Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Измерение концентраций действующих
веществ пестицидов в воде, почве, зеленой
массе, зерне и соломе зерновых культур,
семенах и масле рапса, зерне гороха,
семенах и масле льна
Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК
4.1.3020-12; 4.1.3022-12;
4.1.3042-12; 4.1.3045-12
Москва 2013
1. Разработаны сотрудниками ГНУ
«Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии, ФГУП «Всероссийский
научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева».
2. Введены в действие с момента утверждения.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Погрешность измерений. 2
2. Метод измерений. 3
3. Средства измерений,
вспомогательные устройства, реактивы и материалы.. 3
4. Требования безопасности. 4
5. Отбор и хранение проб. 4
6. Подготовка к определению.. 4
7. Проведение определения. 6
8. Проверка приемлемости
результатов параллельных определений. 7
9. Оформление результатов. 7
10. Контроль качества результатов
измерений. 8
11. Требования к квалификации
оператора. 9
12. Разработчики. 9
|
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
3 июля 2012 г.
Дата введения: с момента утверждения
|
4.1. МЕТОДЫ
КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Измерение остаточных количеств
эсфенвалерата
в семенах и масле рапса
методом газожидкостной хроматографии
Методические
указания
МУК 4.1.3022-12
Свидетельство о
метрологической аттестации от 24.02.2012 № 01.5.04.068/01.00043/2012.
Настоящие методические
указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в
семенах рапса (горчицы) массовой концентрации эсфенвалерата в диапазоне
концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в масле - 0,02 - 0,2 мг/кг.
Название действующего
вещества по ИСО: эсфенвалерат.
Название действующего
вещества по ИЮПАК:
(S)-α'-циано-3-феноксибензил-(S)-2-(4-хлорфенил)-3-метилбутират.
Структурная формула:
Эмпирическая формула: С25Н22ClNO3.
Молекулярная масса: 419,9.
Химически чистый препарат -
бесцветное кристаллическое вещество (до 23 °С).
Температура плавления: 59,0 - 60,2 °С.
Давление паров при 25 °С - 2 ∙ 10-4 mPa.
Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow log P = 6,22 (25 °С).
Растворимость: в воде при 25
°С - 0,002 мг/л;
в н-гексане - 10 - 50; метаноле - 70
- 100; в ксилоле, ацетоне,
хлороформе, этилацетате, DMSO, DMFA - > 600 (в г/кг при 25 °С).
Вещество относительно
стабильно на свету, стабильно к гидролизу при рН 5,7 и 9 (25 °С).
Краткая токсикологическая характеристика
Класс токсичности по ВОЗ - II, ЕПА - II.
Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс 75 - 88 мг/кг.
Область применения
Инсектицид широкого спектра
действия (группа пиретроидов), применяется на зерновых, масличных, плодовых и
других культурах.
1. Погрешность измерений
Методика обеспечивает
выполнение измерений с погрешностью, не превышающей ± 25 %, при доверительной
вероятности 0,95.
Метрологическая
характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.
Таблица 1
Метрологические
параметры
Диапазон измерений, массовая
концентрация, мг/кг
|
Показатель повторяемости (относительное
среднеквадратическое отклонение повторяемости), σr,
%
|
Показатель промежуточной прецизионности (относительное
среднеквадратическое отклонение в условиях вариации факторов «время»,
«оператор» в одной лаборатории), σRл,
%
|
Показатель воспроизводимости (относительное
среднеквадратическое отклонение
воспроизводимости), σR, %
|
Показатель точности*
(границы относительной погрешности при вероятности Р = 0,95), ± δ, %
|
Семена
от 0,01 до 0,1 вкл.
|
7
|
9
|
12
|
25
|
Масло
от 0,02 до 0,1 вкл.
|
7
|
9
|
12
|
25
|
Масло
от 0,1 до 0,2 вкл.
|
8
|
9
|
11
|
22
|
* Соответствует расширенной неопределенности Uотн. при коэффициенте охвата k = 2
|
Полнота извлечения
вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата
для полного диапазона концентраций (n = 20, Р = 0,95)
приведены в табл. 2.
