Сертификация: тел. +7 (495) 175-92-77
Стр. 1
 

20 страниц

396.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Настоящий стандарт устанавливает методы выявления в пищевых продуктах ботулинических токсинов всех типов, вегетативных клеток и спор токсигенных штампов Clostridium botulinum, определения титра ботулинических токсинов, серологического типирования токсина и выделения культур токсигенных штаммов типа A,B,C,D,E,F и G

Переиздание. Апрель 2010 г.

Ограничение срока действия снято: Постановление Госстандарта № 340 от 30.03.92

Оглавление

1 Методы отбора и подготовка проб

2 Аппаратура, материалы, реактивы и растворы

3 Питательные среды

4 Подготовка к испытанию

5 Проведение испытания

6 Обработка результатов

Приложение 1 Термины, применяемые в настоящем стандарте и пояснения к ним

Приложение 2 Техника постановки биологической пробы

Приложение 3 Подготовка шприцев и игл к испытанию

Приложение 4 Отбор проб от остатков пищевых продуктов для выявления ботулинических токсинов и c.botulinum

Показать даты введения Admin

Страница 1

ГОСТ 10444.7-86

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ И CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Издание офиниалыюе

СП»Щ*рт1^0|М

2010

Страница 3

Группа 1(09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

ГОСТ

10444.7-86

Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum.

Взамен ГОСТ 10444.7-75 (ОСТ 10444.8-75

Food products. Methods for detection of bomlinal toxins and Clostridium botulinum

МКС 07.100.30 ОКСТУ 9109

Постановлением Государственного комитета СССР no стандартам от 12 мая 1986 г. № 1214 дата введения установлена

01.07.87

Настоящий стандарт устана&тнвает методы выявления в пищевых продуктах ботулинических токсинов всех типов, вегетативных клеток и спор токсигенных штаммов Clostridium botulinum, определения титра ботулинических токсинов, серологического типирования токсина и выделения культур токсигенных штаммов С. botulinum типа А, В, С, D, Е, F и G.

Метод выяапения ботулинического токсина и определение его титра основан на выявлении симптомов клинической картины болезни и гибели животных, характерных для ботулинической интоксикации.

Серологическое типирование токсина С. botulinum осуществляется на белых мышах путем постановки защитного теста in vivo или реакции нейтрализации in vitro с диагностическими противоботули-нистическнми типоспецифическими антитоксическими сыворотками.

Метод выявления С. botulinum основан на его способности развиваться и образовывать ботулиии-ческие токсины в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.

Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum из продукта или культу ральной жидкости проводят путем высева на твердые питательные среды с последующим исследованием культуральных и морфологических признаков, характерных для С. botulinum и определением способности выделенной культуры образовывать ботулинический токсин.

Методы предназначены:

для исследования продуктов по санитарно-эпидемиологическим показаниям:

для анализа посевов продуктов, в случае обнаружения в них мезофильных анаэробных микроорганизмов.

Исследования проводят в лабораториях, указанных органами здравоохранения.

Термины, применяемые в настоящем стандарте, и пояснения к ним приведены в приложении 1.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 5211—65.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА И ПОДГОТОВКА ПРОБ

1.1.    Методы отбора проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668-85 и в соответствии с требованием приложения 4. Пробы пищевых продуктов подготавливают к анализу по ГОСТ 26669-85. Консервы и полуконсервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18-70 и термостатирч ют по ГОСТ 26669-85.

1.2.    Термостатированию не подлежат: консервы и полуконсервы в негерметичной таре, бомбах-ные, хлопуши. консервы с видимыми невооруженным глазом признаками развития микроорганизмов и предназначенные для одновременного выявления ботулинических токсинов и С. botulinum или только ботулинических токсинов.

Издание официальное    11еренечатка воспрещена

Переиздание. Апрель 2010 г.

С» И ПК Издательство стандартов. 1986 © СТАНДАРТИНФОРМ, 2010

247

Страница 4

С. 2 ГОСТ 10444.7-86

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И РАСТВОРЫ

2.1. Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы, реактивы и растворы по ГОСТ 10444.1-84. а также аппаратуру, материалы, реактивы и растворы, указанные ниже: анаэростзг;

аппарат для встряхивания;

баллоны с газами (азот, водород, гелий или смесью: азот 80 %. углекислый газ — 10 %. водород - 10%);

весы аналитические: грушу резиновую; доски для сушки посуды; ерши для мойки посуды;

корзинки проволочные луженые для стерилизации;

микроскоп биологический с приспособлением для фазовоконтрастного микроскопирования; микропипетки;

пестик для фарфоровой ступки; петли бактериологические; пипетки пастеровские;

пробирки центрифужные вместимостью 10-100 смл;

размельчитель тканей лабораторный,

редукторы к баллонам с газом;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

стекла покровные по ГОСТ 6672-75;

фильтры асбестовые, керамические, мембранные;

флаконы вместимостью 100— 500 см';

футляры металлические для стерилизации пипеток, чашек Петри, шприцев;

штативы для пипеток;

штативы для пробирок;

бумагу индикаторную:

дуршлаг;

масло иммерсионное; перчатки резиновые; фильтр тканевый;

мышей белых массой 15—20 г одного пола;

бриллиантовый зеленый, раствор: 0,5-1.0 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 см3 этилового спирта. Применяют для метки белых мышей;

кальций углекислый стерильный готовят по ГОСТ 10444.1-84. Добавление углекислого кальция к средам с глюкозой способствует образованию спор С. botulinum;

кислоту' аскорбиновую, раствор массовой концентрацией 50 г/дм3: 5 г аскорбиновой кислоты переносят в мерную колбу вместимостью 100 cmj, доводят объем дистиллированной водой до метки, растворяют и стерилизуют фильтрованием, используя фильтры со средним диаметром пор 0,40—0,45 мкм. Раствор следует применять свежеприготовленным. Допускается использовать без стерилизации раствор аскорбиновой кислоты для инъекций. Применяют в качестве восстановителя, связывающего кислород в питательных средах для С. botulinum; кислоту молочную, L - форма по ГОСТ 490-2006;

кислоту пикриновую, раствор: 2,5 пикриновой кислоты растворяют в 100 см3 воды при нагревании. Применяют для метки белых мышей;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, раствор с массовой долей соляной кислоты 4 %. Применяют для подкисления питательных сред;

масло вазелиновое по ГОСТ 3164-78 или подсолнечное по ГОСТ 1129-934; масло вазелиновое рахтивают в колбы по 20—50 cmj и стерилизуют горячим воздухом в стерилизаторе в течение 60 мин при температуре 140 ‘С; масло подсолнечное прокаливают при температуре (160± 1) "С горячим воздухом в стерилизаторе в течение 2 ч, охлаждают, фасуют в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) ‘С в течение 30 мин: мальтозу;

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52465-2005.

