министерство ПРИРОДНЫХ ресурсов и экологии российской федерации Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды (Росгидромет)

РД

РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ 52.24-868

2017

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ВОДЫ И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ ВОДОТОКОВ И ВОДОЕМОВ

Ростов-на-Дону

2017

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Гидрохимический институт» (ФГБУ «ГХИ»)

2    РАЗРАБОТЧИКИ А.М. Никаноров, чл.-.корр. РАН (руководитель разработки); Т А. Хоружая, д-р. биол. наук (ответственный исполнитель); Е.Н. Бакаева, д-р. биол. наук, Л.М. Предеина, канд. хим. наук, Н А. Мартышева

3    СОГЛАСОВАН с Федеральным государственным бюджетным учреждением «Научно-производственное объединение «Тайфун» (ФГБУ «НПО «Тайфун») 11.09.2017 и Управлением мониторинга загрязнения окружающей среды, полярных и морских работ (УМЗА) Росгидромета 22.11.2017

4    УТВЕРЖДЕН Руководителем Росгидромета 23.11.2017

ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ приказом Росгидромета от 10.01.2018 от № 2

5    ЗАРЕГИСТРИРОВАН ФГБУ «НПО «Тайфун» от 04.12.2017 за номером РД 52.24.868-2017

6    ВЗАМЕН Р 52.24.566-94 «Методы токсикологической оценки загрязнения пресноводных экосистем»

7    СРОК ПЕРВОЙ ПРОВЕРКИ 2023 год ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПРОВЕРКИ 5 лет

© Росгидромет, ФГБУ «ГХИ», 2017

относительно короткий промежуток времени (от нескольких минут до 4 сут в зависимости от биологических особенностей вида тест-объекта).

3.16    питательная среда: Смесь дистиллированной (деионизированной) воды и питательных веществ, которая используется для культивирования водорослей и приготовления контрольной пробы (ГОСТ Р 54496).

3.17    подострое токсическое действие; пОТД: Воздействие, при котором критерий токсичности по ответной реакции тест-объекта достигается за более длительный промежуток времени, чем ОТД. Экспозиция для выявления пОТД составляет от 2 до 7 сут в зависимости от биологических особенностей вида тест-объекта.

3.18    популяция: Совокупность особей одного вида с общим генофондом, в течение большого числа поколений населяющих определенное пространство с относительно однородными условиями обитания. Популяция имеет сложную, обычно самоподдерживающуюся структуру; ее разделяют по полу, возрасту, пространственным и близкородственным объединениям особей [3].

3.19    плодовитость: Показатель размножения тест-объектов в токсикологическом эксперименте.

3.20 _

поверхностные воды: Воды, находящиеся на поверхности суши

в виде различных водных объектов.

[ГОСТ 19179-73, статья 7]_

3.21    показатели токсичности (токсикологические показатели): Показатели, на основании которых делают выводы о вредном действии вещества или загрязненной воды для водного организма.

3.22    проба воды: Количество воды, предназначенное для исследования.

3.23    регенерация популяции: Показатель восстановления популяции по соотношению молоди и погибших особей.

3.24    скорость осветления среды; СОС: Объем среды, который осветляется одной коловраткой в единицу времени при потреблении микроводорослей.

3.25    створ пункта наблюдений: Условное поперечное сечение водоема или водотока, в котором производят комплекс работ для получения данных о показателях качества воды [2].

3.26    тестируемая проба: Проба воды или донных отложений, в которой определяется токсичность при биотестировании.

3.27    тест-объект: Организм или популяция организмов, используемых для установления токсичности воды или донных отложений при биотестировании.

3.28    тест-реакция: Реакция тест-объекта, используемая для определения токсичности воды.

3.29    токсикологический эксперимент: Эксперимент в водной токсикологии, в ходе которого оценивают влияние на тест-объект тестируе-

мой воды, донных отложений или химического вещества (например, эталонного токсиканта).

3.30    токсическое загрязнение: Загрязнение воды водоемов и водотоков токсичными веществами.

3.31    токсичность воды (донных отложений): Характеристика качества воды (донных отложений) по способности вызывать патологические изменения или гибель организмов.

3.32    «токсичные» виды водорослей: Виды синезеленых водорослей, образующие в процессе жизнедеятельности токсины.

Примечание - Наиболее распространены «токсичные» виды водорослей: Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon flos-aquae, Anabaena flos-aquae, Oscillatoria limnetica и другие.

3.33    токсичные вещества: Вещества, способные при воздействии на живые организмы, вызывать патологические изменения или их гибель.

3.34    фоновый створ: Створ, расположенный на расстоянии не менее 1 км выше источника загрязнения [2].

3.35    хемотаксис: Двигательные реакции свободно передвигающихся организмов, а также клеток (зооспор, сперматозоидов, лейкоцитов и др.) под влиянием химических раздражителей. Хемотаксис может быть положительным - движение направлено к источнику химического раздражителя (по градиенту его концентрации в воздухе или воде), и отрицательным -движение направлено от источника.

