Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.2656—10

Издание официальное

Москва • 2010

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.2656—10

МУК 4.2.2656—10

ния с окуляром 10^х в плоскости объекта 1,14 мм; рекомендуемый окуляр - К-6,3\

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации микробных клеток Aspergillus niger ВКПМ F-171 в 1 м³ воздуха выполняют на основании 5 проб, полученных при разном времени аспирации (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин) в каждой точке контроля, и производят по формуле;

Я-1 ООО Ct

К - концентрация клеток продуцента в воздухе, кл./м³;

Я - количество колоний продуцента, выросших на чашке Петри; / ООО - коэффициент пересчета 1 дм³ в 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации, дм³/мин; t - время аспирации, мин.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №

количественного микробиологического анализа штамма-продуг^ента Aspergillus niger ВКПМ F-I71 в воздухе рабочей зоны

L Дата проведения анализа_

2.    Место отбора пробы _

3.    Название лаборатории_

4.    Юридический адрес организации

10

МУК 4.2.2656—10

Список литературы

1.    ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны». М.: Стандартинформ, 1988. 49 с.

2.    ГОСТ Р 8.563-96. «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений». М.: Госстандарт России, 1997. 19 с.

3.    Р 2.2.2006—05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда». М.: Госстандарт России, 2005. 40 с.

4.    Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

5.    Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

6.    СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитных болезней». М.: Минздрав России, 2008. 19 с.

7.    ИК 01-00334557—97 «Инструкция по биологическому и химическому контролю производства пищевой лимонной кислоты». СПб.: ВНИИПАКК, 1997. 268 с.

Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2.2656—10

Редакторы Н. В. Кожока, Е. В. Николаева Технический редактор Г. И. Климова

Подписано в печать 21.10.10

Тираж 100 экз.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел./факс 952-50-89

ББК 51.21 М54

М54 Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны: Методические указания.— М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.—11 с.

1.    Разработаны Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (д.м.н. В. Г. Май-мулов, д.м.н. И. Ш. Якубова, д.м.н. Т. С. Чернякина), Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАЮС РАСХН) (к.б.н. Н. Ю. Шарова, д.т.н. Т. А. Никифорова, к.т.н. Д. X. Кулев, О. А. Ходкевич).

2.    Рекомендованы Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 9 июля 2010 г.

4.    Введены в действие с момента утверждения.

5.    Введены впервые.

ББК 51.21

© Роспотребнадзор, 2010 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010

МУК 4.2,2656—10

Содержание

1. Общие положения и область применения...........................................................4

2.    Биологическая характеристика штамма-продуцента Aspergillus rtiger

ВКПМ F-171 и его гигиенический норматив.....................................................5

3.    Пределы измерений...............................................................................................6

4.    Метод измерений...................................................................................................6

5.    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы.........................6

5.1.    Средства измерений, вспомогательные устройства.................... 7

5.2.    Реактивы, растворы........................................................................................7

6.    Требования безопасности................................................................. 7

7.    Требования к квалификации операторов.............................................................8

8.    Условия измерений................................................................................................8

9.    Проведение измерения..........................................................................................8

9.1,    Условия отбора проб воздуха........................................................................8

9.2.    Выполнение анализа......................................................................................9

10.    Вычисление результатов измерения..................................................................10

11.    Оформление результатов измерений.................................................................10

Список литературы...................................................................................................11

3

МУК 4.2.2656—10

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

09 июля 2010 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны

Методические указания МУК 4.2*2656—10

МУК 4.2,2656—10

Методические указания предназначены для применения в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Биологическая характеристика штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 и его гигиенический норматив

Продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-17J относится к микромицетам. Уже на 2-е сутки на поверхности среды Чапека или сусло-агара при температуре 32 °С клетки (кл.) образуют округлые колонии диаметром 2,0 см с плоским субстратным мицелием, аспоро-генные. На S-е сутки роста они достигают максимального диаметра в среднем 8,1 см на среде Чапека и 8,6 см - на сусло-агаре. Окраска гигантской колонии бежевая - на среде Чапека, светло-бежевая - на сусло-агаре. Воздушный мицелий сильно развит: от поверхности субстратного мицелия вертикально поднимаются несептированные клетки - конидиенос цы. Минимальная длина конидиеносца 48 мкм, максимальная -1 265 мкм. Диаметр поперечного сечения конидиеносца - от 9 до 20 мкм. Верхний конец конидиеносца расширяется, образуя вздутие -пузырек диаметром от 20 до 60 мкм. От поверхности пузырька синхронно образуются цилиндрические выросты - стеригмы двуслойной структуры. От каждой стеригмы первого слоя отделяются в основном две вторичные стеригмы. Стеригмы первого слоя вдвое крупнее, чем стеригмы второго слоя. Длина стеригм первого слоя - от 6 до 32 мкм, второго слоя - от 5 до 10 мкм. Стеригмы второго слоя образуют цепочки конидий, созревание которых начинается на вторые сутки. Конидии имеют шарообразную форму, диаметр - 4,1 мкм, толстую пигментированную оболочку с шипами. Вздутие конидиеносца, стеригмы и конидии являются составляющими конидиальной головки, диаметр сечения которой колеблется от 44 до 132 мкм. В центре колонии конидиальные головки расположены плотно. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,5 см - на среде Чапека и 0,6 см - на сусло-агаре наблюдается светлая зона с незрелыми белыми конидиальными головками, плотно прижатыми к субстратному мицелию. Обратная сторона колонии гладкая, белая. ¹

