Купить ГОСТ 31475-2012 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
Распространяется на мясо, мясные продукты (кроме консервов), полуфабрикаты и устанавливает метод электрофореза для определения в них массовой доли соевого белка.
Переиздание. Апрель 2019 г.
1 Область применения
2 Нормативные ссылки
3 Сущность метода
4 Диапазоны измерений и метрологические характеристики метода
5 Отбор проб
6 Аппаратура, материалы и реактивы
7 Подготовка к выполнению измерений
8 Проведение исследования
9 Обработка результатов
10 Требования безопасности
Приложение А (рекомендуемое) Градуировочный график определения массовой доли соевых белков в модельной мясорастительной смеси свиного и соевого белков
Библиография
Дата введения | 01.07.2013 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.10.2014 |
Актуализация | 01.01.2021 |
24.05.2012 | Утвержден | Межгосударственный Совет по стандартизации, метрологии и сертификации | 41 |
---|---|---|---|
09.11.2012 | Утвержден | Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии | 714-ст |
Разработан | ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии | ||
Издан | Стандартинформ | 2014 г. | |
Издан | Стандартинформ | 2019 г. |
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации
(МГС)
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
ГОСТ 31475 -2012
(ISC)
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ
СТАНДАРТ
Издание официальное
Москва
Стандартинформ
2013
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности им. В. М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им. В. М. Горбатова Россельхозакадемии)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 226)
За принятие проголосовали: | |||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2012 г. № 714-ст введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 июля 2013 г. 5 Стандарт подготовлен на основе ГОСТ Р 53220-2008 6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе «Национальные стандарты». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе «Национальные стандарты», а текст изменений в информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты» |
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 41-2012 от 24 мая 2012 г.)
© Стандартинформ, 2012
В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
растворимости). Затем нагревают смесь до 75 °С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Прозрачную надосадочную жидкость используют для проведения электрофореза.
Навески по 100,0 г свинины (говядины или баранины, содержание животного белка не менее 18 %) смешивают с навесками 1,5, 10, 15, 20, 50 и 85 г соевого изолята, содержащего не менее 85 % растительного белка.
Точное содержание растительного и животного белка предварительно устанавливают методом Кьельдаля по ГОСТ 25011. Каждую смесь перемешивают на микроизмельчителе тканей в течение 30 мин до образования гомогенной массы. Допускается использование уменьшенных навесок в случае приготовления смеси путем растирания в ступке. Получают двухкомпонентные модельные мясорастительные смеси, массовая доля растительного соевого белка в которых относительно массовой доли общего белка равна соответственно 4,5 %; 19,1 %; 32,1 %; 41,5 %; 48,6 %; 70,2 % и 80,0 %.
7.4.1 Проводят денситометрирование выявленных характеристических белковых полос, соответствующих молекулярным массам 65000—75000, и автоматически, используя показания денситометра, вычисляют сумму площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000— 75000.
Сумма площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000—75000, пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.
Градуировочный график строят по результатам определения массовой доли соевых белков в двухкомпонентных модельных мясорастительных смесях, приведенным в таблице 2.
9
Таблица 2
Сумма площадей пиков на электрофореграмме в области молекулярных масс 65000— 75000, уел. ед. |
ОД |
26 |
75 |
100 |
145 |
175 |
190 |
225 |
255 |
290 |
Массовая доля соевых бел | ||||||||||
ков в анализируемом образце. | ||||||||||
% |
0 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
График, построенный поданным таблицы 2, представлен в приложении А.
8.1.1 В соответствии с инструкцией по эксплуатации собирают камеру для проведения вертикального электрофореза.
Два чистых стекла, входящих в комплект камеры для электрофореза, обезжиривают этиловым спиртом. Затем их закрепляют в кассету с заданным расстоянием между стеклами 1 мм, образуя пространство для заливки геля размером 115 х 115 х 1 мм. Затем осторожно по краю стекла через наконечник от пипеточного дозатора заливают состав для нижнего сепарирующего геля на три четверти высоты стекла. В кассету по стенке на поверхность залитого геля приливают дистиллированную воду для полимеризации геля и выравнивания верхнего края его поверхности. После полимеризации граница между гелем и водой должна быть четко видна. Процесс происходит при температуре 20 °С в течение 1 ч. Увеличение времени полимеризации приводит к получению более плотной сетки геля и возрастанию времени, необходимого для проведения электрофореза.