3.36    хроническое токсическое действие; ХТД: Воздействие, при котором критерий токсичности по ответной реакции тест-объекта достигается за относительно длительный промежуток времени - от 3 до 30 сут в зависимости от биологических особенностей вида тест-объекта.

3.37 _

цветение вод: Массовое развитие фитопланктона, вызывающее

изменение окраски воды.

[ГОСТ 17.1.1.01 -77, статья 49]_

3.38    численность (плотность) водорослей: Количество клеток в единице объема питательной среды или анализируемой пробы.

Примечание - Плотность (численность) клеток выражается количеством клеток на кубический сантиметр (клеток/см³) (ГОСТ Р 54496).

3.39 _

эвтрофирование вод: Повышение биологической продуктивности

водных объектов в результате накопления в воде биогенных элементов.

[ГОСТ 17.1.1.01-77, статья 48]_

3.40    экосистема: Сообщество живых организмов и среда их обитания, которые функционируют совместно (обмен веществ и энергии происходит во взаимной связи) [4].

3.41    экспозиция: Период времени, в течение которого тест-объект находится под воздействием исследуемого фактора, например, тестируемой воды или химического вещества (РД 52.24.635).

3.42    эталонный токсикант: Токсичное вещество, используемое для установления пригодности тест-объекта для биотестирования.

4 Общие положения

4.1    Биотестирование является методом оценки качества и загрязненности воды и донных отложений водотоков и водоемов по ответным реакциям водных организмов (гидробионтов), являющихся тест-объектами. Биотестирование представляет собой токсикологический эксперимент, принятый в водной токсикологии.

4.2    Методы биотестирования, будучи биологическими по сути, близки по назначению к методам химического анализа: как и химические методы, они отражают свойства проб воды или донных отложений.

Эти методы отличаются от методов биоиндикации (традиционных гидробиологических методов биологического анализа), которые позволяют получать информацию о качестве воды по наличию организмов -индикаторов загрязнения.

4.3    О наличии токсичности воды и донных отложений судят главным образом по проявлениям патологических изменений у тест-объектов под влиянием воды и донных отложений при биотестировании, вплоть до их гибели.

4.4    Показателем токсичности является тест-реакция, изменения которой регистрируют в ходе токсикологического эксперимента в течение определенного времени (экспозиции), а критерием токсичности -количественная характеристика этой тест-реакции.

4.5    Для определения токсичности донных отложений используют два подхода: биотестирование «нативных» проб донных отложений (осадков) и биотестирование водной вытяжки.

4.6    До проведения биотестирования проб воды или донных отложений определяют пригодность тест-объекта по его реакции на эталонный токсикант.

4.7    Токсикологические эксперименты проводят в условиях, оптимальных для жизнедеятельности тест-объектов с учетом их особенностей (режима температуры, освещения, питания, минерализации воды и т.д.).

4.8    В результате биотестирования устанавливают степень токсичности пробы, для оценки которой используют следующие характеристики качества воды: условно нетоксичная, слаботоксичная, токсичная, очень токсичная, экстремально токсичная или вода, оказывающая острое, подострое или хроническое токсическое действие (ОТД, пОТД или ХТД соответственно).

4.9    Результат биотестирования пробы должен быть выражен одной степенью токсичности или токсического действия.

4.10    Биотестирование проводят с использованием набора из нескольких биотестов (не менее трёх) на тест-объектах разных трофических уровней. Это связано с различной чувствительностью тест-объектов гидробионтов к загрязняющим веществам, фазностью и особенностью их реагирования на токсичность.

4.11    Заключение о токсичности пробы при использовании набора биотестов делают по данным того биотеста, в котором выявлена наибольшая степень токсичности, т.е. «по наихудшему результату».

Оценка токсичности пробы воды или донных отложений по результатам биотестирования на наборе биотестов является экспертной.

4.12    Биотестирование воды и донных отложений имеет ряд общих этапов выполнения: подготовка тест-объекта, культивирование, проверка пригодности тест-объекта по чувствительности к действию эталонного токсиканта, отбор проб воды и/или донных отложений, транспортировка проб и хранение в лаборатории, подготовка проб для биотестирования, выполнение биотестирования, обработка и оценка результата, представление результатов биотестирования по установленным формам. Общая схема и этапы работ по определению токсичности приведены в приложении А.

4.13    Особенностью биотестирования воды и донных отложений водотоков и водоемов является постановка двух контрольных серий: на дехлорированной (отстоянной в течение 5 сут) водопроводной воде и на воде, отобранной из фонового («условно чистого») створа.

Контроль на водопроводной воде обычно используют для характеристики состояния тест-объектов. Их выживаемость в этой серии должна быть не менее 90 %. Если вода фонового створа оказажется токсичной, данные биотестирования проб опытной серии сравнивают с контролем на водопроводной воде.

