получение бидистиллированной воды

Собирают обычную установку для дистилляции воды, состоящую из кругло донной колбы (объем 2 литра), водяного холодильника н приемной колбы. В кругло донную колбу наливают 1,5 литра дистиллированной воды, добавляют 10 г КМп0₄ и центры кипения. Нагревание воды производят на электрической плитке с закрытой спиралью. Полученную бидистиллированную воду хранят в полиэтиленовых бутылях.

8.2.1.Приготовление буферных растворов и реактивов

Приготовление 1М раствора лимонной кислоты. Взвешивают в химическом стакане объемом 50 см³ 19,2±0,001 г безводной лимонной кислоты. После растворения навески в бидистилированной воде, раствор количественно переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят объем до метки. Раствор хранят в плотно закрытой стеклянной таре. Он стабилен в течение 6 месяцев при комнатной температуре.

Приготовление ЗМ раствора NaOH. Взвешивают в химическом стакане объемом 50 см³ 12,0+0,001 г гидроокиси натрия, растворяют в небольшом количестве воды. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят объем до метки. Раствор хранят в плотно закрытой полиэтиленовой таре. Он стабилен в течение 6 месяцев при комнатной температуре.

Приготовление буфера А. В колбу на 250 см³ приливают цилиндром на 50 см³ 12 см³ 1М раствора лимонной кислоты, затем добавляют 90 см³ бидистиллированной воды (цилиндр на 100 см³) и 10 cm^j ЗМ раствора NaOH (цилиндр на 50 см³). В полученный раствор помещают электрод иономера И-130 в режиме определения pH и титруют раствором ЗМ NaOH до pH 6,5 ± 0,05.

Буфер А готовят в стакане объемом 1 литр, в который отмеряют 100 см³ титрованного раствора лимонной кислоты с pH 6,5 и приливают 860 см³ бидистиллированной воды и 40 см³ ДМФ (диметилформамида), хорошо перемешивают. Проверяют значение pH полученного буфера и при необходимости корректируют до pH 6,5± 0,05, контроль за pH ведут при помощи иономера. После приготовления буфер переливают в стеклянный бутыль жидкостного хроматографа. Буфер А пригоден для работы в течение 7 дней.

Приготовление буфера Б. Буфер Б готовят в 1 литровой стеклянной бутыли, поставляемой в комплекте с жидкостным хроматографом. Цилиндром отмеряют 300 см³ буфера А, добавляют 672 см" ацетонитрила и 28 см³ ДМФ. Хорошо перемешивают. Раствор при приготовлении охлаждается, поэтому перед работой ему дают постоять 2 часа для достижения комнатной температуры (20- 25° С). Буфер Б пригоден для работы в течение 7 дней.

Приготовление 0,45% раствора NaHC0₃. На аналитических весах взвешивают мерную колбу объемом 100 см³. Затем в ней взвешивают 0,45 г кислого углекислого натрия с точностью ±0,0005 г, в колбу приливают бидистиллированной воды и перемешивают до полного растворения соли. Затем объем доводят водой до метки на колбе.

Приготовление 6М соляной кислоты. Концентрированную соляную кислоту наливают в цилиндр на 100 см³ и замеряют ареометром плотность. По справочной таблице находят процентную концентрацию кислоты.

21.87*100

Определяют массу соляной кислоты для получения 100 г 6М раствора ТП —- ,    где

с

ш - масса концентрированной соляной кислоты, необходимая для приготовления 100 см³ 6 М

раствора, г;

с - процентная концентрация НС1, найденная по таблице;

21,87 — масса НС1 в 100 см³ 6 М соляной кислоты, г.

Затем определяют объем соляной кислоты:

Р

V — объём концентрированной соляной кислоты, необходимый для приготовления 100 см³ 6 М раствора НС1, см³;

р - найденная плотность концентрированной соляной кислоты, г/см³.

7

Отмеряют рассчитанный объем соляной кислоты, переливают в мерную колбу на 100 см³ и доливают бидистиллированной водой до метки.

Приготовление буфера для разбавления ДАБС-производных аминокислот.

В мерной колбе на 100 см³ взвешивают 0,4 ±0,01 г фосфата натрия, растворяют в бидистиллированной воде объемом 50 см³ и доводят этиловым спиртом до метки. Раствор хранят в плотно закрытой стеклянной таре при комнатной температуре. При этих условиях он стабилен в течение года.

Приготовление раствора ДАБС - реактива. На аналитических весах взвешивают стеклянный стакан на 50 см³. Затем в нём взвешивают навеску динетиламиноазобензосудьфонилхлорида (ДАБС -реактив) 0,1 +0,001 г. В стакан с реактивом приливают 50 см³ ацетонитрила и хорошо перемешивают до полного растворения кристаллов соли диметиламиноазобензосульфонилхлорнда, затем переливают раствор в мерную колбу на 100 см³. Стакан несколько раз ополаскивают ацетонитрилом, который сливают в мерную колбу и раствор доводят до метки. Раствор следует хранить в холодильнике в плотно закрытой колбе. Раствор стабилен в течение 6 месяцев.