24Х

Страница 5

ГОСТ 10444.7-86 С. 3

малахитовый зеленый;

медь сернокислую по ГОСТ 4165-78. 1 %-ный раствор. Применяют для постановки биуретовой реакции в питательных средах;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328 -77, раствор с массовой долей гидроокиси натрия 4 %. Применяют для подшелачивания питательных сред;

натрий углекислый по ГОСТ 83-79. 0,3—1 %-ный раствор. Применяют для кипячения игл для шприиев (см. приложение 3); натрия тногликолят; неомипин;

перекись водорода по ГОСТ 177— SS. раствор с массовой долей перекиси водорода 3 %\ растворы фосфатного буфера:

для приготовления фосфатного буфера готовят растворы:

Л — раствор однозамещенного фосфорнокислого калия (КН;Р04 — квалификации х. ч„ дважды перекристаллизованный или для рН-метрии) массовой концентрацией 9,078 г/дм';

Б — раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HP04 • 2Н,0 квалификации х. ч.. дважды перекристаллизованный) массовой концентрацией 11,876 г/дм5; для приготовления 100 см’ фосфатного буфера: с pH 6,0 - к 12 см5 раствора Б добавляют 88 см ' раствора Л; с pH 6,2 - к 18,5 см3 раствора Б добавляют 81,5 см ' раствора Л; с pH 6.8 — к 50 см5 раствора Б добавляют 50 см* раствора Л, раствор фосфатного буфера с pH 6.0 применяют для растворения трипсина; растворы желатино-фосфатного буфера:

в 100 см' фосфатного буферного раствора с определенным значением pH вносят 0.6 г желатина, дают набухнуть желатину и нагревают до полного растворения желатина. Стерилизуют при температуре (110±1) *С в течение 15 мин;

раствор желатино-фосфатного буфера с pH 6,2 применяют в качестве стабилизатора ботулиничес-ких токсинов. В случае выявления ботулннического токсина типа Л переходят на расгвор желатино-фосфатного буфера с pH 6,8;

смесь реактивов для создания анаэробных условий готовят по ГОСТ 10444.1-84. Допускается использование талька вместо инфузорной земли;

трипсин, раствор: 1,5 г трипсина растворяют в 100 см3 раствора фосфатного буфера с pH 6,0. Раствор трипсина стерилизуют фильтрованием через керамический или мембранный фильтр с размерами лор 0,40-0.45 мкм или другой эквивалентный фильтр. Стерильный раствор трипсина вносят в регенерированную и охлажденную питательную среду асептически непосредственно перед использованием из расчета I см ' раствора трипсина на 15 см5 среды. Применяют для активизации протоксина С. botulinum;

гидролизат казеина ферментативный; фломастеры (применяют дтя метки мышей); циклосерин;

эмульсию яично-желточную: свежие куриные яйца моют, ополаскивают холодной водой, опускают в 70 %-ный спирт и высушивают. Разбивают каждое яйцо, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри и отделяют желток от белка. Помешают желтки в стерильную колбу или флакон с четырьмя объемами стерильной воды и энергично перемешивают. Нагревают смесь на водяной бане при температуре (45±0,5) *С в течение 2 ч. оставляют на 18-24 ч при температуре от 0 до плюс 5 *С для того, чтобы сформировался осадок.

С соблюдением правил асептики собирают эмульсию над осадком. Эмульсию хранят при температуре 0 - плюс 5 'С не более 72 ч. Применяют для определения способности С. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.

3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

3.1. При приготовлении питательных сред для выяапения и культивирования С. botulinum жидкие и полужидкие среды разливают во флаконы или в пробирки таким образом, чтобы высота столбика среды составляла не менее 10 см, объем среды -30- 100 см\

249

Страница 6

С. 4 ГОСТ 10444.7-86

Если нет специальных указаний по хранению среды, то среду хранят в темноте при температуре (4+2) *С не более 1 мес. Сухие среды, в состав которых входят тиогликолят натрия и цистеина гидрохлорид, хранят в герметичной упаковке при температуре (4±2) 'С. Приготовленные из них жидкие и полужидкие среды хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

3.2. Для выявления и выделения С. botulinum используют следующие среды.

3.2.1.    Агар желточный для анаэробов: к 1000 см* дистиллированной воды добавляют 25,0 см5 дрожжевого экстракта. 5.0 г триптона или ферментативного гидролизата казеина. 20,0 г пептона.

5.0    г хлористого натрия и 20.0 г агара. Среду нагревают на кипящей водяной бане до расплавления агара, устанавливают pH (6.9+0.1). разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (!21±1)*С в течение 20 мин. Хранят при температуре (4±2) "С не более 28 сут.

Яично-желточную эмульсию добавляют к расплавленной и охлажденной до 50 ‘С среде из расчета S0 см' яично-желточной эмульсии на 1000 см* среды, тщательно перемешивают и pan ива ют по чашкам Пегрн. Чашки хранят при температуре (4±2) *С не более 2 сут, перед использованием подсушивают по ГОСТ 26670-91. Применяют для определения способности С. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.

3.2.2.    Агар печеночно-желточный; агар печеночный готовят по ГОСТ 10444.1-84. Яично-желточную эмульсию добавляют к расплавленному и охлажденному до 50 'С печеночному

агару из расчета 80 см ’ желточной эмульсии на 1000 см' агара, тщательно перемешивают и рахливают по чашкам Петри. Чашки хранят при температуре (4±2) 'С не более 2 сут, перед использованием подсушивают по ГОСТ 26670-91.

При отсутствии печеночного агара допускается заменять его мясо-пептонным агаром. Применяют для определения способности С. botulinum давать положительную реакцию с яичным желтком.

3.2.3.    Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1-84.

3.2.4.    Агар сахарный кровяной по Цейсслеру готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют при определении гемолитической активности С. botulinum.

3.2.5.    Бульон триптиказо-пептонно-глюкозный с дрожжевым экстрактом (ТРОУ) и с трипсином (ТРОУТ): 50.0 г триптического перевара казеина, 5.0 г пептона. 100.0 см'дрожжевого экстракта.

4.0    г глюкозы и 1,0 г тиогликолята натрия добавляют к 900 см* дистиллированной воды, устанавливают pH (7.1 ±0.1). Стерилизуют при температуре (121±1)‘С пробирки в течение 10 мин. флаконы -в течение 15 мин. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

Для культивирования С. botulinum. образующих протоксин, перед употреблением к 1000 см' бульона добавляют 60 см* 1,5 %-ного раствора трипсина в фосфатном буферном растворе.

3.2.6.    Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1 — 84.

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.7.    Среду из вареного мяса (Cook-Meat Medium) готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для выделения и культивирования С. botulinum.

3.2.8.    Среду Кнтг-Тароцци с углекислым кальцием готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для выявления и культивирования С. botulinum.

3.2.9.    Среду печеночно-глицериновую готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.10.    Среду питательную для контроля стерильности, сухую.

В состав среды входят:

фермент ативный пиролизат казенна неглубокой степени расщепления - 15.0 г;

витаминный препарат экстракта кормовых дрожжей 5,0 г:

натрий хлористый —6.4 г;

глюкоза - 5.0 г;

тиогликолят натрия — 0.3 г;

цистеина гидрохлорид — 0,75 г;

агар — 0.6 г;

натрий углекислый - 0,5—0,95 г;

33,0 г сухого порошка растворяют в 10(H) см' воды, тщательно размешивают, доводят до кипения. кипятят 2—3 мин при помешивании, фильтруют, разливают во флаконы. Стерилизуют при температуре (121±1)*С в течение 20 мин. Готовая среда должна иметь pH (7.0±0,2).

Среду хранят при комнатной темпералуре не более 7 cvr.

250

Страница 7

ГОСТ 10444.7-86 С. 5

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.11.    Улучшенную клостридиальную среду (R. С. М.) готовят по ГОСТ 10444.1-84.

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.12.    Бульон с кониной и мальтозой: к 1000 см3 волы добашшют 500 г конины, кипятят в водяной бане в течение 1 ч. фильтруют, в фильтрат добавляют 30,0 г ферментативного пептона. 2,32 г двузамещенного фосфата натрия, 10,0 г мальтозы. Смесь кипятят на водяной бане в течение 30 мин. устанавливают pH (7,6±0,2), фильтруют, разливают по 10 см' в пробирки, после чего в каждую пробирку вводят 1 - 1.5 г вареной и измельченной конины. Пробирки стерилизуют в течение 15 мин при температуре (121 ± I) *С.

Применяют для культивирования С. botulinum.