Для нескольких проб из одного водного объекта ставят по одной контрольной серии: 1) на дехлорированной водопроводной воде и 2) на воде из фонового участка этого водного объекта.

4.14    Формирование сети пунктов и программ наблюдений проводят согласно РД 52.24.309.

5 Отбор, транспортировка и хранение проб

5.1 Отбор проб воды и их транспортировку выполняют согласно РД 52.24.309.

Посуда из полиэтилена и стекла, используемая для отбора проб и биотестирования, должна быть тщательно вымыта, ополоснута дистиллированной водой и высушена при комнатной температуре. Для мытья посуды используют гидрокарбонат натрия. Органические растворители и

поверхностно-активные вещества для мытья посуды применять недопустимо. Подготовленную посуду, а также материалы помещают в полиэтиленовые пакеты, которые вскрывают непосредственно перед биотестированием. До заполнения посуды ее трижды ополаскивают водой водного объекта.

5.2 Отбор проб донных отложений для биотестирования, транспортировку, хранение проб и установление типа донных отложений проводят в соответствии с РД 52.24.609.

Помимо проб донных отложений, на этом же участке отбирают воду (по возможности из придонного слоя) для использования в биотестировании.

Характеристику пробы воды и донных отложений записывают по форме, приведенной в приложении Б.

6 Подготовка проб воды и донных отложений для биотестирования

6.1    Перед биотестированием воду фильтруют через мельничный газ или фильтровальную бумагу для удаления естественной биоты, доводят до комнатной температуры (достают из холодильника и оставляют на некоторое время до выравнивания температур).

6.2    Измеряют pH и концентрацию растворенного кислорода в воде, чтобы определить их соответствие диапазону оптимальных условий жизнедеятельности тест-объекта и не корректируют.

6.3    Рекомендуется уточнить показатели минерализации тестируемой воды, так как в некоторых водных объектах вода может иметь повышенную минерализацию, что скажется на ее токсичности вследствие несоответствия оптимальным условиям жизнедеятельности тест-объекта. В случае, если минерализация превышает 1 г/дм³, биотестирование не проводят, либо используют солоноватоводные тест-объекты согласно Р 52.24.690.

6.4    Подготовку «необработанных» проб донных отложений и их водных вытяжек для биотестрования проводят в соответствии с РД 52.24.609.

6.5    При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

-температура окружающего воздуха, °С..............................20±5;

-    атмосферное давление, кПа (мм рт. ст.).............от    84,0    до    106,7

(от 630 до 800);

-    влажность воздуха при температуре 25 °С, %, не более.........80;

-    окружающая среда не должна содержать веществ, которые могут оказывать токсическое действие на тест-объекты.

7 Основные методы биотестирования воды и донных отложений водотоков и водоемов

7.1    Метод биотестирования воды на водорослях

7.1.1    Принцип метода

Метод основан на установлении токсичности (ОТД и степени токсичности) тестируемой воды по угнетению роста лабораторной культуры зеленых протококковых водорослей Scenedesmus quadricauda (Тигр.) Breb. или Chlorella vulgaris Beijer.

Показателем токсичности является коэффициент прироста численности клеток водорослей при экспозиции в тестируемой пробе воды.

Критерием токсичности является снижение коэффициента прироста численности клеток водорослей в опытной серии по сравнению с контрольной от 35 % до 50 % и более за 72 или 96 ч экспозиции. При этом устанавливают наличие ОТД и степень токсичности (вода условно нетоксичная, слаботоксичная или очень токсичная).

7.1.2    Необходимые материалы, оборудование, реактивы

7.1.2.1    Культура водорослей Scenedesmus quadricauda (Тигр.) Breb. или Chlorella vulgaris Beijer. Основные характеристики водорослей, источники их получения, условия культивирования и содержания в лаборатории изложены в ГОСТ Р 54496.

7.1.2.2    Устройство для фильтрования с использованием мембранных или бумажных фильтров.

7.1.2.3    Шкаф сушильный общелабораторного назначения.

7.1.2.4    Холодильник бытовой.

7.1.2.5    Насос вакуумный любого типа.

7.1.2.6    Камера для счета форменных элементов крови и клеточных элементов спинно-мозговой жидкости (Горяева) по ТУ 64-1-816-84.

7.1.2.7    Люминостат с освещением рабочей зоны ЗООО-бОООлк от ламп люминесцентных по ГОСТ 6825-91.

7.1.2.8    Микроскоп инструментальный ИМ 100x50, А по ГОСТ 8074-82 или МБС-10 или другой с аналогичными характеристиками.

7.1.2.9    Пинцет медицинский по ТУ 2-31-32-73.

7.1.2.10    Стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672-75.

7.1.2.11    Дозаторы пипеточные на 0,1 и 0,5 см³ П1 по ТУ 64-1-3329.

7.1.2.12    Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности исполнения 2 по ГОСТ 29169-91 вместимостью 10 см³ - 3 шт.

