Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации Komagataella (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.2.3385—16

Издание официальное

Москва • 2017

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации Komagataella (.Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225 в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.2.3385—16

ББК 51.21 М59

М59 Микробиологическое измерение концентрации Komaga-lae/la (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225 в атмосферном воздухе населенных мест: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2017.—8 с.

ISBN 978—5—7508—1578—4

1.    Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (д.б.н. 11. И. Шеина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией но государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 20 мая 2016 г. .№• 1).

Утверждены Руководителем Фсдорадыюн службы но надзор) к сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. К). По-повой 12 июля 2016 г.

4. Введены впервые.

Ы>К 51.21

Ответственный за выпуск 11. В. Митро\пиа

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка П. В. Ломановой

Подписано в печать 03.04.17 Формат 60x88 16    i    1еч.    л.    0,5

Тираж 125 экз.    Заказ    29

Фсдератьная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18. стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделением издательского обеспечения отдела научно-методического обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, гел./факс: 8 (495) 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2017 ©Федеральный центр гигиены н

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2017

МУК 4.2.33X5—16

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

12 июля 2016 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации Komagataella (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3385—16

1. Назначение и область применения

1.1.    Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Komagataella (Pichia) pastoris ВКГ1М Y-4225 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 5 ООО клеток в 1 м-' воздуха.

1.2.    Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Komagataella pastoris ВКПМ Y-4225 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе населенных мест

Штамм Komagataella (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225, содержащий рекомбинантный фрагмент ДНК, предполагается использовать в промышленном производстве фермента фитазы для кормовых целей.

Мезофил. Рост очень хороший - через 24 часа при 25—28 °С образует колонии на глюкозо-пептон ном агаре (ГПА).

Штамм растет на агаризованных средах - глюкозо-пептон-дрож-жевом агаре (YPD), глицерин-пептон-дрожжевом агаре (YPG). мясо-пептонном агаре (МПА). АГВ-среде. картофельный агаре (КА).

3

МУК 4.2.3385-16

На среде YFD штамм образует клетки округлой, слегка овальной формы размером 5—Юмкм, часть клеток имеет на своей поверхности почки или соединена с дочерними клетками.

При росте на твердой среде образуются гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью свегло-кремового цвета, край неровный. При росте в жидкой среде клетки образуют ровную интенсивную суспензию. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.

Штамм К. pastoris депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов иод номером ВКПМ Y-4225.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 500 кл/м\ пометка А.

3.    Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентрации от 5 до 5 ООО клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0.95.

4.    Методы измерений

Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест клеток псевдомицелия и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5. /. Средства измерении

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5—790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ± 2,5 мм рт. ст.

Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ± 0,2 мг Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0 и 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см³ Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0—55 °С

4

МУК 4.2.3385— 16

Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование средств измерения е аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 ± 2) и (37 ± 2) °С Автоклав электрический Стерилизаторы паровые медицинские

Дистиллятор

Облучатель бактерицидный настенный Холодильник бытовой Микроскоп биологический с иммерсионной системой

Лупа с увеличением х 10 Пробирки типов П1, П2 Спиртовки лабораторные стеклянные Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов Воронки конусные диаметром 40—45 мм Груша резиновая Петля бактериологическая Марля медицинская Вата медицинская гигроскопическая Бумага фильтровальная лабораторная

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический Вода дистиллированная Глюкоза

Пептон сухой ферментативный Спирт этиловый технический Спирт этиловый ректификованный

5

МУК 4.2.3385- 1ft

Дрожжевой экстракт, сухой    ГОСТ    17206 -84

Примечание Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток гриба в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.

-СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III IV ipynn патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»;

-    СП 1.3.2518— 09 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322—08»;

ГОСТ 12.1.019-79 «ССБТ. Электробезопасность. Электробезопасность при работе с электроустановками» и инструкции по эксплуатации прибора.

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

-    температура воздуха (20 ± 5)°С;

-    атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

-    влажность воздуха    не    более 80 %.

9. Приготовление глюкозо-пептон-дрожжевого агара (YPD)

Для приготовления глюкозо-пептон-дрожжевого агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 000 см³): пептон -10,0 г; глюкоза - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 10,0 г; агар-агар - 15,0 г; дистиллированная вода - 1 000 см³.

Сухие компоненты растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250— 500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

6

МУК 4.2.3385 - 16

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 10 дней, не более.

10. Проведение измерения

I0.J. Отбор проб eo sdyxa

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563— 96 «Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крыш-ку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (YPD) расплавляют, остужают до 50—60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1. МУК 4.2.2316—08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2—8) °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помешают в термостат с температурой (28 ± 2) °С. Через 1—3 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требования-

7

МУК 4.2.3385 -16

ми к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316—08. Для этого эталонный музейный штамм К. pustoris ВКГ1М Y-4225 высевается на 2—3 чашки используемой среды.

Возможны только 2—3 пассажа лиофилизованной культуры музейного штамма во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

/7 1 ООО

С т

К концентрация штамма в воздухе, клУм,

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри: 1 ООО - коэффициент пересчета на 1 м* воздуха:

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме:

Протокол JV-_

количественного микробиологического анализа штамма Komagataella pastoris ВКП.М Y-4225 в атмосферном воздухе населенных мест

1.    Дата проведения анализа_________

2.    Рабочее место (профессия работающего)_________________

3.    Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ___________

4.    Вид пробоотборника_____________

5.    Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб

6.    Питательная среда, время инкубации_______

7.    Результаты испытания ростовых свойств питательной среды __

8.    Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний)______

9.    Результаты идентификации микроорганизмов К. pastoris ВКПМ Y-4225

(микроморфологические признаки)___

10.    Результаты расчета концентрации штамма_____

11.    Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКа.в.__

12.    Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись)__

13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись)____________