8.3. Приготовление градуировочных растворов

8.3.1. Приготовление градуировочных растворов смеси 17 аминокислот без

триптофана

Раствор А. Перед началом работы подготавливают смесь градуировочных растворов аминокислот с концентрацией 25*10"³ мг/см³ каждой. Для этого на аналитических весах взвешивают на часовых стеклах по 25 мг каждой аминокислоты с точностью ±0,05 мг. Затем их количественно переносят в мерную колбу на 1000 см³. В мерную колбу с аминокислотами приливают бидистиллированную воду и встряхивают до полного растворения аминокислот затем доводят до метки. Этот градуировочный раствор аминокислот стабилен при хранении в условиях от 0 до 5 °С в течение шести месяцев.

Раствор Б. Раствор смеси аминокислот с концентрацией 2,5* 10'³ мг/см³ каждой аминокислоты готовят из градуировочной смеси аминокислот (р-р А) с концентрацией 25*10'³ мг/см³. Для этого в мерную колбу на 100 см³ вносят гашеткой 10 см³ раствора аминокислот с концентрацией 25*10'³ мг/см³ (р-р А) и доводят бидистиллированной водой до метки.

Раствор В. Раствор смеси аминокислот с концентрацией 1,25*10'³ мг/см³ каждой аминокислоты готовят из градуировочной смеси аминокислот (р-р А) с концентрацией 25*10'³ мг/см³ . Для этого в мерную колбу на 200 см³ пипеткой отбирают 10 см³ раствора аминокислот с концентрацией 25*10‘³ мг/см³ (р-р А) и доводят бидистиллированной водой до метки.

Раствор Г. Раствор смеси аминокислот с концентрацией 0,625* 10‘³ мг/см³ каждой аминокислоты готовят из градуировочной смеси аминокислот (р-р А) с концентрацией 25 *10'³ мг/см³. Для этого в мерную колбу на 1000 см³ пипеткой вносят 25 см³ раствора аминокислот с концентрацией 25*10'³ мг/см³ и доводят бидистиллированной водой до метки.

8.3.2. Приготовление градуировочных растворов триптофана

Подготавливают градуировочный раствор триптофана с концентрацией 10 • I О"³ мг/см³ (р-р А_т). Для этого на аналитических весах взвешивают на часовом стекле 10 мг аминокислоты с точностью ±0,05 мг и количественно переносят в мерную колбу на 1000 см³. В мерную колбу с аминокислотой триптофан приливают бидистиллированную воду и встряхивают до полного растворения аминокислоты, затем объем доводят до метки. Этот градуировочный раствор триптофана стабилен при хранении в условиях от 0 до 5° С в течение шести месяцев. Раствор триптофана с концентрацией 2,5*10'³ мг/см³ (р-р Б_т) готовят из градуировочного раствора с концентрацией 10*10'³ мг/см³ (р-р Ат). Для этого в мерную колбу на 1000 см³ вносят 250 см³ раствора триптофана с концентрацией 10*10‘³ мг/см³ (р-р А _т) и доводят до метки бидистиллированной водой.

Раствор триптофана с концентрацией 1,25*10'³ мг/см³ (р-р В_т) готовят из градуировочного раствора с концентрацией 10*10'³ мг/см³ (р-р А_т). Для этого в мерную колбу на 1000 см³ вносят 125 см³ раствора триптофана с концентрацией 10*10"^э мг/см³ (р-р А) и доводят бидистиллированной водой до метки.

Для приготовления градуировочных растворов триптофана с концентрациями: 50; 100; 150; 200; 250; ,300*10'⁶ мг/см³ микрошприцом отбирают аликвотные объемы градуировочных растворов с концентрацией 1,25*10‘³ мг/см³ и 2,5*10‘³ мг/см³ по схеме, представленной на следующей странице в в табл.

8

2. Аликвотные объемы вносят в микропробирки объёмом 1 см³, из которых растворитель удаляют досуха, выдувая азотом и подогревая пробирку.

Затем пробирку закрывают силиконовой пробкой и хранят в морозильной камере при температуре - 18 °С, аминокислоты стабильны в этих условиях в течение года.