7.1.2.13    Центрифуга лабораторная роторная любого типа

7.1.2.14    Фильтры мембранные «Владипор МФАС-ОС-2», 0,45 мкм, по ТУ 6-55-221-1-29-89 или другого типа, равноценные по характеристикам.

7.1.2.15    Колбы конические типа Кн исполнения 2 по ГОСТ 25336-82 вместимостью 250 см³ - 20 шт.

7.1.2.16    Цилиндры мерные исполнения 1, 3 по ГОСТ 1770-74 вместимостью 100 см³ - 2 шт.

7.1.2.17    Стаканы типа В, исполнения 1, ТХС по ГОСТ 25336-82 вместимостью: 50 см³ - 2 шт., 1000 см³ - 1 шт.

7.1.2.18    Фильтры бумажные обеззоленные «белая лента» по ТУ 6-09-1678-86.

7.1.2.19    Марля медицинская по ГОСТ 9412-93.

7.1.2.20    Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

7.1.2.21    Вода водопроводная дехлорированная.

7.1.2.22    Спирт этиловый для обезжиривания покровных стекол по ГОСТ Р 5962-2013

Примечание - Допускается использование других типов средств измерений, вспомогательных устройств, в том числе импортных, с характеристиками не хуже, чем у приведенных в 7.1.2; спирта этилового, изготовленного по другой нормативно-технической документации, с квалификацией не ниже указанной в 7.1.2.22.

7.1.3 Подготовка культуры водорослей

7.1.3.1    В коническую колбу вместимостью 250 см³ помещают питательную среду для культивирования, полученную в соответствии с приложением В, и 10 см³ культуры водорослей Scenedesmus quadricauda (Тигр.) Breb. или Chlorella vulgaris Beijer, закрывают ватно-марлевой пробкой, стерилизованной в сушильном шкафу в течение 1 ч при 100 °С, и помещают в люминостат. Культура пригодна для получения суспензии на стадии экспоненциального роста. Длительность периода экспоненциального роста от 5 до 7 сут.

7.1.3.2    Подготовка мембранных фильтров

Мембранные фильтры подготавливают следующим образом. На глянцевой (рабочей) поверхности фильтра ставят метку простым карандашом. Фильтры помещают в термостойкий стакан вместимостью 1000 см³, приливают 300-400 см³ дистиллированной воды и кипятят в течение 20 мин. Эту процедуру повторяют трижды, сливая воду после каэдого кипячения. Фильтры хранят во влажном состоянии. После длительного хранения (10 дней и более) фильтры перед использованием вновь кипятят в дистиллированной воде в течение 10 мин.

7.1.3.3    Получение суспензии для биотестирования

Перед биотестированием культуру водорослей по 7.1.3.1 сгущают, фильтруя через мембранный фильтр с помощью устройства для фильтрования. Водоросли на фильтре пересушивать недопустимо.

Сконцентрированную на фильтре культуру водорослей с помощью пипетки вместимостью 10 см³ смывают в стакан питательной средой для культивирования, приготовленной в соответствии с приложением В. Ю

Для этого фильтр снимают с воронки пинцетом и помещают в чистый стакан вместимостью 50 см³, прислонив к стенкам стакана так, чтобы фильтр не доставал 2-3 см до дна стакана. По каплям выпускают воду из пипетки на фильтр, смывая клетки водорослей в стакан мягкой кисточкой.

Клетки водорослей можно также сконцентрировать путем центрифугирования в течение 10 мин при 4000-4500 об/мин.

Численность клеток в полученной суспензии должна быть в пределах от 5* 10⁶ до 10х 10⁶ клеток/см³.

Перед выполнением биотестирования проводят проверку пригодности культуры водорослей в соответствии с Г.2.3 (приложение Г).

7.1.4 Выполнение биотестирования

7.1.4.1    Для биотестирования ставят опытные и контрольную серии. Желательно использовать две контрольные серии: на дехлорированной водопроводной воде и, по возможности, на воде, отобранной на фоновом створе водного объекта и отфильтрованной через бумажный фильтр «белая лента». Для всех опытных серий ставят по одной контрольной серии на дехлорированной водопроводной воде и на воде, отобранной на фоновом створе по 4.13.

Каждую серию ставят в трех повторностях. Опытные и контрольные серии ставят одновременно.

7.1.4.2    Для приготовления опытной серии помещают в каждую из трех конических колб вместимостью 250 см³ по 100 см³ тестируемой воды и по 0,1 см³ питательной среды для биотестирования, приготовленную согласно приложению В, и суспензию водорослей. Объем суспензии рассчитывают таким образом, чтобы численность клеток в каждой из трех колб находилась в пределах от 25x1 о³ до 50x1 о³ клеток/см³.

