Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3526—18

Издание официальное

Москва • 2018

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе рабочей зоны

Мегодические указания МУК 4.2.3526—18

Протокол №

количественного микробиологического анализа Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе рабочей зоны

1.    Дата проведения анализа__

2.    Рабочее место (профессия работающего)_

3.    Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы)_

3.    Вид пробоотборника_

4.    Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб_

5.    Питательная среда, время инкубации_

6.    Результаты испытания ростовых свойств питательной среды_

7.    Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний)___

8.    Результаты идентификации микроорганизмов В. thuringiensis ssp. toumanoffi

25 (морфологические признаки)___

9.    Результаты расчета концентрации штамма_

10.    Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКр.з. _

11.    Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись)_

12.    Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись)___

Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3526—18

Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 27.12.18 Формат 60x88/16    Печ.    л. 0,75

Тираж 100 экз.    Заказ    85

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5,7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован Федеральным центром гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, тел.: 8 (495) 633-86-59

ББК 51.24 М54

М54 Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе рабочей зоны: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2018.—10 с.

ISBN 978-5-7508-1671-2

1.    Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н. И. Шеина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.24

ISBN 978-5-7508-1671-2

€> Роспотребнадзор, 2018

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

1 февраля 2018 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3526—18

Действующей основой препарата являются кристаллы белкового 5-эндотоксина и жизнеспособные споры штамма В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25. Содержание жизнеспособных спор в инсектициде «Био-слип БТ, П» составляет не менее 1 х Ю¹⁰ КОЕ/г, количество кристаллов токсина равно общему количеству спор в препарате. В качестве вспомогательных веществ инсектицид содержит остатки защитной среды для сублимационной сушки - неорганические фосфаты, сухое молоко, желатин. Инсектицид представляет собой водорастворимый порошок.

Кристаллы токсина действуют в кишечнике насекомого при поедании, белковый токсин растворяется в кишечном соке насекомого при pH 9,5—10,5 и переходит в активную форму под действием протеолитических ферментов кишечного сока. В активном состоянии токсины формируют поры в клетках эпителия кишечника, что в дальнейшем приводит к гибели насекомого.

После попадания в кишечник насекомого гибель наступает в промежутке от 6 до 48 часов, в зависимости от вида насекомого, стадии его развития, количества попавшего в кишечник 5-эндотоксина.

Белковый 5-эндотоксин конденсируется в кристаллы ромбовидной формы (параспоральныс тельца) и экскретируется на завершающей стадии спорообразования. Кристаллический 5-эндотоксин обладает высокой термостабильностью.

Штамм В. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 представляет собой грам-положительные, подвижные, образующие жгутики палочки размером 0,7—1,2 х2,5—4,0 мкм. Через 48 часов роста на МПА образуют овальные споры размером 0,6—0,8 х 1,2—2,0 мкм. Одновременно со спорой образуются параспоральные тельца ромбовидной формы разных размеров. На среде АГВ и картофельно-глюкозном агаре образуют серые полупрозрачные колонии с ровным краем. Оптимальная температура роста +28—31 °С.

Систематическое положение микроорганизма

Царство    Procaryota

Класс    Schizomycetes

Отряд    Eubacteriales

Семейство    Bacillaceae

Род    Bacillus

Вид    thuringiensis

Штамм    ssp. toumanoffi 25

Рис. 2. Внешний вид Bacillus thuringiensis sp.

Штамм образует ацетилметилкарбинол, на желтковой среде леци-то-витсллиновая реакция положительная, образует кислоту из маннозы, не образует кислоту при росте на салицине и сахарозе, не гидролизует зекулин, образует уреазу на среде с мочевиной, гидролизует крахмал, пептонизирует молоко, ДНКазная активность отсутствует, ингибирует рост Micrococcus lysodeikticus.

Штамм Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным для теплокровных животных микроорганизмов. Он не является фитопатогенным, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами» в редакции Дополнений и изменений № 2, утвержденных Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 № 86.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50 ООО кл./м³.

3.    Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.    Методы измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны бактерий на мясо-пептонный агар (МПА) и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5—790 мм рт. ст. и пределом допустимой погрешности ± 2,5 мм рт. ст.

Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ± 0,2 мг Колбы мерные 2-100-2,2-250-2, 2-1000-2 Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0,5,0, 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см³ Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0—55 °С

Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ±5)°С

Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (30 ± 2) °С и (37 ± 2) °С Автоклав электрический Стерилизаторы паровые медицинские

Дистиллятор

Облучатель бактерицидный настенный Холодильник бытовой Микроскоп биологический с иммерсионной системой

Лупа с увеличением х10    ГОСТ 25706-83

Пробирки типов П1, П2    ГОСТ 25336-82

Спиртовки лабораторные стеклянные    ГОСТ 23932-90

Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов    ГОСТ 23932-90

Воронки конусные диаметром 40—45 мм    ГОСТ 25336-82

Груша резиновая    ТУ 9398-005-0576-908

Петля бактериологическая

Марля медицинская    ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая    ГОСТ 25556-81

Бумага фильтровальная лабораторная    ГОСТ 12026-76

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический Мясо-пептонный бульон (МПБ) Спирт этиловый технический Спирт этиловый ректификованный

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации штамма в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1.    СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—ГУ групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

6.2.    СП 1.3.2518—09 Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322—08.

6.3.    Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.4.    Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5.    Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

-    температура воздуха (20 ± 5) °С;

-    атмосферное давление 760 ± 20 мм рт. ст.;

-    влажность воздуха    не    более    80    %.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления млсо-иептоиного агара (МПА) к 1 ООО см³ мясо-пептонного бульона (Ml Lb) добавляют 15,0 г агар-агара, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250— 500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением № 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой

недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха МПА расплавляют, остужают до 50—60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1. МУК

4.2.2316- -08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2—8) °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 ± 2) °С. Через 1—2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК

4.2.2316— 08. Для этого эталонный музейный штамм Bacillus thuringien-sis ssp. toumanoffi 25 высевается на 2—3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2—3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11.    Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К=(Пх 1 000) / С х Т кл./м³, где К - конце1лрация Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе, кл./м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м* воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т- время аспирации, мин.

12.    Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по ниже приведенной форме.