Таблица 2
Полнота определения эсфенвалерата в
семенах и масле рапса (N = 5 для каждой концентрации)
Анализируемый объект
|
Предел обнаружения, мг/кг
|
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг
|
Среднее значение определения, %
|
Стандартное отклонение, S, %
|
Доверительный интервал среднего результата, ±,
%
|
Семена
|
0,01
|
0,01 - 0,1
|
82,4
|
4,6
|
4,2
|
Масло
|
0,02
|
0,02 - 0,2
|
77,4
|
4,9
|
4,5
|
2. Метод измерений
Методика основана на
извлечении эсфенвалерата из семян и масла рапса (горчицы) водно-ацетоновым
раствором или ацетонитрилом с последующей очисткой перераспределением между
двумя несмешивающимися
жидкостями и на колонке с флорисилом. Количественное определение проводят
методом газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного
детектора.
Нижний предел измерения
эсфенвалерата в пробе семян 0,01 мг/кг, масла - 0,02 мг/кг, средняя полнота
извлечения из семян 82,4 % и из масла 77,4 %.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Примечание. Допускается
использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими
характеристиками.
3.2. Реактивы
Аналитический стандарт
эсфенвалерата 99,8 %
|
|
Ацетон, чда
|
ГОСТ 2603-79
|
Ацетонитрил, хч
|
ТУ 6-09-3534-87
|
Азот газообразный в
баллонах с редуктором
|
ТУ 6-16-40-14-88
|
Бумажные фильтры «красная
лента»
|
ТУ 6.091678-86
|
Вода дистиллированная
|
ГОСТ 6709-79
|
Гексан, хч
|
ТУ 2631-003-05807999-98
|
Насадка для колонки:
хроматон N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5 % SE-30 или ХЕ-60 (Чехия)
|
|
Натрий сернокислый
безводный, ч, свежепрокаленный
|
ГОСТ 4166-76
|
Флорисил 150 - 250 µm (Merck, Германия), содержание воды ≤ 2,5
%
|
|
Хлороформ, чда
|
ТУ 2631-020-11291058-96
|
Этиловый эфир уксусной
кислоты, чда
|
ГОСТ
22300-76
|
Элюент для колоночной
хроматографии № 1: гексан-этилацетат (50:50 по объему)
|
|
Элюент для колоночной
хроматографии № 2: гексан-этилацетат (20:80 по объему)
|
|
Примечание. Допускается
использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аналитическая стеклянная
насадочная колонка длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм
|
|
Мельница лабораторная
зерновая ЛМЗ
|
ТУ 1-01-0593-79
|
Установка ультразвуковая
«Серьга»
|
ТУ 3.836.008
|
Ротационный вакуумный
испаритель Büchi R-200/205 (Швейцария) или аналогичный
|
|
Микрошприц МШ-10, МШ-10М
|
ТУ 2-833-106
|
Насос водоструйный
|
МРТУ 42 861-64
|
Колбы плоскодонные на
шлифах КШ500 29/32 ТС
|
ГОСТ
25336-82Е
|
Колбы круглодонные на шлифах КШ50
29-32 ТС
|
ГОСТ
25336-82Е
|
Воронки лабораторные В-75-110
|
ГОСТ
25336-82Е
|
Воронки делительные
ВД-3-500
|
ГОСТ 8613-75
|
Стаканы химические
|
ГОСТ
25336-82Е
|
Колонка стеклянная
хроматографическая длиной 25 см, диаметром 10 мм
|
|
Примечание. Допускается
применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими
техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При
проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные
для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ
12.1.007-76).
При выполнении измерений с использованием газового
хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила
электробезопасности в соответствии с ГОСТ
12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно
соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ
12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ
12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК
(ОБУВ), установленных ГН
2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.
Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ
12.0.004-90.
4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах
под давлением до 15 мПа (150 кгс/см2) необходимо соблюдать «Правила устройства
и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и
газопроводов под давлением» ПБ
03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем
понижающий редуктор.
5. Отбор и хранение проб
Отбор проб семян и масла
рапса (горчицы) - ГОСТ
10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
Для длительного хранения
семена рапса (горчицы) подсушивают при комнатной температуре в отсутствие
света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы семян
доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла рапса хранят в
холодильнике при 0 - 4 °С в закрытой
стеклянной таре не более 2 месяцев.
6. Подготовка к определению
6.1. Подготовка и очистка реактивов и
растворителей
Перед началом работы
рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для
этого 100 мл
растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С
до объема 1,0 см3 и
хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку
растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.
6.2. Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super
(0,125 - 0,160 мм) с 5 % SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе
инертного газа (азот) при температуре 250 °С в течение 8 - 10 ч.
