Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.23527—18

Издание официальное

Москва • 2018

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.2.3527—18

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме:

Протокол X»

количественного микробиологического анализа штамма В. thuringiensls ssp. toumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест

1.    Дата проведения анализа ______

2.    Рабочее место (профессия работающего)____

3.    Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ______

3.    Вид пробоотборника___

4.    Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб _

5.    Питательная среда, время инкубации _

6.    Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _

7.    Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) _________

8.    Результаты идентификации микроорганизмов В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25

(микроморфологическис признаки)_

9.    Результаты расчета концентрации штамма __

10.    Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКа.в. _

11.    Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись)_

12.    Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _

Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. loumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.2.3527—18

Компьютерная верстка Е. В. Ломановой Подписано в печать 27.12.18

Тираж 100 эю.

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5,7

Оригинал-макет подютовлен к печати и тиражирован Федеральным центром i-игнены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, тел.: 8 (495) 633-86-59

ББК 51.21 М54

М54 Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2018.—10 с.

ISBN 978-5-7508-1673-6

1.    Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова» Минздрава России (11 И. Шеина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.21

ISBN 978-5-7508-1673-6

€> Роспотребнадзор, 2018

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

1 февраля 2018 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25

в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания _МУК    4.23527—18_

1. Общие положения и область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 ООО клеток в 1 м³ воздуха.

1.2.    Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе населенных мест

Штамм В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 выделен с поверхности листьев сои в Новосибирской области в 2010 г.

На основе штамма энтомопатогенной бактерии В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 создан инсектицид «Биослип БТ, П», который обладает широким спектром действия в отношении насекомых-вредителей сельского хозяйства, относящихся к отрядам Чешуекрылые и Двукрылые. Он активен в отношении личинок бабочек из семейства Белянки, Совки, Настоящие моли. Выемчатокрылые моли. Огневки, Плодожорки, а также в отношении насекомых из отряда Двукрылые: журчалок, галлиц, серебрянок.

Действующей основой препарата являются кристаллы белкового S-эндотоксина и жизнеспособные споры штамма В. thuringiensis ssp. tou-manoffi 25. Содержание жизнеспособных спор в инсектициде «Биослип БТ, П» составляет не менее 1 х Ю¹⁰ КОЕ/г, количество кристаллов токсина равно общему количеству спор в препарате.

В качестве вспомогательных веществ инсектицид содержит остатки защитной среды для сублимационной сушки - неорганические фосфаты, сухое молоко, желатин. Инсектицид представляет собой водорастворимый порошок

Кристаллы токсина действуют в кишечнике насекомого при поедании, белковый токсин растворяется в кишечном соке насекомого при pH 9,5—10,5 и переходит в активную форму под действием протеолитических ферментов кишечного сока. В активном состоянии токсины формируют поры в клетках эпителия кишечника, что в дальнейшем приводит к гибели насекомого.

После попадания в кишечник насекомого гибель наступает в промежутке от 6 до 48 часов, в зависимости от вида насекомого, стадии его развития, количества попавшего в кишечник 5-эндотоксина. Белковый 5-эндотоксин конденсируется в кристаллы ромбовидной формы (параспо-ральные тельца) и экскретируется на завершающей стадии спорообразования. Кристаллический 5-эндотоксин обладает высокой термостабильностью.

Штамм В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 представляет собой грам-положительные, подвижные, образующие жгутики палочки размером 0,7—1,2 х 2,5—4,0 мкм. Через 48 часов роста на МПА образуют овальные споры размером 0,6—0,8 х 1,2—2,0 мкм. Одновременно со спорой образуются параспоральные тельца ромбовидной формы разных размеров. На среде АГВ и картофельно-глюкозном агаре образуют серые полупрозрачные колонии с ровным краем. Оптимальная температура роста +28—31 °С.

Систематическое положение микроорганизма:

Царство    Procaryota

Класс    Schizomycetes

Отряд    Eubacteriales

Семейство    Bacillaceae

Род    Bacillus

Вид    thuringiensis

Штамм ssp. toumanoffi 25

Рис. 2. Внешний вид Bacillus thuringiensis sp.

Штамм образует ацетилметилкарбинол, на желтковой среде леци-то-вителлиновая реакция положительная, образует кислоту из маннозы, не образует кислоту при росте на салицине и сахарозе, не гидролизует эскулин, образует уреазу на среде с мочевиной, гидролизует крахмал, пептовизирует молоко, ДНКазная активность отсутствует, ингибирует рост Micrococcus lysodeikticus.

Штамм Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным для теплокровных животных микроорганизмов. Он не является фитопатогенным, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами» в редакции Дополнений и изменений № 2, утвержденных Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 №86.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 5 ООО кл7м³.

3.    Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества штамма в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.    Методы измерении

Прямой метод основан на аспирации из атмосферного воздуха на-селеиных мест бактерий на мясо-пептонный агар (МПА) и подсчета ко-

личества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5. /. Средства измерений Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5—790 мм рт. ст. и пределом допустимой погрешности ± 2,5 мм рт. ст.

Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ± 0,2 мг Колбы мерные 2-100-2,2-250-2, 2-1000-2 Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см³ Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0—55 °С

Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2 Вспомогательные устройства и материалы Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ±5) °С

Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (30 ± 2) °С и (37 ± 2) °С Автоклав электрический Стерилизаторы паровые медицинские

Дистиллятор

Облучатель бактерицидный настенный

Холодильник бытовой

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой

Лупа с увеличением х10 Пробирки типов П1, П2 Спиртовки лабораторные стеклянные Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов Воронки конусные диаметром 40—45 мм Груша резиновая Петля бактериологическая Марля медицинская Вата медицинская гигроскопическая Бумага фильтровальная лабораторная

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический Мясо-пептонный бульон (МПБ) Спирт этиловый технический Спирт этиловый ректификованный

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характерисгиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации штамма в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.

6.1.    СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами Ш—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

6.2.    СП 1.3.2518—09 Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322—08.

6.3.    Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.4.    Требования по электробезоиасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5.    Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха    (20 ± 5) °С;

-    атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

* влажность воздуха    не    более    80    %.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления мясо-пептонного агара (МПА) к 1 ООО см³ мясо-пептонного бульона (МПБ) добавляют 15,0 г агар-агара, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250— 500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563—96 «Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой

недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха стерильный МПА расплавляют, остужают до 50—60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК

4.2.2316— 08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2—8) °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 ± 2) °С. Через 1—2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК

4.2.2316— 08. Для этого эталонный музейный штамм В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 высевается на 2—3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2—3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К= (ГГ X 1 000) / С X Т клУм\ где К - концентрация В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе, кп./м³;

Я - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент перерасчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.