МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по обнаружению, идентификации и определению содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье.

ЗПЧ-Ь7

Москва — 1984 г.

Методические указания предназначены для лабораторий саннтарно - эпидемиологических станций и институтоо гигиенического профиля при контроле за загрязнением пищевых продуктом Т-2 токсином.

Разработаны » лаборатории энзимологии питания Института питания АМН СССР (рук. лаборатории доктор медицинских наук Тутельян В. А., старший научный сотрудник, кандидат химических наук Эллер К-И., младший научный сотрудник Собачен В. С.)

Заполненная карта направляется по ад-росу: 109240, Москва, Устьинский проезд, 2/14    ^

институт питания АМН СССР, научно-организационный отдел.

организации, где за

полняется карта)

КАРТА ОБРАТНОЙ СВЯЗИ

К ^Методическим указаниям по обнаружению, идентификации и определению содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье".

X, Принято к внедрению В практику санэлидслужб (где и когда)

2. Подученный положительный аффект (проведены анализы на содержание Т-2 токсина» получены конкретные данные)

3, Материалы яе могут быть использованы по следующим причинам (указать причины) _

4. Ваш замечания и пожелания

Подпись

Должность

Ро«*#0р, г, ДЯ1*хСэгл, тип М13, з*к- 44'f‘?-tO0O/&'

'ТГВЕРЖДАЮ'*

Заместит ель Главно го

г осударственногс санитарного

врача СССР /

t' -4--UA

(Ко вшил о B.S.)

29 декабря 1984 г,

£ 3184-84

меящщехжие: УКАЗАНИЯ

ПО ОШАИШИЮ, ВДЕНтаИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕИАНШ Т-2 ТОКСИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ.

Т-2 токсин - 8-(3-метилбутирйлокеи)«4Д5-диацетокси-Х2ДЗ-эпок-ситршсотец-9-ен-З-ол - микотоксин, продуцируемый различными видами микроскопических грибов рода ГиаагЗлш. Наиболее распространенными продуцентами Т-2 токсина являются грибы Fusaxiua ярого trichi ©На, которые рассматриваются как этиологический фактор тяжелых алиментарных токсикозов человека и сельскохозяйственных животных.

Т-2 токсин является одним из наиболее токсичных представителей группы трихотеценовых микотоксинов, токсическое действие которых характеризуется поражением кроветворных и имыунокошштектннх органов, развитием геморрагического синдрома, лейкопенией, анемией, поражением функций желудочно-кишечного тракта. Т-2 токсин обладает высокой острой токсичностью для различных видов млекопитающих от 3 до 10 мг/кг массы тела).

Опасность, которую трихотеценовне микотоксины могут представлять для здоровья человека, связана с повсеместной распространенностью грибеа-продуцеитов, преимущественно поражающих зерно и аернопродук-' ты, и их высокой токсичностью, g связи с этим установлена ЦЦК на содержание Т-2 токсина в пищевых продуктах на уровне ОД мг/кг.

Т-2 токсин (С^Нз^) - белое кристаллическое вещество моле-

I

кулярной массой 466, не имеет максимумов поглощения в УФ-спектре при длине волны более 210 нм, не обладает флуоресценцией. Т-2 токсин хорошо растворим в бензоле, ацетоне, этил ацетате, спиртах, практически нерастворим в воде и гексане* Температура плавления Т-2 токсина 151-152° С.

Для обнаружения Т-2 токсина при тонкослойной хроматографии (TGX) используется его свойство флуоресцировать в длинноволновом УФ-свете (365 нм) после обработки спиртовым раствором серной кислоты с последующим нагреванием при 100-105° С, Этим методом можно обнаружить до 100 кг Т-2 токсина в пятне. Наиболее достоверным и высокочувствительным методом обнаружения и идентификации Т-2 токсина является газожидкостная хроматография (ТОО его летучих производных с использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ), который позволяет обнаруживать до 1-2 нг токсина в пике.

