МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии

СТ РК ИСО 13493 - 2007

ISO 13493:1998 Meat and meat products. Determination of chloramphenicol content. Method using liquid chromatography, (IDT)

Издание официальное

Комитет по техническому регулированию и метрологии Министерства индустрии и торговли Республики Казахстан (Г осстандарт)

Астана

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН республиканским государственным предприятием «Казахстанский институт стандартизации и сертификации» Комитета по техническому регулированию и метрологии Министерства индустрии и торговли Республики Казахстан на основе собственного аутентичного перевода стандарта ISO, указанного в пункте 3

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ приказом председателя Комитета по техническому регулированию и метрологии Министерства индустрии и торговли Республики Казахстан от 03.07.2007 года № 374

3    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 13493-1998 «Мясо и мясные продукты. Определение содержания хлорамфеникола. Метод жидкостной хроматографии» (ISO 13493:1998 «Meat and meat products - Determination of chloramphenicol content - Method using liquid chromatography»).

Редакционные различия касаются включения в разделы 5 и 6 применяемых материалов и аппаратуры, указанных в стандарте ИСО, а также расширения перечня нормативных ссылок, относящихся к указанным материалам и аппаратуре. Редакция, отличная от ISO 13493:1998, выделена в тексте курсивом.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного стандарта для приведения в соответствие с СТ РК 1.5-2004. Кроме того, в наименование стандарта добавлено в скобках слово (левомицетина), являющегося синонимом названия антибиотика хлорамфеникола, общепринятого в Республике Казахстан.

4 СРОК ПЕРВОЙ ПРОВЕРКИ    2013    год

ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПРОВЕРКИ    5    лет

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Комитета по техническому регулированию и метрологии Министерства индустрии и торговли Республики Казахстан

СТ РК ИСО 13493 - 2007

9.6.3 Измерение

Измеряют высоты или площади хроматографических пиков хлорамфеникола испытуемого раствора и стандартных растворов хлорамфеникола.

Характеристики, полученные для стандартных растворов хлорамфеникола, должны продемонстрировать линейную зависимость от концентраций хлорамфеникола в этих растворах.

Примечание — С помощью диодно-матричного детектора может быть подтверждено обнаружение хлорамфеникола при его содержании в образце более 10 мкг/кг.

10 Обработка результатов измерений

Содержание хлорамфеникола в гомогенизированном испытуемом образце рассчитывают по формуле:

/г х р xV, х К

со = —--^!--

h_sxmxV₂

где ft) - содержание хлорамфеникола, в микрограммах на килограмм, гомогенизированного испытуемого образца;

И - высота или площадь пика в единицах длины или площади, измеренные для испытуемого раствора;

h_s - высота или площадь пика, измеренные для одного из стандартных растворов (5.9);

р - содержание хлорамфеникола в стандартном растворе, мкг/см³,

т - масса испытуемой пробы (9.2), г;

V\ - объем водной фазы (9.3), полученной после гомогенизации, см³ (V\ = 40 см³ + объем воды в пробе, взятой на испытание);

V2 - объем фильтрата (V2 = 20 см³), перенесенного (по 9.4) в экстракционный картридж, см³;

Уз - объем воды (Уз = 400 мм³), добавленный (по 9.5) к сухому остатку, мм³.

Результат вычислений округляют до 0,1 мкг/кг.

Результат испытаний нельзя корректировать на аналитическую открываемость. Аналитическая открываемость должна быть указана в протоколе испытаний (раздел 12).

11 Прецизионность (по ГОСТ ИСО 5725-1 и ГОСТ ИСО 5725-2)

11.1 Межлабораторные испытания

Прецизионность метода была установлена в процессе межлабораторных испытаний, выполненных в соответствии с ISO 5725 [1].

Результаты этих межлабораторных испытаний были опубликованы [2]. Эти результаты не могут быть распространены на области концентраций и на матрицы (фон), отличающиеся от указанных в настоящем стандарте.

7

Результаты других межлабораторных испытаний, приведенных в соответствии с ISO 5725, показывают, что аналитическая открываемость для мяса, мяса птицы и мясных продуктов воспроизводима и равна, примерно 55 %.

11.2 Повторяемость

Абсолютное значение разности результатов двух независимых единичных испытаний, выполненных за короткий промежуток времени одним методом для одного измельченного образца в одной лаборатории одним оператором на одном и том же оборудовании, может превышать 2,1 мкг/кг не более чем в 5 % случаев при содержании хлорамфеникола в образце 10 мкг/кг.