3.2.13.    Питательный агар с кровью и глюкозой: к 1000 см3 депонированной воды добавляют 17,0 г ферментативного пептона. 15 см' дрожжевого экстракта, 5.0 г натрия хлористого. (17.0±3,0) г агара. 20,0 г глюкозы, устанаашвают pH (7,2±0.2), стерилизуют при температуре (121± 1) ’С в течение 20 мин. После стерилизации и охлаждения до 50 'С добавляют 200 см3 крови. Допускается добавление в среду неомицина до конечной концентрации 50 мг/см' или циклосерина до 400 мг/см3.

Применяют для выделения С. botulinum.

3.2.14.    Питательный агар с яичным желтком и лактозой: к 1000 см’ депонированной воды добавляют 17,0 ферментативного пептона, 15 см’ дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлористого, (17,0±3,0) г агара, устанавливают pH (7,2±0,2). стерилизуют при температуре (121±1) *С в течение 20 мин. В стерильную расплаатенную среду добаатяют 20,0 г лактозы, смесь прогревают в течение 30 мин в водяной бане в кипяшей воде. После охлаждения до 50 "С добааляют асептически 10 см' 0.4 %-ного раствора бромкрезолпурпура и 100 см' эмульсин яичного желтка.

Применяют для выделения С. botulinum.

4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.1.    Подготовка продукта к нсиытаиию на наличие ботулниических токсинов

4.1.1.    Ятя выяатения ботулинических токсинов отбирают 100 см'/г жидкого продукта, культуральной жидкости анаэробных посевов, жидкую фракцию продуктов смешанного состава, водные экстракты или экстракты, приготовленные с физиологическим раствором пастообразных, сыпучих продуктов и продуктов твердой консистенции. Объем прнготоаленной исходной жидкости должен состаатять около 30 см3. Оставшееся количество исходной жидкости используют, при необходимости, для повторного испытания.

При отсутствии продукта в достаточном количестве выявляют ботулииические токсины в исходной жидкости меньшего объема.

Экстракты из сыпучих и твердых продуктов, не растворимых в воде, получают из соленых продуктов (содержащих более 2 % NaCl) при добавлении дистиллированной воды в соотношении 1 : 1 или I : 2, из несоленых и предварительно восстаноаленных продуктов тепловой и сублимационной сушки - при добавлении такого же количества физиологического раствора.

Предварительно измельченный ножом или ножницами продукт переносят в стерильную ступку, добаашют при необходимости стерильный песок или стерильную стеклянную крошку и доводят до однородной консистенции, постоянно добаашя воду или физиологический раствор. Смесь переносят в стерильную колбу.

Водорастворимые или пастообразные продукты смешивают с водой tun физиологическим раствором в соотношении 1 : 1 или 1 : 2 в стерильной колбе.

Полученные смеси выдерживают при температуре (4±2) "С в течение 2 ч и затем изалекают из них жидкую фракиию.

Прогрев и ротационную гомогенизацию продукта для выяаления ботулинических токсинов не проводят; продукт измельчают в ступке.

Жидкую фракцию отделяют от продукта отстаиванием и (или) фильтруют через ватно-марлевый или другой фильтр, не адсорбирующий ботулииические токсины или центрифугируют при температуре (4±2) *С и частоте врашення 500 с'1 в течение 1—2 мин. Использование асбестовых фильтров

251

Страница 8

С. 6 ГОСТ 10444.7-86

или фильтровальной бумаги не допускается. 11одготовленную таким образом исходную жидкость переносят в стерильную колбу; хранят при температуре (4±2) ‘С не более 7 сут.

4.2. Подготовка продукта к испытанию для выявления н выделения С. botulinum

4.2.1.    Для выяапения и выделения С. botulinum отбирают 100 см3/г продукта из различных мест, имеющих и неимеющих изменения: гомогенизируют по ГОСТ 26669-85 или доводят до однородной консистенции. Допускается для посева использовать продукт, оставшийся после отделения или экстрагирования из него жидкой фазы.

Для выявления в любых продуктах вегетативных клеток и спор С. botulinum приготавливают не менее четырех навесок массой 20,0-25,0 г (см5) любого продукта.

5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

5.1.    Выявление богулинических токсинов

5.1.1.    Выяатенне ботулинических токсинов проводят по табл. 1 или одновременно с использованием протнвоботулннических антитоксических сывороток по табл. 2. Исследования проводят с исходной жидкостью (ИЖ), если в ней ботулинический токсин не обнаружен, то ИЖ обрабатывают протеолитическнм ферментом.

Для выявления ботулнннческих токсинов по табл. I используют исходную жидкость. В две пробирки пипеткой с резиновой грушей переносят по 2—3 см\ а в третью — 2,7 см’ исходной жидкости. В последнюю пробирку стерильной пипеткой добавляют 0.3 см5 раствора трипсина или панкреатина. В смеси исходной жидкости с ферментом с помощью раствора гидроокиси натрия или раствора соляной кислоты устанавливают pH (6,0± 1). Затем пробирку со смесью термостатируют при (37±1)‘С в течение 1 ч. но не дольше, периодически перемешивая содержимое. Культуральную жидкость, полученную из посевов продуктов в питательную среду, содержащую трипсин или панкреатин, проте-олитическнм ферментом не обрабатывают.

Вторую пробирку с исходной жидкостью кипятят на водяной бане в течение 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Первую пробирку с исходной жидкостью оставляют без обработки.

Хранение исходной жидкости, обработанной протеолитическнм ферментом, не допускается.

Непосредственно посте окончания обработки исходной жидкости протеолитическнм ферментом ставят биологическую пробу на белых мышах.

5.1.2.    По 0,5—1.0 см3 подготовленной соответствующим образом исходной жидкости вводят в зависимости от условий опыта внутрибрюшинно не менее чем двум белым мышам, в соответствии с приложением 2. Животных осматривают через 1, 2,4. 12 ч и далее не менее двух раз в день в течение 72 ч. Ботулинические токсины не вызывают молниеносной гибели животных; клинические симптомы ботулинической интоксикации животных токсином типа Е, как правило, появляются через 2—4 ч. токсином других типов - через 10—12 ч после инъекции. Высокие концентрации токсина могут вызвать гибель мышей в течение 1—2 ч без прояатения клиники ботулизма. В этом случае ставят повторно биологическую пробу с исходной жидкостью, разведенной в 10—100 раз. Мыши болеют и погибают не раньше, чем через 2 ч посте инъекции токсина, чаше всего в течение 4—6 ч. Клинические симптомы болезни и гибели мышей при ботулинической интоксикации очень характерны: шерсть взъерошивается, дыхание затруднено, мышцы брюшной стенки ослаблены и западают, давая симптом «осиная талия»; появляются судороги, паралич задних конечностей; гибель при явлениях полного паралича из-за остановки дыхания.

5.1.3.    При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те животные, которым введена необработанная протеолитическнм ферментом жидкость, и. если фермент не инактивировал ботулинический токсин, то болеют и погибают животные, которым введена жидкость, обработанная протеолитическнм ферментом. При наличии в исходной жидкости богулинических протоксинов болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации в первую очередь те животные, которым введена обработанная ферментом жидкость; мыши, которым введена не обработанная ферментом жидкость, могут переболеть, но не погибают или погибают позже. Мыши, которым введена прокипяченная жидкость, должны оставаться на всем протяжении опыта здоровыми. Если болеют или погибают мыши, получившие прокипяченную и непрокнпяченную жидкость, то исходную жидкость разводят буферным желатино-фосфатным раствором в соотношении 1 : I и 1 :9 и повторяют исследования по

252

Страница 9

ГОСТ 10444.7-86 С. 7

Таблица I

Постановка исследовании по обнаружении) ботулииичсского токсина и определению титра токсина

в исходной жидкости

Цел».

