Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3382—16

Издание официальное

Москва • 2017

Федеральная служба но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3382—16

ББК51.24

M59

M59 Микробиологическое измерение концентрации штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в воздухе рабочей зоны: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2017.—8 с.

ISBN 978—5—7508—1566—1

1.    Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (д.б.н. Н. И. Шеина).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 20 мая 2016 г. № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 12 июля 2016 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.24

Ответственный за выпуск Н. В. Митрохина

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 03.03.17 Формат 60x88/16    Печ. л. 0,5

Тираж 125 экз.    Заказ 23

Фсдер&пьная служба по надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., л 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделением издательского обеспечения отдела научно-методического обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, тел./факс: 8 (495) 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2017 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2017

МУК 4.2.3382—16

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

12 июля 2016 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.3382—16

Биофунгицид колонизирует корневую систему растений, лишает фито патогенные грибы источников питания и угнетает их рост выделяемыми метаболитами.

Механизм действия на целевой объект обусловлен возникновением антагонистических отношений между активными вегетативными клетками штамма OPS-32 и вредителем посредством воздействия антибиотиков, гидролитических ферментов, синтезируемых клетками штамма.

Клетки палочковидные размером (0,6—0,8 х 1,7—2,2) мкм, подвижные, снабжены перитрихиями, грамположительные, образующие споры, которые занимают центральное положение и имеют овальную форму.

Штамм хорошо растет на следующих средах: мясо-пептонный агар (МПА), картофельно-глюкозный агар (КГА), LB-arap. Колонии штамма круглые с фестончатым краем, непрозрачные, матовые, молочно-белые, в агар не врастают; по консистенции вязкие и тягучие, поверхность колонии мягкая, но плотная. Центр выделен в виде кратера и заметно приподнят. Размеры колеблются от 5—8 до 12—15 мм в диаметре в зависимости от ростовой среды и возраста колонии. Поверхность шероховатая, хорошо заметна тенденция к появлению складок. Край колонии может быть ровным, чаще складчатый, шероховатый. Для культивирования используется LB-arap, оптимальная температура (28 ± 2) °С.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50 ООО кл/м³.

3.    Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.    Методы измерений

Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны бактерий на LB-aiap и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5—790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ± 2,5 мм рт. ст. ТУ 2504-1799—75 ¹

МУК 4.2.3382—16

Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ± 0,2 мг Колбы мерные 2-100-2,2-250-2, 2-1000-2 Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см³ Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см³ Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0—55 °С Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 ± 2) и (37 ± 2) °С Автоклав электрический Стерилизаторы паровые медицинские

Дистиллятор

Облучатель бактерицидный настенный Холодильник бытовой Микроскоп биологический с иммерсионной системой

ГОСТ 25706-83 ГОСТ 25336-82 ГОСТ 23932-90

ГОСТ 23932-90 ГОСТ 25336-82 ТУ 9398-005-0576-9082—03

ГОСТ 9412-77 ГОСТ 25556-81 ГОСТ 12026-76

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды Агар микробиологический    ГОСТ    17206—96 ²

Бакто-триптон

Вода дистиллированная    ГОСТ 6709-90

Дрожжевой экстракт    ГОСТ 10444.1-84

Натрий хлористый, хч    ГОСТ 4233-77

Спирт этиловый ректификованный    ГОСТ Р 51652-2000 или

ГОСТ 18300-87

Спирт этиловый технический    ГОСТ 17299-78

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации штамма в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1.    Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322—08.

6.2.    Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322—08: СП 1.3.2518—09.

6.3.    Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4.    Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5.    Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

-    температура воздуха (20 ± 5) °С:

-    атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

-    влажность воздуха    не    более    80    %.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления агаризованной LB-среды смешивают указанные компоненты (г/дм³): бакто-триптон - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 5,0 г; ³

МУК 4.2.3382—16

натрий хлористый - 10,0 г; агар-агар - 17,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1,0 дм³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Смесь нагревают до полного растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин и охлаждают до 60°. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250—500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1.    Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением № 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-й этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2.    Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха стерильную LB-среду расплавляют, остужают до 50—60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316—08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2—8) °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (8±2)°С. Через 1—2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам. ⁴

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316—08. Для этого эталонный музейный штамм Bacillus amylolique-faciens О PS-32 высевается на 2—3 чашки используемой среды.

Возможны только 2—3 пассажа лиофилизованной культуры музейного штамма во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

₌ П • 1 ООО СТ

К- концентрация Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в воздухе, кл/м³; П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 ООО - коэффициент пересчета на 1 м^у воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т- время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.

Протокол №_

количественного микробиологического анализа Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в воздухе рабочей зоны

1.    Дата проведения анализа_

2.    Рабочее место (профессия работающего)_

3.    Место отбора пробы (название и адрес организации, производст во, технологическая стадия, точка отбора пробы) _

4.    Вид пробоотборника____

5.    Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб

6.    Питательная среда, время инкубации__

7.    Результаты испытания ростовых свойств питательной среды_

8.    Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний)_

9.    Результаты идентификации микроорганизмов Bacillus amyloliquefaciens

OPS-32 (морфологические признаки)__

10.    Результаты расчета концентрации штамма_

11.    Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК_Р, _

12.    Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись)_

1

2

3

4

13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись)__