Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Санитарно-бактериологические исследования методом разделенного импеданса
Методические указания МУК 4.2.2578—10
Издание официальное
Москва «2010
Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Санитарно-бактериологические исследования методом разделенного импеданса
Методические указания МУК 4.2.2578-10
ББК 51.9 С18
С18 Санитарно-бактериологические исследования методом разделенного импеданса: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.-76 с.
ISBN 978-5-7508-0890-8
1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (И. В. Брагина); ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (А. И. Верещагин, М. В. Зароченцев, И. В. Новокщонова, М. А. Ярославцева); ФГУН ГНЦ МПБ Роспотребнадзора (М. В. Храмов, В. М. Храмов); ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве* (Н. Я. Салова); фирмой «SY-LAB Gerate GmbH», Австрия (М. Шинкингер, Е. Я. Слободецкая, М. Б. Беглов).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 03.12.09 № 3).
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г. Г. Онищенко 19.02.10.
4. Введены взамен МУК 4.2.590—96 «Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора «БакТрак 4100* и методических указаний «Использование метола измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-бактериологического исследования обьекгов окружающей среды», 2005 г
ББК 51.9
Редакторы Л. С. Кучурова, Е В. Николаева Технический редактор А А. Григорьев
Подписано в печать 22.06.10 Формат 60x88/16 Печ.л.4,75
Тираж 200 экз. Заказ 41
Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прая потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер. д. 18, стр. 5,7
Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а
Отделение реализации, тел./факс 952-50-89
© Роспотребнадзор, 2010
© Федеральный центр гигиены
и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010
МУК 4.2.2578—10Содержание
1. Область применения.............................6
2. Нормативные ссылки.............................7
3. Сущность импедансного метода.......................7
4. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды........9
4.1. Экспресс-анализатор «БакТрак 4300»................9
4.2. Экспресс-анализатор «БакТрак 4100»...............10
4.3. Экспресс-анализатор «БиоТрак 4250»...............10
5. Установка параметров измеренияпри работе
на приборах серии «БакТрак 4000»....................11
5.1. Установка параметров измерения при работе
на приборе «БакТрак 4100».....................11
5.2. Установка параметров измерения при работе
на приборе « БакТрак 4300».....................12
5.3. Установка параметров измерения при работе
на приборе «БиоТрак 4250».....................13
6. Методики определения санитарно-показательных,
условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.........15
6.1. Определение мезофильных аэробных и факультативных
анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)..........15
6.2. Определение колиформных бактерий..............16
6.3. Определение колиформных бактерий в воде..........18
6.4. Определение Е. соИ..........................19
6.5. Определение энтеробактерий...................20
6.6. Определение Pseudomonas......................21
6.7. Определение сальмонелл......................22
6.8. Определение энтерококков.....................25
6.9. Определение Staphylococcus aureus.................26
6.10. Определение листерий.......................27
6.11. Определение микроорганизмов методом измерения
«непрямого» импеданса.......................29
3
6.12. Определение дрожжей и плесневых грибов...........30
6.13. Определение лактобацилл.....................31
6.14. Определение сульфитредуцируюших клостридий.......32
6.15. Определение Clostridium perfringes.................34
6.16. Определение Bacillus cereus.....................35
6.17. Определение аэробных спорообразующих бактерий......36
6.18. Определение микробного загрязнения объектов
внешней среды обитания методом смывов............37
6.19. Определение общего количества ингибирующих веществ
(вт. ч. антибиотиков) в пищевых продуктах...........39
6.21. Контроль стерильности фармакологических препаратов . . . 44
6.22. Определение мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов в косметической продукции . 46
6.23. Определение мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов в косметической продукции,
6.20. Контроль стерильности.......................41
используя непрямой метод.....................47
7. Основные этапы создания калибровочного файла...........49
7.1. Основные этапы создания калибровочного файла
при работе на приборе «БакТрак 4100»..............51
7.2. Основные этапы создания калибровочного файла
при работе на приборе «БакТрак 4300*.............. 52
7.3. Основные этапы создания калибровочного файла
при работе на приборе «БиоТрак 4250*.............. 52
8. Типичные кривые изменения импеданса при определении
санитарно-показательных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов..............................54
9. Питательные среды. Назначение, приготовление, использование. . 61
9.1. Назначение питательных сред...................61
9.2. Приготовление питательных сред.................61
9.3. Питательная среда BiMedia 130А.................62
9.4. Питательная среда BiMedia 150А.................62
9.5. Питательная среда BiMedia 165А.................63
9.6. Питательная среда BiMedia 201С.................63
9.7. Питательная среда BiMedia 205А.................64
9.8. Питательная среда PreMedia 350А.................65
9.9. Питательная среда FDA-бульон и UVM среда..........66
9.10. Питательная среда BiMedia 401А.................66
9.11. П итател ьная среда Bi Media 610А.................66
9.12. Питательная среда BiMedia 630А.................67
9.13. Питательная среда BiMedia 660А.................67
9.14. Реагент для инактивации консервантов и ингибиторов
4
МУК 4.2.2578-10
Supplement 1..............................69
9.15. Реагент для определения КМАФАнМ в сухой сыворотке
Supplement М.............................69
9.16. Инактивационная смесь......................69
9.17. Тиогликолевая среда.........................70
10. Методика тестирования и подготовки измерительных ячеек
и прибора...................................70
10.1. Методика тестирования измерительных ячеек и прибора ... 70
10.2. Методика обработки измерительных ячеек и прибора.....71
11. Ячейки, готовые к использованию (предварительно заполненные
средой)....................................74
12. Питательные среды для экспресс-анализаторов серии
♦БакТрак 4000*, производимые в Российской Федерации......74
13. Оценка результатов измерения для количественных анализов. . . . 75
13.1. Воспроизводимость результатов измерения...........75
13.2. Определение неопределенности измерения (НИ).......75
14. Библиографические данные........................75
5
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
19 февраля 2010 г.