11.3 Воспроизводимость

Абсолютное значение разности результатов двух независимых единичных испытаний, выполненных одним методом для идентичного измельченного образца в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, может превышать 4,9 мкг/кг, не более чем в 5 % случаев при содержании хлорамфеникола 10 мкг/кг.

12 Протокол испытания

В протоколе испытания необходимо указать:

-    информацию, необходимую для полной идентификации образца;

-    использованный метод отбора образцов (если известен);

-    использованный метод испытаний с указанием ссылки на настоящий стандарт;

-    условия проведения испытаний, не отраженные в настоящем стандарте или считающиеся неоднозначными, а также все имевшие место случаи, которые могут повлиять на результаты испытаний;

-    полученный результат испытаний или два результата испытаний, если проводилась проверка повторяемости;

-    аналитическая открываемость.

8

СТ РК ИСО 13493 - 2007

Приложение

(справочное)

Библиография

[1]    ISO 5725:1986 Precision of test methods. Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.

[2]    Aerts M.L., Keukens H.J., Werdmuller G.A. Liquid Chromatographic Determination of Chloramphenicol Residues in Meat: Interlaboratory Study. J.AOAC, 72, (4), 1989, pp. 570—576

9

Басута_ж.    кол койылды Ппшм1 60x84 1/16

Кдтазы офсет к. K,apin Typi «KZ Times New Roman», «Times New Roman»

Шартты баспа табаты 1,86. Таралымы_дана. Тапсырыс

«Казахстан стандарттау жэне сертификаттау институты» республикалык мемлекетпк кэслпорны 010000, Астана каласы Есш езенш1н, сол жак жаталауы, Орынбор Komeci, 11 уй, «Эталон орталыты» тимараты Тел.: 8 (7172) 240074

Содержание

Область применения 1 Нормативные ссылки 1 Термины и определения 2 Принцип метода 2 Реагенты 2 Аппаратура 3 Отбор образцов 4 Подготовка гомогенизированного образца 4 Проведение испытаний 5 Обработка результатов измерений 7 Прецизионность 7 Протокол испытания 8 Приложение. Библиография 9

III

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии

MEAT AND MEAT PRODUCTS

Methodfor determination of chloramphenicol content using liquid chromatography

Дата введения 2008.07.01

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) в мышечной ткани мяса, включая птицу, с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод ВЭЖХ пригоден для определения хлорамфеникола при его концентрациях в образцах более 6,5 мкг/кг. Данный метод неприменим к испорченным образцам.

Примечание - Настоящий стандарт допускается применять для определения содержания хлорамфеникола во всех видах мяса и мясопродуктов. При этом следует иметь в виду, что материалы, иные, чем мышечная ткань, в межлабораторные испытания метода включены не были.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ТОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия.

ТОСТ 25336-82 Е Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.

ТОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний.

ТОСТ 29230-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные.

ТОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения.

ТОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений.

ИСО 3696:1987 Вода для лабораторного применения. Технические требования и методы испытаний.

Примечание - Действует до введения в действие СТ РК, разработанного на основе ИСО 3696.

ИСО 17604-2003 Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Отбор проб из туш животных для микробиологического анализа.

Издание официальное

Примечание - Международный стандарт ИСО 17604:2003 введен взамен международного стандарта ИСО 3100-1:1991 Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

Содержание хлорамфеникола в мясе и мясных продуктах (chloramphenicol content of meat and meat products): Массовая доля хлорамфеникола, измеренная с помощью метода, установленного в настоящем стандарте.

Примечание — Содержание хлорамфеникола выражают в микрограммах на килограмм.

4 Принцип метода

Хлорамфеникол из части гомогенизированного однородного образца, взятой в определенном количестве непосредственно для химического анализа, экстрагируют водой. Для отделения липофильных компонентов от водного раствора применяют фильтрацию и твердофазную экстракцию. Хлорамфеникол элюируют с картриджа (экстракционного патрона) дихлорметаном. Органическую фазу выпаривают и очищают путем жидко-жидкостной экстракции в системе вода-толуол. Содержание хлорамфеникола устанавливают методом обращенно-фазной хроматографии с детектированием в ультрафиолетовой (УФ) области спектра.

5 Реагенты

Применяют только реагенты, предназначенные для аналитических целей, если не указан иной способ действий.

5.1    Вода должна соответствовать требованиям квалификации не ниже 3-й степени чистоты согласно ИСО 3696. Вода должна быть свободной от органических примесей.

5.2    Азот, пригодный для выпаривания растворителей.

5.3    Дихлорметан.

5.4    Толуол.

5.5    Ацетатный буфер, концентрация раствора (CH₃COONa) = 0,01 моль/дм³, pH =

4,3.