ю
После полимеризации воду сливают и сверху через пластиковый наконечник от пипеточного дозатора заливают формирующий гель. Гель заливают в кассету на поверхность ранее полученного геля до верхних краев стеклянных пластинок, вставляют в раствор специальную пластмассовую гребенку для формирования в геле углублений, в которые будут вноситься анализируемые образцы, и проводят повторно полимеризацию в течение 20—30 мин. Для достижения лучшего разделения белковыхполос кассету с гелем можно выдержать в течение 10 ч при 4 °С. После этого гребенку следует удалить.
8.1.3 В соответствии с инструкцией по эксплуатации кассету закрепляют в электрофорезной камере, туда же помещают электроды, спираль для охлаждения буфера и заливают в электродную камеру до краев электродный буфер так, чтобы буферный раствор покрывал верхний край кассеты с гелем.
После этого в каждое углубление микрошприцем вносят предварительно подготовленные по 7.2 растворы белковых проб в количестве 1—2 мкл, содержащих белок из расчета 10—20 мкг на одно углубление. Допускается максимально вносить в одно углубление 20 мкл раствора белка. Введение проб осуществляют медленно, так, чтобы вводимый раствор белка не всплывал со дна углублений.
В отдельное углубление рядом с анализируемой пробой вносят 5 мкл раствора маркерных белков с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл, приготовленного по 7.1.8.
Включают электрический ток и проводят процесс при плотности постоянного тока 2,5 мА/см2 в течение 1—2 ч.
Время процесса зависит от состояния геля (насколько свежими были использованные растворы), а также от расстояния, на которое необходимо продвинуть белки.
8.1.4 В ходе электрофореза окрашенные в фиолетовый цвет полосы белков собираются на дне углублений верхнего геля, затем продвигаются вниз. Происходит формирование молекул белка под воздействием тока (движение) и распрямление белковых глобул в присутствии СДС — реактива, способ-
11
ствующего разворачиванию молекул белка (добавление 1,5 г СДС на 1 г белка вызывает его полную денатурацию).
При закислении раствора окраска полос может измениться на желтую из-за наличия красителя бромфенолового синего.
После прохождения белков через верхний гель полосы собираются на границе двух гелей, входят в нижний сепарирующий гель, и происходит разделение белка на его составные части (фракции).
Путь, который проходит каждая полоса Щ прямо пропорционален молекулярной массе белковой фракции.
8.1.5 Процесс завершен, когда нижние низкомолекулярные белковые фракции оказываются примерно в 2 см от нижнего края геля. Камеру отключают от источника тока и электродный буфер сливают. Камеру разбирают и извлекают гель на поверхность стекла. Отделенный гель помещают в 12,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, выдерживают 15 мин, сливают кислоту и промывают дистиллированной водой. Гель переносят в окрашивающий раствор и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.
Затем опять промывают дистиллированной водой 2 раза. Обесцвечивание геля проводят в обесцвечивающем растворе в течение 3 ч.
В результате получают полиакриламидный гель, в котором видны окрашенные в синий цвет полосы фракций анализируемого белка и полосы, соответствующие маркерным белкам с известной молекулярной массой. Сравнение белковых полос анализируемого образца с полосами маркерных белков позволяет сделать заключение о фракционном составе определяемого белка и молекулярной массе каждой фракции, а также выявить характеристические полосы белка, соответствующие примесям растительного происхождения.
8.1.6 Повторяют анализ со второй параллельной пробой.
8.2.1 По градуировочному графику определяют массовую долю соевых белков в анализируемой пробе.
9.1 За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:
где Ci и С2 — результаты параллельных определений массовой доли соевых белков, определенные по градуировочному графику, %;
т*отн — предел повторяемости, приведенный в таблице 1.
Результат вычислений округляют до целого числа.
9.2 Массовую долю растительного соевого белка /Ур, %, относительно массовой доли общего белка, вычисляют по формуле
БР = (С/БК)- 100, (2)
где С — среднеарифметическое значение массовой доли растительных белков в анализируемом образце, %;
Бк — значение массовой доли общего белка в анализируемом образце, определенное методом Кьельдаля по ГОСТ 25011, %.
10.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
10.2 Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
10.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.
13
Приложение А (рекомендуемое)
Градуировочный график определения массовой доли соевых белков в модельной мясорастительной смеси свиного и соевого белков
А.1. График определения массовой доли соевых белков в модельной смеси свиного и соевого белков приведен на рисунке А.1.