исследования

Объем ИЖ. см’

Мими.мальмо пыяплясмое

КОЛИЧЕСТВО

токсина в MLD ИЖ или ИЖТ. см’

Способ иодгоуоикм Ж для имьскиин

Объем Ж для инъекиии двум мышам. см'

Количество шприце И. 10 I

Порядок

исследования

Обнаружение боту-линичсских токсинов

1

Токсин

инактивиро

ван

ИЖ прогретая

0.5x2

1

Вначале ставят биологическую пробу с прогретой ИЖ. затем с ИЖ и в последнюю очередь с ИЖТ

1

1

0,5

0.1

1

2

4

20

ИЖ

ИЖТ

0.5 ИЖ + 0.5 ЖФЬ 0,1 И Ж -0,9 ЖФБ

0.5x2

0.5x2

0.5x2

0.5x2

1

1

1

1

При нсспсцифи-ческих симптомах гибели животных в предыдущих вариантах

2

1

Увеличенный объем ИЖ

1,0x2

1

При слабо выраженных симптомах ботулинической интоксикации

2

1

Увеличенный объем ИЖТ

1.0x2

1

Определение титра ботулини-ческого токсина

1 * I0 3 1•10-' 0,5

200

20

4

1 ИЖ (ИЖ1 )+99 ЖФБ I ИЖ (ИЖТ)+9 ЖФБ 1 ИЖ(ИЖТ) + | ЖФБ

0.5x2

0.5x2

0.5x2

1

1

1

Биологическую пробу с ИЖ или ИЖТ начинают с наибольшего разведения

1•10*3 1-ю-4 1 • 10 J

200000

20000

2000

1 ИЖ <ИЖТ>+99999 ЖФБ 1 ИЖ (ИЖТ)*9999 ЖФБ 1 ИЖ (ИЖТ)+999 ЖФБ

0.5x2

0.5x2

0.5x2

1

1

1

Биологическую пробу с ИЖ или ИЖТ начинают с наибольшего разведения

Примечания:

1.    ИЖ —исходная жидкость; Ж — жидкость, подготовленная соответствующим способом из ИЖ или ИЖТ для введения каждой из двух белых мышей; ИЖТ — исходная жидкость, обработанная протеолитн-ческим ферментом; ЖФБ — буферный желатино-фосфатный раствор. Если предполагается наличие токсина С. botuhnum Е. то разведения более I ИЖТ + 999 ЖФБ не готовят.

2.    Допускается титр ботудииического токсина не определять.

253

Страница 10

С. 8 ГОСТ 10444.7-86

Таблица 2

Номер

Исследуемый

Типы противоБо-

Состояние

Условия

Наличие и run богули-

варианта

вариант

тулиническик

подопытных

опыта

мического токсина

опыта

сывороток

мышей

1

ИЖ (ИЖТ)

Ьеи сывороток

Болеют и обычно погибают со специфическими клиническими симптомами ботулизма

Концентрацию ИЖ (ИЖТ) и способ подготовки для инъекции выбирают по табл. 1

Присутствует один или несколько типов ботулиничсских токсинов

2

ИЖ (ИЖТ)

Трехвалентная типов А, В, Е

Живы

Мыши в 1-ом варианте погибли

Тип А. В или Е (F)* или их комбинации

3

ИЖ

Моновалентная типа А

»

То же

Тип А

4

ИЖ

Моновалентная типа В

»

»

Тип В

5

ИЖ (ИЖТ)

Моновалентная типа Е

»

»

Тип Е (тип F)*

6

ИЖ (ИЖТ)

По табл. 3

Живы мыши, получившие гомологический тип сыворотки

»

Один или несколько типов токсина, соответствующих типу (типам) сывороток, защитивших мышей от гибели

* При перекрестной реакции с сывороткой тина Е.

Постановка исследований по обнаружению и оптированию ботулиничсских токсинов

Подбор противоботулиничсских еывороток для тииирования ботулиничсских токсинов в ИЖ (ИЖТ)

Таблица 3

Номер

варианта

опыта

Анализируемы»! продукт

Типы используемых иротивобоп'-линических сывороток и их комбинации

Типы вы я пляс мм к ботулиии ческих токсинов или их коибииаиии

I

Не прошедший термическую

Моновалентные типов А. В. Е

А. В. Е (F)

обработку

и трехвалентная типов А. В. Е

A* B-*-E(F)

2

Тот же. не содержащий боту

М оно валентная типа F

F(E)

линичсских токсинов или их ком

бинаций. выявляемых по 1-му

Моновалентная типа С

С (D)

варианту опыта

3

Прошедший термическую об

Моновалентная типа А и В. би

А: В; А + В

работку

валентная А В

4

Тот же. не содержащий типы

Моновалентная типа F

F(E)

ботулиничсских токсинов или их

комбинаций, ВЫЯ&1ЯСМЫХ но 3-му

Моновалентная типа Е

Е (F)

варианту опыта

Моновалентная типа С

С (D)

5

Любой, не содержащий типы

Бивалентные типы: АС

А + С (D)

ботулиничсских токсинов или

АЕ

А + Е (F)

их комбинаций, выявляемые по

AF

А + F (Е)

1—4-му вариантам опыта

ВС

В + С (D)

BE

В + Е (F)

BF

В + F (Е)

СЕ

С (D) + Е (F)

CF

C(DJ + F (Е)

EF

Е + F

254

Страница 11

ГОСТ 10444.7-86 С. 9

Продсмжение math. J

Номер

Анализируемый продукт

Типы используемых иротивобо!)"

Типы выявляемых ботулини

илрилгтл

динических сывороток и их

ческих токсинов иди их

ОПЫГЛ

комбннииии

комбинации

Любой, нс содержащий типы

Трехвалентные типы: ABF

А + В + F (Е)

ботулинических токсинов или

ВСЕ

В г C(D) + E(F)

их комбинаций, выяатяемые по

ВСТи

В + C<D) + F(E) и другие

1—4-му вариантам опыта

другие

Поливалентная типа ABCEF

А + В + C(D) + Е + F

6

Тот же. нс содержащий типы

Моновалентная типа Г)

1>(С>

ботулинических токсинов или их

Моновалентная типа G

G

комбинаций, выявляемые по 1 —

Поливалентная типов А. В. С,

(A+B + C+D + E + F+G)

5-му вариантам опыта

D. Е, F

и другие комбинации, в соот

ветствии с комбинациями ис-

папьюванной сыворотки

Примечания:

1.    Исследование начинают с использовании комбинации с наибольшим количеством типов сывороток, и в случае, если использованная комбинация типов сывороток защищает мышей от гибели, типируют ботули-ничсские токсины моно-. би- или трехвалентными сыворогками. указанными в соответствующем варианте опыта.

2.    В скобках указана возможная перекрестная реакция при типнровании ботулинических токсинов.

вышеописанному методу с тем, чтобы избежать гибели животных от прокипяченной жидкости или подтвердить, что клинические признаки гибели животных по всем вариантам опыта не соответствуют признакам ботулинической интоксикации.

При наличии в исходной жидкости ботулинических токсинов все последующие исследования проводят с необработанной жидкостью (ИЖ); ботулинических протоксинов — с жидкостью, обработанной протеолитическим ферментом (ИЖТ).

5.2. Определение титра ботулннического токсина

5.2.1.    Для определения титра ботулннического токсина используют исходную жидкость, содержащую ботулинический токсин, или гу же жидкость, содержащую протоксин и обработанную непосредственно перед поставкой биологической пробы протеолитическим ферментом. Пинеткой с резиновой грушей по 1 см’ исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом переносят в две пробирки: в одну стерильной пипеткой добавляют I см\ получая разведение 1:1, в другую - 9cmj буферного желатино-фосфатного раствора, получая разведение I : 9. Из пробирки с жидкостью, разведенной в 10 раз. стерильной пипеткой с резиновой грушей отбирают 1 см’ и переносят в третью пробирку, в которую стерильной пипеткой добавляют 9 см5 раствора желатино-фосфатного буфера, получая разведение 1:99. При ограниченном объеме исходной жидкости из нее готовят те же разведения, но получают вышеуказанные соотношения между исходной жидкостью и желатино-фосфатиым буфером, используя меньший объем исходной жидкости и раствора желатино-фосфатного буфера. С полученными разведениями исходной жидкости (или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом) ставят биологические пробы в порядке, приведенном в табл.1.