Растворяют 0,82 г безводного натрия ацетата примерно в 970 см³ воды. С помощью рН-метра (6.1) доводят pH до 4,3 путем добавления 50 % (массовая концентрация) раствора уксусной кислоты (СНзСООН). Переносят раствор в мерную колбу, вместимостью 1000 см³. Доводят водой до метки и перемешивают.

5.6    Ацетонитрил, пригодный для ультрафиолетовой спектроскопии.

5.7    Подвижная фаза.

К 250 см³ ацетонитрила (5.6) добавляют 750 см³ ацетатного буфера (5.5) и тщательно перемешивают. ¹

СТ РК ИСО 13493 - 2007

Перед применением элюент фильтруют (6.2) через фильтр с размером пор 0,22 мкм и дегазируют.

5.8    Основной раствор хлорамфеникола массовой концентрации 100 мкг/см^{2 3}.

Взвешивают 10 мг хлорамфеникола с точностью 0,1 мг и переносят навеску в мерную колбу вместимостью 100 см³. Добавляют метанол (5.10) до метки и перемешивают.

Приготовленный основной раствор стабилен в течение 1 месяца при хранении в темноте.

5.9    Стандартные растворы хлорамфеникола.

Пипеткой вносят 5,0 см³ основного раствора (5.8) в мерную колбу вместимостью 100 см³. Разбавляют водой до метки и перемешивают. Готовят четыре стандартных раствора, разбавляя водой 1,0; 2,0; 5,0; 15,0 см³ этого раствора до 100 см³ для получения растворов с содержанием хлорамфеникола соответственно 0,05 мкг/см³; 0,10 мкг/см³; 0,25 мкг/см³; 0,75 мкг/см³.

Эти стандартные растворы стабильны в течение одной недели при хранении в темноте.

5.10    Метанол.

6 Аппаратура

Используют обычную лабораторную посуду (6.13-6.16) и аппаратуру, в частности:

6.1    рН-метр.

6.2    Мембранный фильтр с малым мертвым объемом и размером пор 0,22 мкм.

6.3    Механическое или электрическое оборудование, пригодное для гомогенизации образца, поступившего в лабораторию на испытание.

В качестве такого устройства могут быть использованы высокоскоростной ротационный куттер или мясорубка с решеткой, диаметр отверстий которой не превышает 4 мм.

6.4    Лабораторный блендер (например, типа Стомахер или вихревого типа) Ч

6.5    Фильтровальная бумага обеззоленная быстрофильтрующая диаметром примерно 15 см.

Примечание — Например, можно использовать, например, Ватман41¹ \

6.6    Экстракционные картриджи (патроны), вместимостью 20 см³ с диатомитовой землей, позволяющей экстрагировать липофильные компоненты из водных растворов.

Примечание — Можно использовать, например, картриджи Extrelut® производства фирмы Merck, Дармштадт, Германия (№ 11737)¹'.

6.7    Водяная баня или нагревательный блок, позволяющие поддерживать температуру (40 ± 1) °С, и имеющие устройство для сушки азотом (5.2); или ротационный

вакуумный испаритель.

6.8    Центрифужные пробирки, вместимостью 25 см³.

6.9    Вихревый миксер, с частотой вращения около 700 мин "¹.

6.10    Центрифуга, обеспечивающая радиальное ускорение около 1000 д.

6.11    Микропипетки, вместимостью 300 мм³.

6.12    Жидкостный хроматограф, оборудованный:

-    насосом с постоянной производительностью;

-    инжектором;

-    обращенно-фазной С$ или Ci8 колонкой с внутренним диаметром 3 мм, длиной 20 см, размером частиц 5 мкм, или другой колонкой с эквивалентными характеристиками;

детектором в ультрафиолетовой и видимой части спектра (УФ/Вид), обеспечивающим измерение при длине волны 285 нм; если возможно, диодно-матричным детектором (в целях подтверждения);

-    самописцем с регулируемым диапазоном измерения или интегратором;

6.13    Колбы, емкостью 50, 100, 1000 см³ по ГОСТ 25336.

6.14    Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки по ГОСТ 1770.

6.15    Термометры жидкостные стеклянные по ГОСТ 28498.

6.16    Пипетки, градуированные по ГОСТ 29230, 2 класс точности.

7 Отбор образцов

Отбор образцов не является частью метода, изложенного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора образцов приведен в ИСО 17604.

Важно, чтобы в лабораторию поступали представительные образцы, которые в процессе хранения и транспортирования не были испорчены или изменены.