Для проведения биотестирования колбы перемешивают встряхиванием, закрывают ватно-марлевыми пробками, стерилизованными в сушильном шкафу в течение 1 ч при 100 °С. Определяют исходную численность клеток водорослей согласно 7.1.5. Подсчет повторяют трижды в ка->едой колбе и рассчитывают среднее арифметическое исходной численности клеток водорослей. Содержимое колб вновь перемешивают, закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками и помещают в люминостат на экспозицию 72 ч при постоянном освещении 3000-6000 лк. Ежедневно 1-2 раза в день колбы перемешивают встряхиванием.

7.1.4.3    Для приготовления контрольной серии помещают в каждую из трех конических колб вместимостью 250 см⁵ по 100 см³ дехлорированной водопроводной воды (или отфильтрованной воды, отобранной на фоновом створе водного объекта) и по 0,1 см³ питательной среды для биотестирования, приготовленную согласно приложению В, и суспензию водорослей в каждую. Объем суспензии рассчитывают таким образом, чтобы численность клеток в каждой из трех колб находилась в пределах от 25x10³ до 50x10³ клеток/см³.

Биотестирование контрольной серии проводят аналогично 7.1.4.2.

7.1.4.4 Через 72 ч проводят подсчет численности клеток водорослей в контрольной и опытных сериях. Если через 72 ч в опытной серии токсичность выявляется (7.1.5), эксперимент прекращают, считая его законченным. В противном случае эксперимент продолжают до 96 ч.

7.1.5 Регистрация численности клеток водорослей

Численность клеток водорослей определяют путем подсчета под микроскопом в камере Горяева.

Примечание - Изменения численности клеток водорослей можно определить также путем измерения оптической плотности культуры водорослей согласно ГОСТ Р 54496.

При использовании камеры Горяева увеличение объектива микроскопа должно быть 20х, а окуляра от 10х до 15х. Все элементы камеры Горяева обезжиривают спиртом, накрывают камеру покровным стеклом и притирают его до образования радужных колец интерференции. Из каждой колбы стеклянной палочкой вносят по одной капле тщательно перемешанной суспензии на верхний и нижний края покровного стекла. Камеру заполняют так, чтобы не образовывались пузырьки воздуха, избыток суспензии вытесняется по канавкам. Просматривают 16 малых квадратов по диагонали или все поле камеры. Если по результату подсчета численность в 16 квадратах более 50 клеток, то учитывают полученное значение и все поле камеры не обсчитывают.

Вычисляют численность клеток водорослей в 1 см³ суспензии по формуле

(1)

где М - численность клеток водорослей, клеток/см³;

т - число подсчитанных клеток в малых квадратах камеры, клеток; п - число просчитанных малых квадратов камеры;

V - объем части камеры, соответствующий площади малого квадра-

7.1.6 Обработка результатов, расчеты и оценка токсичности воды

Для оценки токсичности тестируемой воды рассчитывают коэффициенты прироста численности клеток водорослей В,, отн. ед, за 72 или 96 ч экспозиции в опытной и контрольной сериях, используя формулу

где M_t - среднее арифметическое значение численности клеток водорослей в опытной и в контрольной сериях через 72 или 96 ч экспозиции, клеток/см³;

M_wcx - среднее арифметическое значение исходной численности клеток водорослей в опытной и в контрольной сериях, клеток/см³.

Рассчитывают отклонение коэффициента прироста численности клеток водорослей А/, % по формуле

.    (    В    к,    ~    Bo_t    )

А ,=—--Ю0,

Ок.

где В_к( - коэффициент прироста численности клеток водорослей в контрольной серии, отн. ед.;

Во₍ - коэффициент прироста численности клеток водорослей в опытной серии, отн. ед.;

/-экспозиция, ч.

Снижение коэффициента прироста численности клеток водорослей в опытной серии по сравнению с контрольной свидетельствуют об угнетении роста водорослей и указывает на токсичность пробы воды. Оценку токсичности воды: токсического действия и степени токсичности, - проводят по значениям отклонения коэффициента прироста численности клеток водорослей, используя таблицу 1.

Таблица 1 - Оценка токсичности воды по отклонению коэффициента прироста численности клеток водорослей (угнетению роста водорослей)

Отклонение коэффициента прироста численности клеток водорослей в опытной серии от контрольной. % Токсическое действие пробы воды Степень токсичности воды До 35 включ. Отсутствует Условно нетоксичная Св. 35 до 50 включ. Отсутствует ОТД Слаботоксичная Св. 50 Оказывает ОТД Очень токсичная

Наиболее надежной является оценка по ОТД, о наличии которого судят по снижению коэффициента прироста численности водорослей на 50 % и более за 72 или 96 ч экспозиции.

В отдельных случаях коэффициенты прироста численности клеток водорослей в опытной серии могут быть больше, чем в контрольной (At будет иметь отрицательное значение). В этих случаях тестируемая вода оказывает стимулирующее влияние на рост водорослей, которое отмечают в журнале.