5.2.2.    Опытным путем подбирают такие разведения исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом, при введении которых погибают все мыши, и последующие разведения, при которых мыши не погибают.

Если использование 10-кратных разведений не приводит к гибели всех мышей ни в одном из разведений, то для определения титра ботулннического токсина готовят 6- или 4-кратные разведения исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом. По наибольшему разведению жидкости, вызвавшему гибель всех мышей, вычисляют число мышиных MLD ботулиничес-кого токсина в 1 см’ исходной жидкости с последующим пересчетом на продукт (приложение 1).

255

Страница 12

С. 10 ГОСТ 10444.7-86

5.3. Серологическое тннированне токсина С. botulinum

5.3.1.    Подтверждение присутствия и установление типа ботулинического токсина защитным тестом

5.3.1.1.    Присутствие ботулинического токсина в исходной жидкости обнаруживают путем постановки биологической пробы на мышах, защищенных иммунизацией противоботулиническими антитоксическими сыворотками типов А, В, Е (и, если представляется возможным, типов С. D. F, G). Сыворотка типа С должна содержать антитоксины типов С, и С2. Поливалентные сыворотки и типы поливалентных сывороток для опыта подбирают в зависимости от вида анализируемого продукта и предполагаемого типа ботулинического токсина в соответствии с комбинациями и порядком, приведенными в табл. 2 и 3.

5.3.1.2.    Для типирования с помощью защитного теста используют противоботулнннческие антитоксические типоспеиифические сыворотки, разведенные физиологическим раствором до концентрации 1 МЕ/см\ Разведенные сыворотки хранят при температуре <4±2) 'С в течение не более 10 сут.

Если при использовании сывороток, разбавленных до 1 МЕ/см*. установить тип ботулиническо-го токсина не удается, то биологическую пробу повторяют с сыворотками, разбавленными до концентрации 0.1 МЕ/см5.

При использовании противоботулинических антитоксических типоспецифическнх сывороток, содержащих 1 МЕ/см'. исходную жидкость (и/или исходную жидкость, обработанную протеолнтичес-ким ферментом) разводят буферным желатнно-фосфатным раствором в соотношениях, позволяющих получить не менее трех последовательных разведений жидкости, содержащей в 10, 100 и 1000 раз меньше MLD, чем обнаружено в исходной жидкости.

5.3.1.3.    При постановке защитного теста для типирования ботулинических токсинов каждому животному внутрибрюшинно вводят по 0.5 см3 моновалентной, двух-, трех- или поливалентной сыворотки. Для инъекции одного типа сыворотки или их смеси каждой группе животных применяют отдельный шприц. Через 60 мин после введения сывороток животным вводят исходную жидкость, подготовленную по п. 5.3.1.2. Введение животным исходной жидкости начинают с наибольшего ее разведения, используя один шприц для группы мышей, получивших моновалентную сыворотку одного типа или двух-, трех- или поливалентную сыворотку, состоящую из одной комбинации моновалентных сывороток.

5.3.1.4.    При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулиинческой интоксикации те мыши, которым введена сыворотка, не гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости. Погибают также мыши, которые получили гомологичную сыворотку в объеме, недостаточном для защиты от высокой дозы токсина. Мыши, получившие сыворотку, в состав которой входит моновалентная сыворотка, гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости, остаются живы. Если болеют и погибают все животные, то биологическую пробу повторяют, применяя более разбавленную исходную жидкость или ранее не использованные комбинации моновалентных сывороток.

5.3.2. Подтверждение присутствия и установление типа ботулинического токсина реакцией нейтрализации

Присутствие ботулинического токсина в исходной жидкости подтверждают реакцией нейтрализации с кониенгрированными противоботулиническими антитоксическими сыворотками в случаях, когда имеется для этого достаточное количество сывороток и исходная жидкость содержит более 4 мышиных MLD/cm3.

Допускается одновременное установление присутствия и типа ботулинического токсина, путем постановки развернутой реакции нейтрализации.

Концентрированные сыворотки применяют при необходимости с целью подтверждения присутствия ботулинических токсинов в исходной жидкости в наиболее короткий срок с наименьшим количеством животных без предварительного определения титра ботулинического токсина.

5.3.2.1. Дтя постановки реакции нейтрализации и типирования ботулинических токсинов концентрированными антитоксическими диагностическими противоботулиническими сыворотками используют сухие сыворотки, имеющие титр в пределах: для типа Л - 200-440 ME: для типа В —100-200 ME; для типа Е — 200—400 ME, по возможности реакция ставится с сыворотками типа С - 200-300 ME. типа F - 50 ME.

256

Страница 13

ГОСТ 10444.7-86 С. 11

Непосредственно перед использованием ампулы с сухими сыворотками вскрывают, добавляют в каждую ампулу I см3 дистиллированной воды и, легко встряхивая, добиваются полного растворения сыворотки. Затем сыворотки типов Л, В. С, Е разводят в 10 раз. а сыворотки типа F — в 5 раз физиологическим раствором. Хранят при температуре (4±2) *С в течение не более 10 сут.

5.3.2.2.    При использовании диагностических сывороток присутствие ботулинических токсинов в исходной жидкости или исходной жидкости, обработанной протеолнтическим ферментом подтверждают реакцией нейтрализации. Для проведения реакции нейтрализации в чистую пробирку стерильной пипеткой с грушей переносят 2.4 см' исходной жидкости или исходной жидкости, обработанной протеолнтическим ферментом. Затем в нее вносят по 0.12 см' сывороток пяти типов С. botulinum. или по 0,15см' сывороток четырех типов С. botulinum, или по 0,2 см'трех типов С. botulinum. Каждый тип сыворотки отбирают для приготовления поливалентной сыворотки отдельной стерильной микропипеткой. После выдержки в течение 30-45 мни прнготоапенную смесь вводят по 1 см5 белым мышам. В случае гибели животных реакцию повторяют с исходной жидкостью или жидкостью, обработанной протеолнтическим ферментом, разбавленной буферным желатино-фосфатным раствором в соотношении 1 : 9. а в случае необходимости - в большей степени. Результаты реакции оценивают по п. 5.3.1.4.

5.3.2.3.    Для установления типа ботулинического токсина с помошью диагностических сывороток стерильной пипеткой с резиновой грушей по 2,4 см3 исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолнтическим ферментом, разливают в несколько пробирок, затем в каждую пробирку отдельными стерильными пипетками добавляют по 0.6 см’ моновалентных сывороток для типировання ботулинического токсина одного типа, по 0.3 см3 моновалентных сывороток для типировання смеси ботулинических токсинов двух типов и по 0.2 см' моновалентных сывороток для типировання смеси ботулинических токсинов трех типов в соответствии с табл. 3.

В случаях, если необходимо избежать перекрестных неспеинфических реакций с негомологичны-ми сыворотками для разделения ботулинических токсинов типов Е и F, С и D и других типов, концентрированные сыворогки разводят до концентрации 1 (0.1) МЕ/см3.