В основу предлагаемого метода определения Т-2 токсина положена ГЖХ тркфторацбтильного (ТФА) производного этого токсина о использованием ДЭЗ.

Предел обнаружения Т-2 токсина при ПКХ о использованием ДЭЗ -до 1-2 нг во входе, общий предел обнаружения метода - до 50 мкг/кг (0,05 мг/кг), относительное стандартное отклонение - 0,2-0,25.

Продолжительность анализа - 4 часа*

Метод включает следующие этапы:

-    экстракцию Т-2 токсина из образца смесью ацетонитрил-4# водный раствор хлористого калия (9:1);

-    очистку экстракта с помощью жедкость-жедкостной экстракции гексаном и бензолом н препаративной TGX;

-    разделение, идентификацию и количественное определение Т-2 токсина в виде ТФА производного с помощью ГЯХ с использованием ДЭЗ.

2

ОБОРУДОЙЛНКЕ И МАТЕРИАЛЫ

(, Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6с по ТУ 64-1-2451-78.

2.    Ротационный испаритель с ловушкой пс ТУ 25-11-917-76 (эазод "Хкмлабприбор").

3.    Кофемолка ЗКМ-ЗУ,

4.    Хроматограф газовый серии ‘’Цвет - 100^м с детектором постоянной скорости рекомбинации (ДЭЗ); колонка стеклянная 1 к х 0,4 см с

жидкой фазой ov -Г или ov -101 на Хромагоне и -супер ('Чахема¹'.

ЧССР): в качестве самописца - регистрирующий потенциометр КСП-4

модификация 41.130.90.909 или 4X.J40.90,910 с диапазоном измерений

I мВ; газ-носитель и продувочный газ - азот особой чистоты,

5.    Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-IOSO-78 или диагностическая лампа ОДД-41,

О. Магнитная мешалка любого типа.

7.    Микрошприц МШ-10 на 10 мкл, микрошприц МШ-1 или Тазохром-ШГ’ на X мкл.

8.    Камеры для ТСХ с притертыми крышками (например, стеклянные четы рехуголмаю сосуда 196 х 19о х 20О завода "Дружная горка").

9.    Пластины для ТСХ "Силуфол* размером 20 х 20 см (ЧССР).

Ю. Вороши делителькые Щ 2-250 пс ГОСТ 8613-75,

IX.Колбы плоскодонные конические на 250 мл с tfll 29, тип КнКШ 250-29/32 но ПОСТ 10394-72,

12. Колбы хруглодоннне на 250 мл с НШ 29, тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10994-72.

13. Колбы грушевидные на 50 мл о НШ 14,5, тип ГрИШ-50-14/23 ио IYX7T 10094-72,

^!4.Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

15.Цилиндры мерные на 100 ил с притертой пробкой, тип 2-100 по IDCT 1770-74.

3

16. Распылитель стеклянный с грушей.

17. Т-2 токсин кристаллический, ноиер по каталогу Т 4887, фирма "Сигма", США (по поводу получения стандарта Т-2 токсина обращаться в Институт питания АМН СССР).

18. Ацетонитрил V по ТУ 6-09-3534-74.

Ю.Ацетон "ада" по ГОСТ 2603-79.

20. Беизол "ада" по ГОСТ 5955-75.

21.    Гексан "ч" по ТУ 6-09-3375-78.

22. Метанол "ада" по ГОСТ 6995-77.

23. И. о-пропиловый спирт (пропанол-2) "хч" по ТУ 6-09-402-75.

24. Кислота оерная "ада" по ГОСТ 4204-77.

25. Калий хлористый "ада" по ГОСТ 4234-77.

26. Натрий сернокислый безводный "ада" по ГОСТ 4166-76.

27. Натрий углекислый "ада" по ГОСТ 83-79, свежапрокаленный.

28. Трифторужоуоный ангидрид "ч" по ТУ 6-09-4Z35-75.