Содержание

1    Область применения................................................................................1

2    Нормативные ссылки................................................................................1

3    Термины и определения...........................................................................2

4    Общие положения.....................................................................................6

5    Отбор, транспортировка и хранение проб...............................................7

6    Подготовка проб воды и донных отложений для

биотестирования......................................................................................8

7    Основные методы биотестирования воды и донных отложений

водотоков и водоемов..............................................................................9

7.1    Метод биотестирования воды на водорослях.................................9

7.1.1    Принцип метода.....................................................................9

7.1.2    Необходимые материалы, оборудование, реактивы...........9

7.1.3    Подготовка культуры водорослей.......................................10

7.1.4    Выполнение биотестирования.............................................11

7.1.5    Регистрация численности клеток водорослей....................12

7.1.6    Обработка результатов, расчеты и оценка токсичности

воды......................................................................................12

7.2    Метод биотестирования воды на дафниях....................................14

7.2.1    Принцип метода...................................................................14

7.2.2    Необходимые материалы, оборудование...........................14

7.2.3    Подготовка к биотестированию...........................................15

7.2.4    Выполнение биотестирования.............................................15

7.2.5    Регистрация показателей выживаемости и

плодовитости дафний..........................................................15

7.2.6    Обработка результатов, расчеты и оценка токсичности

воды......................................................................................16

7.3    Метод биотестирования воды и донных отложений

на инфузориях..................................................................................17

7.3.1    Принцип метода...................................................................17

7.3.2    Необходимые материалы, оборудование, реактивы.........18

7.3.3    Подготовка к биотестированию...........................................18

7.3.4    Выполнение биотестирования.............................................19

7.3.5    Регистрация показателей гибели и плодовитости.............19

7.3.6    Обработка результатов и оценка токсичности    воды..........20

7.4    Экспресс-метод биотестирования воды по реакции

хемотаксиса инфузорий...................................................................22

7.4.1    Принцип метода...................................................................22

7.4.2    Необходимые материалы, оборудование, реактивы.........22

7.4.3    Подготовка к биотестированию...........................................23

7.4.4    Выполнение биотестирования.............................................23

7.4.5    Регистрация реакции хемотаксиса......................................24

7.4.6    Обработка результатов и оценка токсичности    воды..........24

ill

Полученные результаты записывают по форме таблицы Д.1 (приложение Д).

7.2 Метод биотестирования воды на дафниях

7.2.1    Принцип метода

Метод основан на установлении токсического действия: ОТД, пОТД или ХТД - тестируемой воды на лабораторную культуру дафний Daphnia magna St. Токсическое действие тестируемой воды устанавливают по снижению выживаемости или плодовитости дафний в опытной серии по сравнению с контрольной при определенной экспозиции.

Показателями токсичности служат выживаемость и плодовитость дафний. Выживаемость выражают как среднее число выживших дафний, плодовитость - как среднее число выметанной молоди в расчете на одну выжившую (на момент регистрации) особь, в течение экспозиции в тестируемой воде.

Критерием токсичности является снижение выживаемости дафний на 50 % по сравнению с контрольной серией для ОТД при экспозиции 96 ч (4 сут), для пОТД - при экспозиции св. 4 до 7 сут. Выживаемость дафний в контрольной серии не должна быть ниже 90 %. Критерием ХТД является статистически достоверное снижение плодовитости дафний по сравнению с плодовитостью в контрольной серии при экспозиции св. 7 до 30 сут. Статистическую обработку проводят в соответствии с приложением Е.

7.2.2    Необходимые материалы, оборудование

7.2.2.1 Культура дафний Daphnia magna St. Основные характеристики дафний, источники их получения, условия культивирования и содержания в лаборатории изложены в ГОСТ Р 56236.

7.2.2    2 Одноклеточные протококковые водоросли для кормления дафний родов Chlorella и Scenedesmus. Культивирование водорослей производится на питательной среде в соответствии с приложением В.

7.2.2.3    Фильтры бумажные обеззоленные «белая лента» по ТУ 6-09-1678-86.

7.2.2.4    Цилиндры мерные исполнения 1, 3 по ГОСТ 1770-74 вместимостью 250 см³ - 2 шт.

7.2.2.5    Стаканы типа В исполнения 2 по ГОСТ 25336-82 вместимостью 600 см³ -1 шт.

7.2.2.6    Устройство для фильтрования с использованием мембранных или бумажных фильтров.

7.2.27 Аквариумы вместимостью 10-30 дм³.

7.2.2.8 Стеклянная палочка диаметром 4 мм и длиной 1500 мм по ГОСТ 27460-87 - 1 шт.