5.3.2.4.    Для постановки развернутой реакции нейтрализации и типировання ботулинического токсина сыворотками после их разведения in vitro поступают следующим образом. В пробирку пипеткой с резиновой грушей переносят исходную жидкость или жидкость, обработанную протеолнтическим ферментом и, при необходимости, готовят одной пипеткой в пробирках серию разведений этой жидкости в соотношении, подобранном по п. 5.2.1. Затем другой пипеткой с резиновой грушей последовательно, начиная с наибатьшего разведения, переносят по 2,4 см' из каждого разведения жидкости в серию из нескольких пробирок. Количество пробирок для каждого разведения соответствует числу типов моно-, двух-, трех- и поливалентных комбинаций сывороток, используемых в реакции нейтрализации и типировании ботулинических токсинов. В каждую серию пробирок с разведенной исходной жидкостью, начиная с наибольшего разведения, стерильной пипеткой добавляют по 0.6 см3 моно-. двух-, трех- или поливалентной сыворотки одного состава. Приготовленные смеси выдерживают в течение 30-45 мин при комнатной температуре. После окончания выдержки по 1 см5 смеси, отобранной от каждой пробирки, вводят двум белым мышам. Мыши, которые получили смеси, содержащие моно-, двух-, трех- или поливалентные сыворотки, гоматогичные типу ботулинического токсина или нескольким типам ботулинического токсина, содержащегося в исходной жидкости, остаются живы: мыши, не получившие сыворотки гомологического типа, болеют и погибают с симптомами ботулинической интоксикации. Допускается одновременно подсчитывать титр токсина.

5.4.    Выявление С. botulinum

5.4.1. Для выявления С. botulinum питательные среды для высева навесок продукта выбирают по табл. 4, используя одну из сред, предложенных для высева 1-й навески, и одну из сред, предложенных для высева 3-й навески.

257

Страница 14

С. 12 ГОСТ 10444.7-86

Таблица 4

Схема посевов в питательные среды для выявления С. botulinum

Номер

Пищевой

Питательна1 среда

Обработка

Температура

млвески

продукт

для посева

носеион

тер моста! и рока • пня. "С

1

Любой, кроме консервов.

Печеночно-глицериновая:

Без обработки

36±1

при подозрении на присут

улучшенная клостридиальная;

ствие вегетативных клеток

из вареного мяса: Кигг-Та-

С. botulinum типов А, В. С, D.

роиии; бульон с кониной и

F. разлагающих казеин

мальтозой

Консервы

То же

То же

30±1

2

Любой, кроме консервов при подозрении на присутствие спор С. botulinum типов А, В. С. D, F, разлаппоших казеин

»

Прогрев (60±1) ‘С или при (80±1) ‘С в течение 15 мин

36±1

Консервы

То же

30±1

3

Любой при подозрении на присутствие С. botulinum типов В. С. D, Е. F. не разлагающих казеин

Триптиказо-пептонно-глю-козная с дрожжевым экстрактом: питательная для определения стерильности: Хотпш-гера; бульон с кониной и мальтозой — с добавлением трипсина

Без обработки

30±1-

4

Любой, при подозрении на присутствие спор С. botulinum типов В. С. D. Е. F, не разлагающих казеин; навеску продукта обрабатывают спиртом

То же. но без добавления трипсина

То же

30±1*

258

1

При подозрении на присутствие нсихрогрофных штаммов С. botulinum. посевы термосгатируют при (26± 1) *С.

Навески продукта вносят на дно сосуда с питательной средой. Одну из навесок обрабатывают перед посевом .лиловым спиртом (% % или абсолютным). Навеску смешивают с равным объемом спирта в колбе с притертой пробкой и. периодически встряхивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Навеску или осадок навески, обработанные спиртом, вносят в питательную среду. Посевы прогревают при температуре и в течение времени, приведенных в табл. 4. и помешают в термостат.

5.4.2. Посевы термостатирутот, наблюдая за появлением признаков роста микроорганизмов до 14 сут. После появления признаков роста микроорганизмов посевы продолжают выдерживать в термостате 5 сут. Через 5 сут после появления роста микроорганизмов посевы переносят в холодильник и хранят при (4±2) "С.

Развитие С. botulinum в питательных средах начинается со дна пробирки, с помутнения среды, которое равномерно распространяется по всему столбику жидкости, иногда отсту пая от поверхности на 0,5— 1.0 см, и сопровождается выделением пузырьков газа. Видимое газообразование может отсутствовать. Культуральная жидкость издает посторонний запах: гнилостный, сырный, масляно-кислый - от стабо выраженного до явного. С возрастом клетки С. botulinum частично лизируются. часто оседают на дно и помутнение среды исчезает.

Некоторые штаммы С. botulinum могут переваривать кусочки мяса. При развитии в смешанной культуре тс или иные признаки, характеризующие присутствие в культуральной среде С. botulinum. могут отсутствовать.

Страница 15

ГОСТ 10444.7-86 С. 13

Непосредственно после появления признаков роста микроорганизмов и затем на 3-е и 5-е сут из посевов отбирают пастеровской пипеткой со дна культуральную жидкость для окраски по Граму, окраски спор, фазово-контрастного микроскопирования и пробы на ка тал азу по ГОСТ 30425-97. В препаратах устанавливают морфологию бактерий, отмечают наличие типичных клострндиальных клеток, наличие и относительную интенсивность спорообразования и место локализации спор внутри клеток. За 18—24 ч культура С. botulinum образует грамположительные палочки с закругленными концами различной длины и ширины (приложение 1). При старении культуры в ней пояатяются клетки, не окрашивающиеся по Граму, и спорообразующие клетки обычно в виде ракеток и отдельные споры. Возбудители ботулизма в чистой культуре каталазу не образуют.

После появления признаков роста микроорганизмов пятидневную культуральную жидкость из всех посевов одновременно или последовательно исследуют на присутствие ботулинических токсинов и ботулннических протоксинов по п. 5.1.

Исследование начинают с тех посевов, в которых признаки развития С. botulinum выражены наиболее четко; исследование прекращают при обнаружении ботулинического токсина или ботулини-ческого протоксииа хотя бы в одном из посевов. В случае необходимости допускается начинать исследование культуральной жидкости раньше, но заключение об отсутствии ботулинического токсина может быть дано только на основании исследования пятидневной культуры.

Обнаружение в культуральной жидкости ботулинического токсина или протоксииа и клостриди-ачьных клеток указывает на присутствие в посеве токсигенного штамма С. botulinum. Устанавливают тип обнаруженного токсина или протоксииа и тем самым тип С. botulinum, присутствующего в посеве.

5.5. Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum

5.5.1.    Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum проводят при получении нечетких результатов по нейтрализации и (или типировании ботулннических токсинов в исходной жидкости).

5.5.2.    Культуру токсигенных штаммов С. botulinum выделяют одновременно с (или после) обнаружением ботулинического токсина и (или) мезофилышх клостриднй в продукте или в культуральной жидкости. Для выделения отбирают те части продукта или те посевы, в которых обнаружены спорообразующие клостриднальные клетки и в которых спорообразование протекаю наиболее интенсивно.

Жидкую фазу продукта или экстракт из продукта или культуральную жидкость отбирают пастеровской пипеткой из толщи продукта или со дна пробирки или флакона и по I -2 см ' переносят в три стерильные пробирки; продукт или культуральная жидкость первой пробирки предназначены для непосредственного высева на плотные питательные среды, второй — для высева после предварительного прогрева, третьей — для высева после обработки спиртом.

Содержимое второй пробирки прогревают при (60± 1) "С или при (80±1) *С в течение 15 мин.

Содержимое третьей пробирки смешивают с равным объемом спирта, укупоривая пробирку так. чтобы во время выдержки спиртовой смеси спирт не улетучивался из пробирки.

5.5.3.    Для выделения токсигенных штаммов С. botulinum применяют печеночно-желточный агар, желточный агар для анаэробов или агар кровяной с глюкозой или питательный агар с яичным желтком и лактозой. Продукт или культуральную жидкость отбирают из пробирок пастеровской пипеткой, наносят каплю на поверхность среды и втирают в нее шпателем, получая изолированные колонии. Для этого одним шпателем последовательно засевают три-четыре чашки Петри, перенося посевной материал шпателем изодной чашки в другую. Чашки с посевами термостатнруют при (30±1) *С — (36±1) *С в течение 48 ч в анаэробных условиях по ГОСТ 30425--97.