Сумма площадей гиков в области молекулярных масс 05000 - 75000, уСл. ед. |
в анализируемом образце, % РисунокА.1 |
14
[1] ISO 17604:2003
Библиография
Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Отбор проб с туши для микробиологического анализа
15
УДК 637.5.045:633.34:537.3:006.354 МКС 67.120.10
Ключевые слова: стандарт, мясо, мясные продукты, метод электрофореза, растительный белок, соевый белок
16
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ Определение массовой доли растительного (соевого) белка методом электрофореза
Meat and meat products.
Electrophoretic method of determination of soy proteins
Дата введения — 2013 - 07 - 01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясные продукты (кроме консервов), полуфабрикаты и устанавливает метод электрофореза для определения в них массовой доли соевого белка.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия ГОСТ 1770-74 (ИС0 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 25011-81 Мясо и мясные продукты. Методы определения белка ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сущность метода
Метод основан на тепловой денатурации и экстракции белков из мясных фаршей, состоящих из смесей животных и растительных белков, с последующим электрофоретическим разделением экстрагированных белковых фракций в полиакриламидном геле. Массовая доля соевых белков в смеси определяется по сумме площадей пиков, соответствующих на денситограмме белковым зонам с молекулярными массами 65000—75000, которая пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.
2
4.1 Диапазон измерения массовой доли соевого белка от 1 % до 85 %.
Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности Р = 0,95 приведены в таблице 1.
Таблица! | ||||||||||||||||||||
|
5.1 Отбор проб — по [1].
5.2 От представительной пробы отбирают пробу массой не менее 200 г. Пробу измельчают на микроизмельчителе тканей и сохраняют в холодильнике при температуре от 0 °С до 5 °С до полного завершения испытания в течение суток.
Допускается хранение проб при температуре от минус 20 °С до минус 10 °С в герметичной упаковке в течение одной недели с даты отбора проб на
исследование. 1
Камера для проведения вертикального электрофореза с источником питания (стабилизация по току и напряжению, максимально 250 В и 500 мА; цифровая индикация; выход на одну электрофоретическую камеру).
Денситометрическое устройство для сканирования гелей или хроматограмм, позволяющее определять площадь одной электрофоретической полосы 0,1 мкг белка в полиакриламидном геле толщиной 1 мм.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,1 мг.
Микроизмельчитель тканей.
pH-метр, позволяющий производить измерения с допускаемой погрешностью ± 0,05 единицы pH.
Дозатор пипеточный переменного объема.
Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.
Микрошприц вместимостью 100 мкл.
Пипетки 2-го класса точности вместимостью 1, 5 и 10 см1 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169.
Воронки стеклянные ВД-1-100 ХС по ГОСТ 25336.
Бутыли стеклянные для растворов по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2, 2-2000-2 по ГОСТ 1770.
Пластиковые пробирки с крышкой типа «Эппендорф» вместимостью 1 или 2 см1.
Стаканы химические В-1-50, В-1-100, В-1-250, В-1-1000 по ГОСТ 25336.
Цилиндры 2-25,2-100, 2-1000 по ГОСТ 1770.
Баня водяная.
Кислота соляная, стандарт-титр 0,1 моль/дм1.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч., с массовой долей основного вещества 35 %—38%.
Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х. ч.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.
4
Кислота трихлоруксусная, ч.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Глицерин по ГОСТ 6259.
N, N, N1, N1-тетраметил этилен диамин (ТЕМЕД) для электрофореза с массовой долей основного вещества не менее 99 %.
Акриламид для электрофореза с массовой долей основного вещества не менее 99 %.
N, N'-метиленбисакриламид (МБА) для электрофореза.
2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (ТРИС) для электрофореза с массовой долей основного вещества 99,9 %.
Натрия додецилсульфат (СДС) с массовой долей основного вещества не менее 99 %.
Аммония персульфат (АПС) с массовой долей основного вещества 98 %.
Краситель Кумасси R-250.
Глицин.
2-меркаптоэтанол с содержанием основного вещества не менее 99 %.
Краситель бромфеноловый синий.
Набор маркерных белков с молекулярной массой 27000—180000. Свинина, говядина или баранина с содержанием белка не менее 18 %. Соевый изолят, содержащий не менее 85 % белка.
Допускается применять другие средства измерений, оборудование и материалы с метрологическими и техническими характеристиками не хуже указанных.