7.5    Метод биотестирования воды и донных отложений на

коловратках......................................................................................24

7.5.1    Принцип метода...................................................................24

7.5.2    Необходимые материалы, оборудование, реактивы........25

7.5.3    Подготовка к биотестированию...........................................25

7.5.4    Выполнение биотестирования.............................................26

7.5.5    Регистрация показателей гибели и плодовитости

коловраток............................................................................26

7.5.6    Обработка результатов и оценка токсичности...................27

7.6    Экспресс-метод биотестирования воды и водной вытяжки

донных отложений по пищевой активности коловраток................29

7.6.1    Принцип метода...................................................................29

7.6.2    Необходимые материалы, оборудование, реактивы.........29

7.6.3    Подготовка к биотестированию...........................................30

7.6.4    Выполнение биотестирования.............................................30

7.6.5    Регистрация численности клеток водорослей....................31

7.6.6    Обработка результатов и оценка токсичности...................31

7.7    Метод биотестирования воды с использованием покоящихся

яиц коловраток.................................................................................32

7.7.1    Принцип метода...................................................................32

7.7.2    Необходимые материалы, оборудование, реактивы.........32

7.7.3    Подготовка к биотестированию...........................................33

7.7.4    Выполнение биотестирования.............................................33

7.7.5    Регистрация показателя выклева коловраток....................34

7.7.6    Обработка результатов и оценка токсичности...................34

7.8    Метод биотестирования нативных донных отложений на

личинках хирономид........................................................................35

7.8.1    Принцип метода...................................................................35

7.8.2    Необходимые материалы, оборудование, реактивы.........35

7.8.3    Подготовка к биотестированию...........................................36

7.8.4    Выполнение биотестирования............................................36

7.8.5    Регистрация нарушений жизнедеятельности и гибели

личинок хирономид..............................................................37

7.8.6    Обработка результатов и оценка токсического действия

воды и донных отложений...................................................37

8 Дополнительные методы биотестирования воды и донных отложений водотоков и водоемов.........................................................38

8.1    Метод биотестирования воды на цериодафниях..........................38

8.2    Метод биотестирования воды на рыбах........................................38

8.3    Метод биотестирования воды и донных отложений

на популяциях гидробионтов...........................................................38

8.4    Метод оценки токсического влияния фитоценозов планктона на

формирование качества вод...........................................................39

9    Выбор методов биотестирования и оценка токсичности проб воды

и донных отложений водотоков и водоемов.........................................39

10    Оценка токсического загрязнения водного объекта...........................40

11    Условия приемлемости результатов биотестирования......................41

12    Требования к технике безопасности и квалификации

исполнителей........................................................................................41

Приложение А (справочное) Общая схема и этапы работ по

определению токсичности воды и донных отложений

методами биотестирования.................................................42

Приложение Б (рекомендуемое) Форма записи характеристик проб

воды и донных отложений...................................................43

Приложение В (справочное) Приготовление питательной среды для

культивирования водорослей и для биотестирования......44

Приложение Г (рекомендуемое) Проверка пригодности тест-объектов

для биотестирования...........................................................46

Приложение Д (рекомендуемое) Формы записи данных и результатов

биотестирования проб воды................................................49

Приложение Е (справочное) Алгоритм статистической обработки

результатов биотестирования.............................................54

Библиография............................................................................................55

Введение

Число загрязняющих веществ, поступающих в водоемы и водотоки, постоянно растет, а контроль токсичных компонентов недостаточен из-за трудностей их аналитического определения, невозможности учета их суммарных эффектов и процессов трансформации в водной экосистеме. Наиболее приемлемым выходом из создавшейся ситуации является введение в практику государственного мониторинга состояния и загрязнения окружающей среды в части поверхностных вод водных объектов методов биотестирования токсичности - интегральной оценки токсичности воды и донных отложений. Данные биотестирования должны использоваться в комплексе с данными биоиндикации и химического анализа, что позволяет получить наиболее полную оценку экологотоксикологического состояния водных объектов.

Методология биотестирования изначально относилась к компетенции специалистов по водной токсикологии, однако в настоящее время применяется в мировой практике экологами и гидробиологами широкого профиля. Во многих странах биотестирование стало необходимым элементом системы охраны поверхностных вод, обеспеченным нормативами качества воды.

Наблюдения за токсичностью поверхностных вод на основе биотестирования в мониторинге Росгидромета предусмотрены РД 52.24.309. Предложено значительное число новых и усовершенствованных методов биотестирования воды и донных отложений (биотестов), разработаны различные нормативно-методические документы. Последние, однако, многоцелевого назначения (предназначены для тестирования воды, вытяжки из почв, осадков сточных вод, донных отложений и отходов), в связи с чем они не позволяют учитывать особенности биотестирования поверхностных вод.

В настоящий руководящий документ вошли актуализированные и наиболее апробированные и перспективные для мониторинга поверхностных вод водных объектов современные биотесты на гидробионтах разных систематических групп: водорослях, ракообразных, инфузориях, коловратках, рыбах, а также на популяциях гидробионтов.

Важными представляются вопросы выбора метода биотестирования и необходимости использования набора биотестов. Биотестирование на наборе из нескольких биотестов, благодаря различной чувствительности тест-объектов к загрязняющим веществам, позволяет с большей надежностью уловить присутствие в воде или донных отложениях веществ, обуславливающих токсичность. В набор биотестов должны быть включены специально выделенные в руководящем документе «основные методы биотестирования»; в них используются тест-объекты, наиболее широко применяемые в мировой и отечественной практике.