6.3. Приготовление стандартного и градуировочных растворов
Берут точную навеску
эсфенвалерата (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 см3,
растворяют навеску в ацетоне и доводят до метки (стандартный раствор с
концентрацией 1,0 мг/см3).
Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему,
используя для разбавления гексан. Стандартный
раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 6
месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.
Для внесения в образец при
определении полноты извлечения используют градуировочные растворы.
6.4. Построение градуировочного графика
Для построения
градуировочного графика (площадь пика - концентрация эсфенвалерата в растворе)
в хроматограф вводят по 1 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных
измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых
концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости
среднего значения высоты (площади) пика от концентрации эсфенвалерата в
градуировочном растворе (мкг/см3).
Методом наименьших квадратов
рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в
уравнении линейной регрессии:
С =
KS, где
S - площадь
пика градуировочного раствора.
Градуировку признают
удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается
не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику
необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или
элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате
контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость
признают стабильной при выполнении следующего условия:
где
С - аттестованное значение массовой концентрации эсфенвалерата в градуировочном растворе;
Ск - результат
контрольного измерения массовой концентрации эсфенвалерата в градуировочном
растворе;
λконтр. - норматив
контроля градуировочного коэффициента, % (λконтр. = 10 % при P = 0,95).
6.5. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта
В нижнюю часть стеклянной
колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты
и вносят суспензию 4,5 г флорисила в 20 см3 смеси гексан-этилацетат (1:1, по
объему), дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают
25 см3 этой же смеси со скоростью 1 -
2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
6.6. Проверка хроматографического поведения эсфенвалерата на колонке
с флорисилом
В круглодонную колбу емкостью 10
см3 отбирают 0,5 см3 стандартного раствора эсфенвалерата
с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током теплого
воздуха, остаток растворяют в 2 см3
элюента № 1 и вносят в колонку. Колбу обмывают еще 2 см3 элюента № 1
и также вносят в колонку. Затем промывают колонку 25 см3 гексана и
элюируют эсфенвалерат 60 см3
элюента № 2 со скоростью 1 - 2 капли в
секунду. Отбирают фракции по 10 см3 каждая, упаривают досуха,
остаток растворяют в 2 см3 гексана и анализируют на содержание
эсфенвалерата по п. 2.6.4. Фракции, содержащие
эсфенвалерат, объединяют, упаривают досуха,
остаток растворяют в 2 см3 гексана и анализируют по п. 2.6.4.
Рассчитывают содержание эсфенвалерата в элюате, определяя полноту вымывания
вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.
Примечание. Профиль вымывания
эсфенвалерата может меняться при использовании новой партии сорбента.
6.7. Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех
приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями
технической документации.
7. Проведение определения
7.1.
Экстракция эсфенвалерата из семян
рапса
Навеску измельченных на лабораторной мельнице семян
массой 10 г помещают в коническую колбу на 250 см3, заливают 50 -
100 см3 смеси растворителей ацетон-вода (в соотношении 1:1) и
экстрагируют эсфенвалерат в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Экстракт
фильтруют через бумажный фильтр («красная лента»). Экстракцию повторяют дважды
30 см3 той же смеси. Объединенный фильтрат помещают в делительную
воронку и переэкстрагируют эсфенвалерат гексаном трижды порциями по 30 см3.
Объединенные гексановые экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого
натрия. Полученный раствор выпаривают на ротационном испарителе при температуре
бани 50 °С до полного удаления гексана. Далее проводят очистку экстрактов по п.
7.3.
7.2. Экстракция эсфенвалерата из рапсового
масла
Навеску масла 10 г растворяют в 60 см3
гексана и экстрагируют эсфенвалерат 50 см3 ацетонитрила в УЗ-ванне в течение 15 мин. Полученную смесь помещают в делительную воронку
объемом 250 см3. После расслоения* нижний ацетонитрильный
слой сливают, из верхнего гексанового слоя
экстрагируют эсфенвалерат ацетонитрилом еще дважды порциями по 30 см3.
К объединенному ацетонитрильному экстракту
добавляют воду в соотношении ацетонитрил-вода
(1:4) и переэкстрагируют эсфенвалерат
хлороформом трижды порциями по 30 см3. Объединенные хлороформные
экстракты сушат над безводным серно-кислым
натрием и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 50 °С. Сухой остаток растворяют в 5 см3 ацетона и
помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С на 2 ч. Охлажденный ацетоновый раствор декантируют в
круглодонную колбу на 10 см3 через
фильтр «красная лента», после чего фильтр промывают 2 см3 ацетона.
