Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации Komagataella (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3384—16

Издание официальное

Москва • 2017

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации Komagataella (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3384—16

ББК 51.24 М59

М59 Микробиологическое измерение концентрации Komaga-taella (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225 в воздухе рабочей зоны: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2017.—8 с.

ISBN 978—5—7508—

1.    Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (д.б.н. Н. И. Шеина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 20 мая 2016 г. № I).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 12 июля 2016 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.24

Ответственный за выпуск Н. В. Митрохина

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 03.04.17 Формат 60x88/16    Печ. л. 0,5

Тираж 125 экз.    Заказ 28

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5,7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделением издательского обеспечения отдела научно-методического обеспечения Федеральною центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, тел./факс: 8 (495)952-50-89

© Роспотребнадзор, 2017 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2017

МУК 4.2.3384—16

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

12 июля 2016 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации KomagataeUa (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3384—16

МУК 4.2.3384—16

При росте на твердой среде образуются гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью светло-крем о во го цвета, край неровный. При росте в жидкой среде клетки образуют ровную интенсивную суспензию. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.

Штамм К. pastoris депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4225.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 5 ООО кл/м³, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 ООО клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Методы измерений

Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток псевдомицелия и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.

5.1. Средства измерений

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5—790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ± 2,5 мм рт. ст.

Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ± 0,2 мг Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см³ Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0—55 °С

Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

МУК 4.2.3384—16

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

щий поддерживать температуру (160 ± 5) °С Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 ± 2) и (37 ± 2) °С Автоклав электрический Стерилизаторы паровые медицинские

Дистиллятор

Облучатель бактерицидный настенный Холодильник бытовой

Микроскоп биологический с иммерсионной системой

Лупа с увеличением х 10 Пробирки типов П1, П2 Спиртовки лабораторные стеклянные Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов Воронки конусные диаметром 40—45 мм Груша резиновая Петля бактериологическая Марля медицинская Вага медицинская гигроскопическая Бумага фильтровальная лабораторная

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды Агар микробиологический    ГОСТ 17206-96

Вода дистиллированная    ГОСТ 6709-90

Глюкоза    ГОСТ 6038-79

Пептон сухой ферментативный    ГОСТ 13805-76

Спирт этиловый технический    ГОСТ 17299-78

Спирт этиловый ректификованный    ГОСТ Р 51652-2000 или

ГОСТ 18300-87

Дрожжевой экстракт, сухой    ГОСТ 17206-84

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками. ¹

МУК 4.2.3384—16

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток гриба в воздухе рабочей зоны соблюдают требования следующих нормативных документов:

-СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III— IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»;

-    СП 1.3.2518—09 «Безопасность работы с микроорганизмами III— IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322—08»;

-ГОСТ 12.1.019-79 «ССБТ. Электробезопасность. Электробезопасность при работе с электроустановками» и инструкции по эксплуатации прибора.

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

-    температура воздуха (20 ± 5) °С;

-    атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

-    влажность воздуха    не    более    80    %.

9. Приготовление глюкозо-пептон-дрожжевого агара (YPD)

Для приготовления глюкозо-пептон-дрожжевого агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 000 см³): пептон -10,0 г; глюкоза - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 10,0 г; агар-агар - 15,0 г; дистиллированная вода - 1 000 см³.

Сухие компоненты растворяют в 1 000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250— 500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 10 дней, не более. ²

МУК 4.2.3384—16

10. Проведение измерения

10.1.    Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетов требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением № 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. «ГСИ. Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2.    Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (YPD) расплавляют, остужают до 50—60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316—08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2—8)°С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 ± 2) °С. Через 1—3 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316— 08. Для этого эталонный музейный штамм К. pastoris ВКПМ Y-4225 высевается на 2—3 чашки используемой среды. ³

МУК 4.2.3384—16

Возможны только 2—3 пассажа лиофилизованной культуры музейного штамма во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

_ Я-1000 СТ

К - концентрация штамма в воздухе, кл/м³;

Я - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри; 1 ООО - коэффициент пересчета на 1 м* воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т- время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по ниже приведенной форме.

Протокол №_

количественного микробиологического анализа Komagataella pastoris ВКПМ Y-4225 в воздухе рабочей зоны

1.    Дата проведения анализа__

2.    Рабочее место (профессия работающего)_____

3.    Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая сталия, точка отбора пробы)__

4.    Вид пробоотборника_____

5.    Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб

6.    Питательная среда, время инкубации_

7.    Результаты испытания ростовых свойств питательной среды_

8.    Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний)__

9.    Результаты идентификации микроорганизмов К. pastoris ВКПМ Y-4225

(морфологические признаки)____

10.    Результаты расчета концентрации штамма_

11.    Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК_рз _

12.    Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись)_

1

2

3

13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись)__