МУК 4.2.2656—10

Систематическое положение микроорганизма

Fungi

Neomycota

Ascomycota

Euascomycotina

Plectomycetes

Hyphomycetales

Aspergillus

Niger

ВКПМ F-171, ГУВНИИПАКК

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-171 получен в ГУ ВНИИПАКК методом мутагенеза из штамма Aspergillus niger Л-1 с использованием химических мутагенов и УФ-облучения в сочетании с отбором спонтанных вариантов и депонирован в ВКПМ как продуцент лимонной кислоты.

Штамм растет на жидких агаризованных средах. Оптимальная температура - от 28 до 32 °С. Для размножения используется сусло-агар (значение Баллинга 7°).

Предельно допустимая концентрация Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны - 1 х 10³ кл./м³, пометка А, класс опасности 3.

3. Пределы измерений

Методика позволяет выполнить измерения количества клеток продуцента лимонной кислоты в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5 ООО клеток в 1 м³.

4. Метод измерений

Метод измерения концентрации конидий штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 основан на аспирации из воздуха конидий микромицета на поверхность среды Чапека или сусло-агар, подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2-е сутки роста и контроля их развития на 5-е сутки роста.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

МУК 4.2.2656—10

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства

Импактор воздуха микробиологический «Флора-100»

Термостаты электрические

суховоздушные типа ТС

Автоклав электрический

Бокс, оборудованный бактерицидными

лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические

ВЛА-200-М

Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм Колбы конические

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа МБИ-15

Термометр

Прибор для определения влажности воздуха

5.2. Реактивы, растворы Среда Чапека    ТУ 9229-014-00419789—95

(или сухой бакто-агар Czapek)    (или    импортного    произ

водства)

Среда сусло-агар с массовой концентрацией

лимонной кислоты 1,0 %    ГОСТ    10444.1—84

Спирт этиловый ректификованный

из пищевого сырья    ГОСТ Р 51652-2000

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации конидий продуцента Aspergillus niger BKT1MF-I7l в воздухе рабочей зоны соблюдают:

•    правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;

•    правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;

•    требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980); ²

МУК 4.2.2656—10

•    положения инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (1977);

•    санитарные правила по работе с микроорганизмами СП 1.3.2322—08;

•    требования безопасности при работе с продуцентом лимонной кислоты, изложенные в инструкции по контролю производства лимонной кислоты (1997).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Измерение концентрации конидий штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны проводят с помощью прибора «Фора-100» при температуре окружающей среды от 0 до 50 °С и относительной влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.L Условия отбора проб воздуха

Определение концентрации конидий микромицета Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений проводят в результате их аспирации на плотную питательную среду Чапека или сус-ло-агар с последующей инкубацией в термостате и подсчетом выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

Воздух аспирируют с помощью импактора «Флора-100» в автоматическом режиме со скоростью 10 дм³/мин на поверхность среды Чапека или сусло-агара на чашки Петри. Линейная скорость анализируемого воздуха автоматически поддерживается на уровне, позволяющем осаждать с 50 % эффективностью частицы диаметром не менее 1,4 мкм (D₅₀). Контроль параметров (заданный отбираемый объем воздуха, текущий отобранный объем) осуществляется методом индикации.

МУК 4.2.2656—10

Аспирацию воздуха проводят с интервалом 2 мин и отбирают по 5 проб (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин) в каждой точке контроля. Выбор точек контроля определяется в соответствии с МУК 4.2.734—99.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора по форме:

Акт отбора проб

1.    Дата, Ф.,И.,0. работающего (рабочее место) _

2.    Профессия _

3.    Предприятие (лаборатория, подразделение)_

4.    Участок (технологическая стадия, операция)_

5.    Место отбора (наименование рабочей зоны) _

6.    Прибор для отбора проб__

7.    Количество проб и точка их отбора_

8.    Условия отбора проб (объем прокаченного воздуха и время

аспирации)____

9.    Дата последней метрологической поверки оборудования для

отбора проб____________

10.    Микроорганизм, содержание которого контролируется (род, вид,

штамм)______

11.    Питательная среда, оптимум роста, время инкубации _

Ответственный исполнитель Руководитель (технологического участка, лаборатории, подразделения)

9.2. Выполнение анализа Агаризованную среду Чапека (сухой бакто-агар Czapek готовят согласно документации фирмы-производителя) или сусло-агар расплавляют, остужают до 50—60 °С и разливают в стерильные чашки Петри по 20 см³. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.

После отбора проб воздуха на чашки Петри их помещают в термостат при температуре 32 °С на 48 ч, по истечении которых производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. Микроскопирование культуры проводят с помощью микроскопа биологического с иммерсионной системой типа МБИ-15 в следующих условиях: объектив - плана-похроматический; увеличение - 40,0 х 0,65; система - сухая; поле зре-

9

1

2