От представительного образца, поступившего в лабораторию, отбирают для анализа образец массой не менее 200 г. Образец хранят в условиях, исключающих его порчу и изменение состава. ⁴

СТ РК ИСО 13493 - 2007

При необходимости гомогенизированный образец хранят при температуре ниже минус 18 °С.

Анализ образца проводят как можно быстрее, но не позднее, чем через 24 часа после гомогенизации.

9 Проведение испытаний

Примечание — Для контроля повторяемости результатов (см. 11.2) проводят два параллельных определения в соответствии с 9.1—9.6.

9.1 Общие указания

Параллельно с анализом раствора (или серии растворов), полученного из испытуемого образца, проводят анализ раствора, полученного из образца, заведомо не содержащего хлорамфеникол (пустой образец), и раствора, полученного из образца, в который добавлен хлорамфеникол в количестве 10 мкг/кг (пустой образец с внесенным хлорамфениколом).

9.2 Навеска

В конической колбе, вместимостью 100 см³ (6.13) взвешивают 10 г (т) гомогенизированного образца (раздел 8) с точностью до 0,1 г.

9.3 Подготовка экстракта

Добавляют 40,0 см³ воды и энергично перемешивают в течение 3 мин с помощью блендера (6.4).

Объем (V\) полученной водной фазы составляет 40,0 см³ плюс объем воды в навеске (обычно в 10 г навески содержится, около 7,5 см³ воды)

Экстракт фильтруют через бумажный фильтр (6.5).

9.4 Твердофазная экстракция

Переносят 20,0 см³ фильтрата (V2) в экстракционный картридж (6.6).

Через (15 ± 2) мин элюируют хлорамфеникол с помощью 70 см³ дихлорметана (5.3). Выпаривают органическую фазу до объема примерно 1 см³ на водяной бане (6.7) в слабой струе азота (5.2) или с помощью ротационного вакуумного испарителя (6.7).

Переносят остаток в центрифужную пробирку (6.8), используя, примерно 10 см³ дихлорметана (5.3).

Осторожно выпаривают досуха.

5

СТ РК ИСО 13493 - 2007

9.5 Жидко-жидкостная экстракция

К остатку добавляют 400 мм³ воды (Уз) и 2,0 см³ толуола (5.4) и осторожно перемешивают в течение 1 мин с помощью вихревого миксера (6.9) при частоте вращения примерно 700 мин "¹.

Центрифугируют в течение 5 мин на центрифуге (6.10) с радиальным ускорением 1000 д.

Пипеткой отбирают как можно больше органической фазы и отбрасывают её.

Добавляют 1,5 см³ толуола (5.4) и осторожно перемешивают в течение 1 мин с помощью вихревого миксера (6.9) с частотой вращения примерно 700 мин"¹.

Центрифугируют в течение 5 мин на центрифуге (6.10) с радиальным ускорением 1000 д.

Пипеткой отбирают, как можно больше органической фазы и отбрасывают её.

Микропипеткой (6.11) переносят 300 мм³ водной фазы в подходящий контейнер.

9.6 Хроматографический анализ

9.6.1 Условия хроматографирования

Значение

285 нм

от 0,005 до 0,01 единиц оптической плотности, что соответствует полной шкале самописца

10 мВ

1,0 см/мин

0,6 см³/мин

100 мм³

Примечание — Инжектируемый объем и объемная скорость потока зависят от размеров колонки.

9.6.2 Процедура хроматографирования

После стабилизации системы жидкостного хроматографа (6.12) инжектируют растворы, полученные из образца, заведомо не содержащего хлорамфеникола («пустого» образца»); «пустого образца со специально внесенным хлорамфениколом»; четырех стандартных растворов хлорамфеникола (5.9); раствора, приготовленного из испытуемого образца (9.5); и снова из стандартных растворов хлорамфеникола (5.9).

На хроматограммах образцов проверяют наличие сигналов на участках, соответствующих времени удерживания хлорамфеникола.

1

2

^ Эго примеры продукции, доступной на рынке. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой этой продукции.

3

4

Подготовка гомогенизированного образца

Доводят температуру поступившего для анализа образца до комнатной температуры. Удаляют жировую ткань и несъедобные части образца.

Гомогенизируют образец с помощью соответствующего оборудования (6.3). При этом необходимо следить за тем, чтобы температура образца в процессе подготовки не превышала 25 °С. При использовании мясорубки, образец пропускают через нее, не менее двух раз.

Приготовленный гомогенизированный образец помещают в герметично закрываемый контейнер. Закрывают и хранят так, чтобы не допустить порчи и изменения его состава.