Полученный раствор упаривают на ротационном
испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона.
Далее очистку проводят по п. 7.3.
______________
*
В случае образования сравнительно стойких эмульсий можно добавить несколько мл
насыщенного раствора хлористого натрия или этилового спирта.
7.3. Очистка экстрактов на колонке с флорисилом
Остаток в колбе, полученный при упаривании
очищенных по пп.
7.1 и 7.2 экстрактов семян или масла, количественно переносят
двумя порциями по 2 см3 смеси гексан-этилацетат
(1:1, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 6.2). Промывают колонку 25 см3
гексана, элюат отбрасывают. Эсфенвалерат
элюируют 60 см3 элюента № 2
(гексан-этилацетат = 2:8). Весь элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100
см3. Раствор выпаривают досуха на ротационном испарителе при
температуре не выше 50 °С. Сухой остаток растворяют в 1 - 2 см3 гексана и 1 мм3 раствора
вводят в хроматограф.
7.4. Условия
хроматографирования
Газовый хроматограф
«Цвет-550М» с ДПР (ДЭЗ).
Колонка стеклянная 1
м×3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5 % SE-30.
Температура колонки 240 °С,
испарителя 250 °С, детектора 320 °С.
Скорость газа-носителя (азот)
через колонку 46 см3/мин.
Шкала электрометра 8 ∙
1010 (16 ∙ 1010).
Объем вводимой пробы 1 мкл.
Время удерживания
эсфенвалерата 3 мин 20 с.
Линейный диапазон
детектирования 0,1 - 2 нг.
7.5. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят
методом абсолютной калибровки, содержание эсфенвалерата в образце семян или
масла (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
где
Н1 - высота
(площадь) пика эсфенвалерата в стандартном растворе, мм (мв ∙ с);
Н2 - высота
(площадь) пика эсфенвалерата в анализируемой пробе, мм (мв ∙ с);
V - объём экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
Р - навеска анализируемого образца, г;
С - концентрация эсфенвалерата в стандартном растворе, мкг/см3.
Содержание остаточных
количеств эсфенвалерата в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2
параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие,
чем стандартный раствор эсфенвалерата 2 мкг/см3, разбавляют.
8. Проверка приемлемости результатов параллельных
определений
За результат анализа принимают среднее
арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между
которыми не превышает предел повторяемости:
где (1)
X1, X2 - результаты
параллельных определений, мг/кг;
r - значение предела повторяемости (r = 2,8σr).
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела
повторяемости,
устраняют их и вновь выполняют анализ.
9. Оформление результатов
Результат анализа
представляют в виде:
(X ± Д) мг/кг при
вероятности Р = 0,95, где
- среднее
арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
Δ - граница абсолютной
погрешности, мг/кг:
где
δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в
соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание
компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат
анализа представляют в виде:
содержание вещества в пробе «менее
нижней границы определения» (например: менее
0,01 мг/кг*, где «*»
- 0,01 мг/кг - предел обнаружения в
семенах рапса).
10. Контроль качества
результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и
воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ
Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность
(правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
10.1. Стабильность результатов измерений
контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных
растворов.
10.2. Плановый внутрилабораторный оперативный
контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Сд должна
удовлетворять условию:
где
- характеристика
погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая
содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания
компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
Δл = ±0,84Δ, где
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
где
δ - граница относительной погрешности методики
(показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по
формуле:
Кк = Х' - Х - Сд, где
X', X, Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений
(признанных приемлемыми по п. 4)
содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация
добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К
рассчитывают по формуле:
Проводят сопоставление
результата контроля процедуры (Кк) с
нормативом контроля (К).
Если результат контроля
процедуры удовлетворяет условию
(2)
процедуру анализа признают
удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При
повторном невыполнении условия (2)
выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают
меры к их устранению.
10.3. Проверка приемлемости результатов
измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между
результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно
превышать предел воспроизводимости (R):
где (3)
X1, Х2 - результаты
измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
11. Требования к квалификации оператора
Измерения в соответствии с
настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы
методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально
соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений
по п. 10.
12. Разработчики
Цибульская И.А., Копытова Ф.И., Долженко О.В.
(ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений»
Россельхозакадемии (ГНУ ВИЗР), Санкт-Петербург, Пушкин).