5.5.4.    На поверхности плотных сред С. botulinum образует выпуклые или плоские, гладкие или шероховатые, обычно немного расплывчатые колонии с ровными или разрезанными краями. На печеночно-желточном агаре колонии окружены «жемчужной* зоной (кроме типа G). которая повторяет конту р колоний; кроме этого, колонии С. botulinum типов А и В имеют обычно узкую, до 2 мм, зону преципитации, типов С, D, Е широкую до 4 мм, зону преципитации. На сахарно-кровяном агаре колонии С. botulinum типов А. В. С\ D, Е, F окружены зоной р-гемолиза. С. botulinum типа G гемолиза не дает.

Дтя подтверждения принадлежности выделенных колоний к клостридиям определяют отсутствие каталазы по ГОСТ 30425-97.

Бактериологической петлей из 5—10 колоний, имеющих характерные для С. botulinum свойства, отбирают посевной материал и переносят его соответственно в 5- 10 пробирок с питательными средами. посевы термостатнруют, устанавливают присутствие в них и тип С. botulinum.

259

Страница 16

С. 14 ГОСТ 10444.7-86

6. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

6.1.    Если при проведении биологической пробы хотя бы одна из особей мышей, получившая жидкий продукт, жидкую фракцию или экстракт из продукта, заболела с проявлением клинических симптомов, характерных для ботулинической интоксикации, и остались живы мыши, получившие прокипяченный жидкий продукт, прокипяченную жидкую фракцию или прокипяченный экстракт из продукта, то считают, что в продукте содержится ботулинический токсин.

6.2.    Если после предварительной обработки протеоднтическим ферментом обнаружен токсин или его количество в продукте увеличилось, то считают, что в продукте содержится ботулинический протоксин.

6.3.    Если при проведении биологической пробы все мыши остаются живы, то считают, что ботулинические токсины и протоксины в навеске проанализированного продукта содержатся в количестве менее X-MLD (где X-MLD - минимальное количество токсина, которое можно обнаружить в анализируемом продукте), или отсутствуют.

6.4.    Если мыши погибли ранее, чем через 2 ч после постановки биологической пробы с разведенной исходной жидкостью без проявления клинических симптомов ботулинической интоксикации, то указывают, что определить присутствие в анализируемом продукте ботулннического токсина по настоящему стандарту не представляется возможным.

6.5.    Если в результате защитного теста или реакции нейтрализации ботулинических токсинов или протоксинов протнвоботулнническими антитоксическими сыворотками мыши, получившие при постановке биологической пробы только исходную жидкость продукта, а получившие исходную жидкость продукта с моновалентной или двух-, трех- или поливалентной сывороткой, остаются живы, то считают, что в продукте содержится один или несколько ботулинических токсинов или протоксинов.

6.6.    Если нейтрализовать и/или типировать ботулинический токсин в продукте и/или в культуральной жидкости не удалось, то указывают, что при проведении биологической пробы мыши погибли с клиническими симптомами ботулинической интоксикации. При этом указывают также типы и концентрации использованных противоботупинических антитоксических сывороток, разведение продукта или культуральной жидкости и раствор, применяемый для получения экстракта продукта.

6.7.    Если при типированин ботулинических токсинов или протоксинов мыши, получившие исходную жидкость продукта, погибли с клиническими симптомами ботулинической интоксикации и не погибли мыши, получившие исходную жидкость продукта с противоботулиническнми антитоксическими тнпоспецифическими сыворотками, то считают, что в продукте присутствуют ботулинический токсин или смесь ботулинических токсинов тех типов, которым соответствует сыворотка, нейтрализовавшая токсин и предохранившая животных от гибели.

6.8.    Если проводилось титрование ботулннического токсина, то указывают количество (титр) обнаруженного токсина в 1 см5 или г продукта в единицах MLD.

6.9.    При обнаружении в культуральной жидкости посева хотя бы в одной из навесок продукта клостридий и ботулннического токсина или протоксина считают, что в продукте присутствует токси-генный штамм С. botulinum

Результаты исследования ботулннического токсина в культуральной жидкости посева продукта оценивают аналогично исследованию ботулинических токсинов в продукте.

6.10.    Если проводилось выделение токсигенных штаммов С. botulinum, то при обнаружении в посевах хотя бы одной колонии клостридий, способной образовывать ботулинический токсин или протоксин, считают, что в продукте присутствует токсигенный штамм С. botulinum.

При обнаружении в посевах колоний клостридий, не способных образовывать ботулинический токсин или протоксин, считают, что в продукте токсигенные штаммы С. botulinum отсутствуют. Результаты исследования ботулннического токсина в культу ральной жидкости выделенного штамма оценивают аналогично исследованиям ботулинических токсинов в продукте.

260

Страница 17

ГОСТ 10444.7-86 С. 15

ПРИЛОЖЕНИЕ I Обязательное

ТЕРМИНЫ. ПРИМЕНЯЕМЫЕ В НАСТОЯЩЕМ СТАНДАРТЕ И ПОЯСНЕНИЯ К НИМ

Термин

Пояснение

Исходная жидкость (ИЖ)

Исходная жидкость, обработанная ироте-олнтичеекпм ферментом (ИЖТ)

Ботулинические токсины типов А. В. С, D. Е. F. G

С. bolulinum

С. botulinum тины А, В. С, D. Е. F, G

С. botulinum типы А. В. С. D. F. рахяага-юшис казеин

С. botulinum типы С. D. не рахтатаюшие казеин

С. botulinum типы В, Е, F, не рахтагаюшие казеин

Жидкий продукт или жидкая фаза продукта, иди сю водный экстракт, или его экстракт в физиологическом растворе, или культуральная жидкость анаэробных посевов, полученные путем отстаивания и центрифугирования и (или) фильтрования продукта в соответствии с настоящим стандартом для исследования ботулинических токсинов

Исходная жидкость, обработанная иротсолитичсскнм ферментом трипсином или панкреатином для обнаружения в ней ботулинических протоксинов и определения тигра токсинов, полученных в результате такой обработки в соответствии с настоящим стандартом.

Комплекс белковых веществ, содержащий высокомолекулярный нейротоксический белок, образуемый С. botulinum типами А. В, С. D. Е, F, G. определяемый с помощью 'защитного теста или реакции нейтрализации с моно- или поливалентными специфическими антитоксическими сыворотками, и вызывающий заболевание человека, высших млекопитающих и птиц, протекающее с симптомами, характерными для ботулиничсс-кой интоксикации

Клостридии. подвижные палочки с закругленными концами, единичные, парные или в коротких цепочках, образующие овальные субгерминальные, иногда параиеигральные споры, обычно вздувающие клетку в виде ракетки или слабо выраженного веретена. В молодой культуре трамположительные. Каталаэоот-рицатсльныс. Образуют желатиназу: липазу, кроме типа G: способность сбраживать глюкозу, мальтозу и салицин варьируют. Лактозу, сахарозу, маннит не сбраживают, нитраты не редуцируют, индол не образуют. Углеводы сбраживают обычно с выделением кислоты и таза. Кислота при этом может нейтрализоваться NH ,. образующимся в процессе разложения С. bolulinum а зотсодержащих соеди нений

С. botulinum образующий токсин соответственно типов А. В. С, D, Е. F. G

С. botulinum. токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксическими иротивоботулиническими сыворотками типов А. В. С. D. F. Клетки 0,8— 1.3x4.4—8.6 мкм. Образуют споры без экзоспориума. Разлагают казеин. Сбраживают глюкозу, образуют H;S. Салицин, мальтозу сбраживают вариабельно. Не образуют лецитин азу. Оптимальная температура для роста от 30 до 40 ‘С.