I, ЭКСТРАКЦИЯ.

При отборе пробы для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТа J2430-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе". Отобранную пробу измельчав? в течение 1-2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 20 г намельченного продукта поменяют в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 10 мл 4М раствора хлористого калия и 90 мл ацетонитрила, Вотряхиваня на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 70 мл фильтрата (аликвота соответствует 14 г исходного образца).

4

2. ОЧИСТКА ЭКСТРАКТА

2.1.    Жадность-жидкостная экстракция.

В делительную воронку на 250 или 500 мл переносят 70 ил фильтрата, добавляют 50 ил гекоана (или гептана). После встряхивания и разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Низший ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с 40 ил гексана, каждый раз отбирая верхний гексановый слой. Ацетонитрильный слой разбавляют 17 ид дистиллированной воды и экстрагируют 50 и 25 ыл бензола. Верхние бензольные сдои отделяют и сушат безводный сернокислым натрием (10-15 г) в течение 0,5 часа. Раствор фильтруют через химическую воронху о кусочном ваты в круглодонну» колбу на 250 мл о НШ 29. Сернокислый натрий промывают 10 их бензола и отфильтровывают бензол в ту же хруглодонную холбу. Упаривают бензольный раствор на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше ®-50°С досуха. Остаток растворяют в 200-300 ыхх бензола и очищают о помощью препаративной ТСХ (раствор А).

2.2,    Очистка о помощью препаративной ТСХ.

Пластику "Сихуфол* (20 х 20 см) размечают в соответствии о рис Л. В правом я левом нижних углах пластинки на рас стоянки 1,5 ом от краев наносят по 5 мхл стандартного раствора Т-8 токсина в бензоле (по 500 нг Т-2 тококва). Параллельно иихнаыу крез» плаотинхя на расстоянии 1,5 ом от нижнего крал равномерно наносят о помощью иприца на 10 ыхл раотвор А в ввде прямой линии инрнной не более 3 ми.

После нанесения всего раствора А в хруглодонную колбу добавляют еще 100-150 мхл бензола к наносят бензольную промывку на ту же прямую линию. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смеоьв гексан -иао-вропмовый спирт (7*2). Развивают шаотжву до достижения фронтон растворителя карандашной линии, проведенной в 1,5 см от верх-

5

него края ллаотинки. Пластинку навлекает из камеры л высушивают. Разрезают пластинку по линиям Л и Б. Узкие полоски пластинки с* нанесенным раствором Т-2 токсина опрыскивают 20* раствором серной кислоты в метаноле. Пластинки выдерживает в сушильном шкафу при 10б°С в течение 1-3 минут и рассматрквают в длинноволновом УФ-све-те. Пятня Т-2 токсина (бело-голубая флуоресценция,!^ 0,6-0,7) обводят тонкой карандашной линией. Затем узкие полоски прикладывают к пластинке с нанесенным экотрактом и отмечают на этой пластинке зону, соответствующую хроматографической подвижности стандарта Т-2 ч ската, Ширина воны доята быть примерно не 7 мм (о младой стороны) болью* протяженности пятна стандарта Т-2 токсина в направлении развития хроматограммы( зону отмечают в виде 2 карандадашс линий, параллельных нижнему краю пластинки. Силикагель и» отмеченной зоны соскабливают о помощью скальпеля или шпателя в пробирку на 6 мл, приливают 4 мл смоси бензол-ацетон (1:1) и встряхивают. Суспензию силикагеля фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в грушевидную колбу на 60 мл с НШ 14,5. Силикагель повторно (2x4 мл) промывают смесью бензол-ацетон (1:1). Объят пенные бен-эол-яцетоиовые экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток переносят 200 мкд бензола в пробирку на 5 мл о Hi 14,6 (раствор В).

3. ОШАРУЖЕНИЕ, дашищш Н ШРЕЩЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ Т-2 ТОКСША.