Таблица 2 Схема приготовления градуировочных растворов триптофана для построения градуировочной зависимости

Тип смеси Концентрация взятой смеси, 10'3 мг/см3 Отбираемый объём смеси, см3 Упариван не досуха i Объем градуировочного раствора ДАБС-производной триптофана, см3 Полученная концентрация 10-6 мг/см3. Вводимое в колонку количество ДАБС-произВОДНОЙ аминокислоты, 10 п мг 1 2 3 4 5 6 7 вт 1,25 0,02 + 0,5 50,0 1.0 вт 1,25 0,04 + 0,5 100,0 2.0 в. 2,5 0,03 + 0,5 150,0 3.0 Бт 2,5 0,04 + 0,5 200,0 4.0 Бт 2,5 0,05 0,5 250.0 5.0 Бг 2,5 0,06 + 0,5 300.0 6.0

Перед проведением градуировки, предварительно получают ДАБС -производные аминокислоты

см.п.8.4.

Приготовление градуировочного раствора триптофана с концентрацией 0,1 мг/см³, необходимого для проведения работ по оценке критерия точности методики, проводят следующим образом:

на аналитических весах взвешивают навеску 10 мг с точностью 0,1 мг и переносят в мерную колбу на 100 см³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят до метки.

8.4. Подготовка к анализу градуировочных растворов аминокислот

Для построения градуировочного графика используются растворы 17 аминокислот с концентрациями: 25; 50; 100; 200; 300 и 400 »10‘⁶ мг/см³. Для их приготовления микрошприцом отбирают аликвотные объемы (растворов Б, В, Г) с концентрацией 1,25»1(Г³ мг/см³,2,5•! О'³ мг/см³ и 0,625» 10"³ мг/см³ по схеме, представленной в табл. 4 и вносят в микропробирку объёмом 1 см³. Затем растворитель удаляют досуха, выдувая слабым потоком азота при подогревании пробирки на песчаной бане при температуре не выше 150 “С. Выдувание растворителя проводят при появлении конденсата на стенках пробирки. После удаления растворителя пробирку закрывают силиконовой пробкой и хранят в морозильной камере при температуре —18 °С. Аминокислоты стабильны в этих условиях в течение года.

Получение ДАБС —производных аминокислот. В сухую пробирку с градуировочной смесью аминокислот добавляют 0,020 см³ раствора 0,45% водного раствора NaHC0₃ и 0,04 см³ 0,1% раствора ДАБС, закрывают силиконовой пробкой. Для получения производных пробирку помещают в водяную баню на 12 минут при температуре 70 °С. После охлаждения пробирки до комнатной температуры в неё добавляют 0,44 см³ буфера для ДАБС - производных аминокислот. Общий объём в пробирке составляет 0,5 смТ Из этого объема вводят в петлю дозатор хроматографа 0,020 см³. В табл.2 и 3 в столбце 7 приводятся данные по количеству вводимых аминокислот.

9

8.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика от концентрации каждой аминокислоты в растворе, устанавливают по шести точкам в диапазоне от 25 до 400*10'³ мг/см³, а для триптофана от 50 до 300» 10'³ мг/см³. Градуировочные растворы хроматографируют не менее пяти раз, начиная с самой низкой концентрации. Регистрация сигнала, обработку и хранение полученной информации проводят с использованием компьютерной системы. Площади пиков стандартов аминокислот вычисляются общепринятыми методами.

Затем на миллиметровой бумаге строится градуировочная зависимость величины отклика детектора (Y) от концентрации каждой аминокислоты (X).

Условия хроматографического анализа:

Соотношение буферов А и Б представлены в табл.4.

Таблица 4 Условия градиентного элюирования

Время анализа, мин Соотношение буферов, % Время, за которое изменяется соотношение буферов, мин. А Б 0 71 29 13 13 49 51 7 20 14 86 1 30 0 100 0,5 35 71 29

Время выхода аминокислот устанавливают при проведении градуировочных работ. Для этого наилучшей концентрацией является 5010'³ мг/см³ (или 1*10'⁶ мг каждой аминокислоты, введенной в колонку). Хроматограмма на которой виден порядок выхода аминокислот приводится в приложении 2, рис.1.

8.5.1. Контроль градуировочного графика

Контроль градуировочного графика осуществляется по градуировочным растворам аминокислот. Для контроля должны применяться растворы с концентрацией аминокислот, входящей в диапазон измерений, но не повторяющие по значениям концентрации, по которым рассчитывались параметры градуировочной прямой. Допустимые расхождения между заданными и установленными по графику значениями концентраций используемых для контроля градуировочных растворов не должны превышать 19 %. В противном случае график подлежит повторной перепроверке и при необходимости, новому расчету параметров градуировочной зависимости. График подлежит обязательной проверке при замене партии реактивов и посуды, после ремонта оборудования, но не реже одного раза в месяц.

8.5.2. Оперативный контроль градуировочного графика

Для оперативного контроля градуировочного графика перед началом измерений используется 1-2 градуировочных раствора из диапазона измерений аминокислот. Полученные при хроматографировании значения Y не должны отклоняться от градуировочной прямой более чем на величину доверительной границы случайной составляющей погрешности градуировочного графика Лх_фад = 9 %. В противном случае график подлежит повторной перепроверке по п.8.5.1.

10