С. botulinum. токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксическими иротивоботулиническими сыворотками типов С, D. Клетки размером 0.5—0.7х3.4—7,9 мкм. Образуют споры без экзоспориума. Сбраживают глюкозу, иногда мальтозу, салииин. H?S не образуют. Оптимальная температура для роста от 30 до 37 *С. Некоторые штаммы образую! лецитин азу

С. botulinum. токсины которых нейтрализуются соответственно антитоксических!и иротивоботулиническими сыворотками типов В. Е, F. Клетки размером 0.3—0,7хЗ,4—7.5 мкм. С. botulinum тины Е, F. образуют споры с эк зосиориумом. Споры С. botulinum Е имеют характерные подвески. Сбраживают глюкозу, иногда мальтозу. Отдельные штаммы образуют лецитин азу. Оптимальная температура для роста от 25 до 37 "С.


261

Страница 18

С. 16 ГОСТ 10444.7-86

Пояснение

Термин

С. botulinum тип G, разлагающий казеин

Морфология колоний С. botulinum типы А,

В. С. D. F. гидролизующие казеин. на агаре печеночном

Морфология колоний С. botulinum типы В. Е. F. не гидролизующие казеин, на агаре печеночном

С. botulinum типы С, D. не гидролизующие казеин, на агаре печеночном

С. botulinum run G на агаре печеночном

Минимальная легальная доза — MLD для мыши

Титр токсина и MLD в см ' или г продукта

С. botulinum. токсин которого нейтрализуется антитоксической нротнвоботулиннчсской сывороткой типа G. Клетки 1.3—1,9х 1,6—9.4 мкм. Споры, как правило, не уголшают спорангий. Казеин расщепляется медленно и слабо. Сахара не сбраживает. лсшшшазу, липазу не образует, гемолиза не дает. Образует H2S. Оптимальная температура для роста от 30 до 37 “С.

Колонии d ~ 3—8 мм, округлые с ризоидными краями, плоские с вогнутой серединой, серые, тусклые или слегка блестящие, прозрачные с непрозрачной серединой. Растут одинаково как при наличии, так и в отстутствии сбраживаемых углеводов.

Котонин мелкие и средние, d ■* 1—3 мм. круглые с неправильными выступающими краями, тусклые, полупрозрачные. В присутствии сбраживаемого углевода размер колоний существенно увеличивается

Котонин мелкие и средние, d ■» 1—3 мм, круглые с волнистыми краями, серовато-беловатые, гладкие, тусклые и прозрачные. Присутствие в средах сбраживаемых углеводов не влияет на их рост

Колонии очень мелкие, d •* 0.5—1.5 мм. круглые с ровными краями, выпуклые, серые, гладкие, блестящие. Добавление в среду углеводов не влияет на морфологию колоний

Минимальное количество токсина, вызывающее в течение 72 ч гибель всех белых мышей массой 15—20 г с характерными клиническими симптомами заболевания при внутрибрюшинном введении в биологическую пробу

Количество (титр) токсина в 1 г или см} продукта, культуральной жидкости или растворов, приготовленных из них. в MLD, вычисляют по формуле


V 10,


,V =


т


т\


'ЧгН


где 10„ — разведение исходной жидкости, взятое с обратным знаком:

т — масса навески продукта, ext5 или г;

V — обьем жидкости, используемый для экстрагирования токсина, cmj;

К, — обьсм жидкости, введенной каждой мыши, см3;

У11Ж — объем исходной жидкости, взятий для приготовления 6 или 4-х кратного разведения, ext1:

У3 — обьсм растворителя, взятый для приготовления 6 или 4-х кратного разведения исходной жидкости, см’;

ME — международная единииа активности ботулинических антитоксинов, соответствующая определенному количеству моновалентной противобогул и нической антитоксической сыворотки, способной нейтрализовать определенное количество гомологичного ботулини-ческого токсина.

262

Страница 19

ГОСТ 10444.7-86 С. 17

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Обязательное

ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ

Количество белых мышей, необходимых для постановки биологической пробы, при постановке защитного теста, проведении реакции нейтрализации и при гипированпи ботулинических токсинов с разведенными типоспснифичсскими сыворотками, равняется числу разведений исходной жидкости (с учетом использования при низком тигре ботулинического токсина исходной жидкости без разведения), умноженному на количество типов моновалентных двух-, трех- или поливалентных сывороток, применяемых для постановки защитною теста или реакции нейтрализации и нитровании ботулинических токсинов в исследуемом продукте, и умноженному на количество мышей в каждом варианте опыта — обычно на две особи.

По клеткам или банкам рассаживают белых мышей, помещая не более двадцати мышей одного пала в каждую клетку или банку. Во время постановки опытов перераспределения мышей по клеткам не допускается.

При проведении биологической пробы надевают резиновые перчатки, указательным и большим пальцами левой руки захватывают кожу мыши на затылке, а хвост и левую заднюю лапу удерживают между ладонью, четвертым и пятым пальцами. При этом мышь держат головой вниз так. чтобы кишечник сместился книзу от места укола. Место укола обрабатываюг спиртом. Правой рукой вводят иглу шприца в горизонтальном направлении между кожей и мышцами с левой стороны в задней трети живота, затем иглу слегка поворачивают в иергикальном направлении и осторожным движением продвигают' вперед. Момент проникновении иглы в брюшную полость ощущают по исчезающему под рукой сопротивлению. После проникновения иглы в брюшную полость большим пальцем правой руки медленно нажимают поршень шприца и. следя за градуировкой на цилиндре, вводят определенное количество жидкости в брюшную полость. Затем иглу вынимают, животное метят и помещают в клетку для наблюдения.

Допускается ставить биологическую пробу на белых мышах с помощником, который фиксирует животных.

Мышей метят путем окрашивания их шерсти по определенной схеме расгвором карболового фуксина, бриллиантового зеленого, раствором пикриновой кислоты либо фломастерами.

Одним цветом, основным (желательно красным) мстят мышей с 1 по 9 номер.

Двумя цветами — красным и дополнительным — желтым или зеленым — мстят мышей с двузначными номерами: с 10 до 99 включительно, причем десятки обозначают дополнительным цветом, а единицы — основным.

В зависимости от места окраски, пятна краски (желательно фуксина) соответствуют следующим условным номерам:

на левой передней лапе — 1, на левом боку — 2. на левой задней лапе — 3. на голове — 4. на спине — 5, у основания хвоста — 6, на правой передней лапе — 7. на правом боку — 8, на правой задней лапе — 9.

При комбинированной окраске двумя цветами разных мест получают любое двузначное число.

ПРИЛОЖЕНИЕ J

Справочное

ПОДГОТОВКА ШПРИЦЕВ И ИГЛ К ИСПЫТАНИЮ

При отсутствии стерильных шприцев непосредственно перед использованием шприцы кипятят. Для этого в дистиллированную или мягкую воду (без примеси соды) при комнатной температуре погружают раздельно поршень и цилиндр. Воду постепенно доводят до кипения и кипятят детали шприцев не менее 20 мин.

Иглы кипятят отдельно. В канал иглы вводят манлрен, погружают ее в 0.3—1 %-ный водный раствор углекислого натрия, постепенно доводят до кипения и кипятят не менее 20 мин. Прокипяченные детали шприца и иглы охлаждают до комнатной температуры и собирают.

263

Страница 20

С. 18 ГОСТ 10444.7-86

ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Справочное

ОТБОР ПРОБ ОТ ОСТАТКОВ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ И CbotuBaun

Пробы остатков продуктов, послуживших причиной отравления, отбирают в соответствии с указаниями органов здравоохранения. Если масса остатков продукта меньше 80— НЮ г, то от продукта отбирают 1—3 навески. массой не менее 1 г (см5): если количество продукта, отобранного для исследования, состаапяет 1 г (см1) и меньше, то из него гоговят одну навеску.

264

Заменяет ГОСТ 10444.7-75 ГОСТ 10444.8-75