В группу «дополнительных» вошли методы, которые не являются обязательными, но могут быть также включены в набор биотестов.

Особое внимание уделено экспресс-методам, позволяющим получить результат за короткое время (от 2 до 6 ч).

Результаты определения токсичности проб воды с помощью биотестирования дают возможность оценить качество воды по токсичности и перейти к общей оценке токсического загрязнения водного объекта или его участка.

В связи с актуальностью проблемы эвтрофирования водоемов, цветения синезеленых водорослей и токсичности их метаболитов в руководящий документ включен метод биотестирования токсического влияния фитоценоза планктона на формирование качества воды.

РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ВОДЫ И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ ВОДОТОКОВ И ВОДОЕМОВ

Дата введения - 2018-10-01

1    Область применения

Настоящий руководящий документ устанавливает методы биотестирования воды и донных отложений водотоков и водоемов, оценки качества воды по токсичности и токсическому загрязнению.

Настоящий руководящий документ предназначен для подразделений Росгидромета, осуществляющих организацию и проведение наблюдений за состоянием поверхностных вод, а также для использования природоохранными организациями, выполняющими мониторинг состояния и загрязнения окружающей среды.

2    Нормативные ссылки

В настоящем руководящем документе использованы нормативные ссылки на следующие нормативные документы:

ГОСТ 31861-2012 Вода. Общие требования к отбору проб ГОСТ Р 54496-2011 (ИСО 8692:2004) Вода. Определение токсичности с использованием зеленых пресноводных одноклеточных водорослей ГОСТ Р 56236-2014 (ИСО 6341:2012) Вода. Определение токсичности по выживаемости пресноводных ракообразных Daphnia magna Straus

Р 52.24.662-2004 Оценка токсического загрязнения природных вод и донных отложений пресноводных экосистем методами биотестирования с использованием коловраток

Р 52.24.690-2006 Оценка токсического загрязнения вод водотоков и водоемов различной солености и зон смешения речных и морских вод методами биотестирования

Р 52.24.695-2007 Оценка токсического загрязнения природных вод и донных отложений водных экосистем по коэффициенту регенерации популяции

Р 52.24.741-2010 Оценка токсичности поверхностных вод суши в условиях чрезвычайных ситуаций методом экспрессного биотестирования Р 52.24.763-2012 Оценка состояния пресноводных экосистем по комплексу химико-биологических показателей

Р 52.24.809-2014 Методы оценки токсического влияния фитоценозов планктона на формирование качества поверхностных вод суши

РД 52.24.309-2016 Организация и проведение режимных наблюдений за состоянием и загрязнением поверхностных вод суши

РД 52.24.609-2013 Организация и проведение наблюдений за содержанием загрязняющих веществ в донных отложениях водных объектов

РД 52.24.635-2002 Методические указания. Проведение наблюдений за токсическим загрязнением донных отложений в пресноводных экосистемах на основе биотестирования

РД 52.24.670-2005 Унифицированный метод определения острой токсичности проб поверхностных вод суши, содержащих взвешенные вещества

Примечания

1    Ссылки на остальные нормативные документы приведены в разделах 7, В 1 (приложение В).

2    При пользовании настоящим руководящим документом целесообразно проверять действие ссылочных нормативных документов:

-    национальных стандартов - в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году;

-    нормативных документов Росгидромета и типовых нормативных документов -по РД 52.18.5 и дополнений к нему - ежегодно издаваемым информационным указателям нормативных документов.

3    Если ссылочный нормативный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящим руководящим документом следует руководствоваться замененным (измененным) нормативным документом. Если ссылочный нормативный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящих рекомендациях введены и применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    биологическая индикация воды (биоиндикация): Оценка качества воды по наличию водных организмов, являющихся индикаторами ее загрязненности или трофности.

3.2    биологическое тестирование воды или донных отложений (биотестирование): Метод оценки качества воды или донных отложений по их токсичности на основе анализа ответных реакций тест-объектов (гидробионтов) в токсикологическом эксперименте.

3.3    водный объект: Природный или искусственный водоем, водоток либо иной объект, постоянное или временное сосредоточение вод в котором имеет характерные формы и признаки водного режима [1].

3.7    гидробионты: Все живые организмы, животные и растительные, развивающиеся и существующие в воде и донных отложениях водоемов и водотоков [2].

3.8    гидробиологические показатели качества воды: Показатели качества воды, определяемые по состоянию гидробионтов [2].

3.13    «нативная» проба донных отложений: Проба донных отложений без какой-либо дополнительной предварительной обработки.

3.14 _

нормы качества воды: Установленные значения показателей качества воды для конкретных видов водопользования.

[ГОСТ 27065-86, статья 3]_

3.15    острое токсическое действие; ОТД: Воздействие, при котором критерий токсичности по ответной реакции тест-объекта достигается за