3,1, Приготовление стандартного раствора Т-2 токсина,

Н&веоку 10 мг кристаллического Т-2 токсина помещают в мерную колбу на 100 мд и доводят до метки бензолом. Концентрация Т-2 токсина в стандартном растворе составляет 100 нг/мхл или 100 мкг/мл.

6

Раствор хранит в холодильнике при температуре не выше to⁰ С* Срок годности стандартного раствора - до 2 лет.

3.2,    Получение 'ГФА производных*

а)    получение ТФА производного стандарта Т-2 токсина.

В мерную пробирку на о мл с НШ 14*5 добавляют SO мкл стандартного раствора Т-2 токсина в бензоле, добавляют 250 мкл бензола, 30-6Q мг свежеяро каленного углекислого натрия и 50 мкл трифторуксусного ангидрида. Пробирку ллотно закрывают стеклянной притертой пробкой и перемешивают при 20-25° С в течение 0,5 часа на магнитной мешалке (в пробирку предварительно помещают “гвоздик* для перемешивания -кусочек металлической канцелярской скрепки длиной 3-4 мм, запаянный в стеклянный капилляр), Содержимое пребирки разбавляют бензолом до I мл я фильтруют черев химическую воронку с кусочком ваты в другую пробирку на 5 мл о НШ 14,5, углекислый натрий на фильтре промывают 0,5 мл бензола. Объединенные бензольные фильтраты упаривают досуха В слабой струе азота (при отсутствии баллона о азотом можно упарить досуха на ротационном испарителе). Остаток растворяют в 200 мкл бензола и анализируют с помощью ПКХ,

б)    получение ТФА производных (экстракта,

К 300 мкл бензольного раствора очищенного вкстракта (раствор Б) добавляют углекислый натрий и трифторухсуеиый ангидрид и проводят получение ТФА производных аналогично пункту 3.2.а.

3.3,    ПКХ анализ ТМ производных.

Условия ПЙХ анализа: температура колонки - 200°, температура испарителя - 235°, температура термостата детектора - 270°, скорость газа-носителя - 90-100 мл/мин, скорость продувочного газа -190-200

го

мл/мин, шкала чувствительности - 2 х Ю"^А А (на блоке ИКГГ).

В газовый хроматограф с помощью июсрошлрица на I мкл пооледова-

тельно вносят 0,2 и 0,5 мкл (соответствуют 5 я 12,5 нг Т-2 токсина) раствора ТФА-проиэводного стандарта Т-2 токсина в 200 мкл бензола (пункт 3.2,а.). В каждом случае регистрируют время удерживания (в данных условиях порядка 5-6 минут) и определяют площадь пика ТФА Т-2 токсина (в _ст). Площадь пика определяют умножением высоты пика на ширину пика на половине его высоты. Затем в газовый хроматограф вносят 0,5-1,0 мкл раствора ТФА производного экстракта (пункт 3.2.6,). При наличии пика, соответствующего по времени удерживания ТФА производного Т-2 токсина, определяют его площадь

<* обр^*

Содержанке Т-2 токсина в исходном образце определяют по формуле:

V ,*Т ,*5    *    т    _

О -    ■    ■    (мкг/хг),    где

^v t^т 4 ⁵ ст ^м

5    -    площадь    пика    ТФА    производного Т-2 токсина в экотракте, в

ММ*;

5 ₀₉ - площадь пика ТФА производного стандарта Т-2 токоина, в мм*;

м _еу - масса стандарта Т-2 токоина, внесенная в хроматограф, в нг (б или 12,5 нг);

М - масса исходного образца, в г (20 р);

Т |    -    объем    экстрагирующего растворителя, в мл (100 мл); ^

Т g - объем фильтрата, взятый для анализа, в мл (70 мл);

Т g - объем бензольного раствора ТФА производного экстракта, 8 мкл (200 мхлН

Т 4    -    объем    бензольного    раствора ТФА производного экстракта, вне -

внесенный в хроматограф, в мкл.

8