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 количественно переносят содержимое вскрытой ампулы со стандарт-титром соляной кислоты 0,1 моль/дм3, до-
5
полнительно ополаскивают ампулу дистиллированной водой, переносят в колбу и доводят дистиллированной водой объем раствора до метки.
7.1.2.1 Приготовление раствора 2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиола (ТРИС) молярной концентрации ОД моль/дм3
Навеску 2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиола (ТРИС) массой 1,211 г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.2.2В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают 25 см3 раствора ТРИС молярной концентрации 0,1 моль/дм3, добавляют 22,5 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3 и доводят дистиллированной водой до метки.
7.1.3.1 Приготовление раствора А
Навеску акриламида массой 30 г и навеску N, N'-метиленбисакриламида (МБА) массой 0,15 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.2 Приготовление раствора В
Навеску ТРИС массой 18,2 г и навеску додецилсульфата натрия (СДС) массой 0,4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают pH = 8,8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.3 Приготовление раствора С
Навеску ТРИС массой 9,1 г и навеску СДС массой 0,4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллирован-
6
ной воды, устанавливают pH = 6,8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.4 Приготовление раствора D
Навеску аммония персульфата (АПС) массой 0,125 г растворяют в 1,23 см3 дистиллированной воды.
7.1.3.5 Приготовление раствора Е
Навеску акриламида массой 30,0 г и навеску МБА массой 0,8 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в 50—60 см3 дистиллированной воды и доводят дистиллированной водой до метки.
7.1.4.1 Приготовление 20 %-ного раствора СДС
Навеску СДС массой 20,0 г смешивают в химическом стакане с 80 см3 дистиллированной воды до полного растворения соли.
7.1.4.2 В мерную колбу вместимостью 2 дм3 помещают навеску 24,0 г ТРИС и навеску 115,0 г глицина, добавляют 40 см3 20 %-ного раствора СДС, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения компонентов.
К навеске красителя Кумасси R-250 массой 1,1 г приливают 200 см3 этилового спирта, 50 см3 уксусной кислоты, 200 см3 дистиллированной воды и перемешивают в химическом стакане до полного растворения.
К 500 см3 этилового спирта приливают 350 см3 уксусной кислоты и 2 дм3 дистиллированной воды.
7.1.7.1 Приготовление 0,05 %-ного раствора бромфенолового синего
Навеску 0,05 г бромфенолового синего смешивают в химическом стакане с 99,95 см3 дистиллированной воды.
7
7.1.7.2 К 0,4 см3 2-меркаптоэтанола поочередно приливают 0,8 см3 20 %-ного раствора СДС, 0,4 см3 ТРИС-буфера, 0,8 см3 0,05 %-ного раствора бромфенолового синего, 5 см3 дистиллированной воды и 5 см3 глицерина.
Растворы используют свежеприготовленные, допускается их хранение при температуре 4 °С не более двух суток.
В пластиковой пробирке типа «Эппендорф» растворяют навеску массой 50,0 мкг готовой смеси маркерных белков с молекулярной массой 27000— 180000 в 50,0 мкл буфера для растворения белковых проб. Раствор сохраняют при минус 20 °С в течение одной недели.
Навеску 12,5 г трихлоруксусной кислоты растворяют в химическом стакане в 87,5 см3 дистиллированной воды и получают 12,5 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
7.1.10.1 Приготовление раствора для нижнего сепарирующего геля
18,0 см3 раствора А, 7,5 см3 раствора В, 4,3 см3 дистиллированной воды,
0,01 см3 ТЕМЕД, 0,2 см3 раствора D смешивают в химическом стакане непосредственно перед использованием.
7.1.10.2 Приготовление раствора для верхнего формирующего геля
В химическом стакане смешивают 1,3 см3 раствора Е, 2,5 см3 раствора С,
6,2 см3 дистиллированной воды, 0,01 см3 ТЕМЕД, 0,1 см3 раствора/).
Растворы используют немедленно после приготовления.
Навеску образца, содержащего около 0,2 г общего белка, определенного предварительно методом Кьельдаля по ГОСТ 25011 (для мясных продуктов при массовой доле общего белка 18 % масса навески составляет 1,0 г), гомогенизируют в микроизмельчителе или путем растирания в ступке с 10 см3 ТРИС-буфера pH 6,8 или буфера для растворения белковых проб (в случае плохой
1