Дата введения: с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Санитарно-бактериологические исследования методом разделенного импеданса
Методические указания МУК 4.2.2578-10
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также мониторинг их микробной загрязненности; лабораторий других организаций, аккредитованных в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья и пищевых продуктов; организаций, независимо от форм собственности осуществляющих производственный контроль продовольственного сырья и пищевых продуктов в процессе промышленного производства и оборота продукции.
1.2. Методические указания представляют ускоренный метод качественного и количественного определения санитарнопоказательных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, регламентированных действующими документами (технические регламенты, СанПиН, ГОСТ, МУК, МУ и т. д.).
МУК 4.2.2578—10
2. Нормативные ссылки
1. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. № 52—ФЗ.
2. Федеральный закон «О качестве и безопасности пищевых продуктов» от 02 января 2000 г. N? 29-ФЗ.
3. СанПиН 2.3.2.1078—01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
4. СанПиН 2.3.2.1280—03 «Дополнения и изменения 2 кСаН-ПиН 2.3.2.1078—01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
5. ГОСТ 51446-99 (ИСО 7218—96) «Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».
6. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологического анализа».
7. СанПиН 1.2.681—97 «Производство и контроль парфюмерно-косметической продукции для обеспечения ее безопасности и качества».
3. Сущность импедансного метода
Методические указания содержат описание метода ускоренного микробиологического исследования продовольственного сырья, пищевых продуктов и других объектов внешней среды с использованием микробиологических экспресс-анализаторов, регистрирующих изменения электрического сопротивления (импеданса) питательной среды, происходящего под влиянием процессов роста и жизнедеятельности микроорганизмов в исследуемой пробе.
Классические методы микробиологических исследований, используемые в практике бактериологических лабораторий, требуют больших затрат труда и времени, достаточно длительны и позволяют получать результаты в течение нескольких дней.
Предлагаемый метод на основе метода разделенного импеданса позволяет получать быстрые (в течение нескольких часов) и надежные результаты для большого числа одновременно исследуемых образцов.
Импеданс - сопротивление потоку переменного тока через проводящий материал; является функцией активной проводимости, емкостного сопротивления и применяемой частоты.
Приборы «БакТрак» серии 4000 на основе метода разделенного импеданса регистрируют 2 определенных показателя импеданса для каждого измерения. Эти величины показаны как М-величина (импеданс среды) и Е-величина (импеданс электрода). Измерения М-параметра представляет собой относительное изменение
МУК 4.2.2578-10
(уменьшение) импеданса среды, выраженное в процентах к начальному измерению. М-параметр в основном отображает ту часть импеданса, которая связана с активной проводимостью. На него непосредственное влияние оказывает ионный состав среды при росте микроорганизмов, а также используемый для анализа образец. В силу этих причин при высокой электропроводимости питательной среды данный параметр теряет значимость. На величину Е-параметра состав питательной среды влияет уже не в столь сильной мере, что весьма важно в случаях, когда используются среды с высоким содержанием солей (т. е. в них добавлены соли в качестве селективных компонентов, используемых для обнаружения патогенных микроорганизмов).
Импедансная микробиология является непрямым культуральным методом обнаружения микроорганизмов с использованием определения электрического импеданса. Изменения импеданса обычно происходят в питательной среде по мере того, как ее химический состав изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов. Под действием микроорганизмов заряженные конечные продукты метаболизма выделяются в ростовую среду. В основном незаряженные или слабо заряженные субстраты превращаются в сильно заряженные конечные продукты. Так, например, белки метаболизируются до аминокислот, углеводы и жиры - до органических кислот. Образующиеся метаболиты имеют меньший размер и, таким образом, более подвижны. Эти электрохимические изменения в ростовой среде приводят к существенным изменениям импеданса. Экспоненциальные изменения импедансного сигнала могут наблюдаться, когда количество микроорганизмов достигает порога около 106—107 клеток/мл.
Время, необходимое для достижения значимого изменения импеданса, называется временем определения импеданса (IDT). Значение IDT обратно пропорционально начальной концентрации микроорганизмов в исследуемой пробе. Ход кривых импедансного сигнала соответствует и отражает кривую роста микроорганизмов в исследуемой пробе.
Среди разработанных и применяющихся в настоящее время исследовательских микробиологических экспресс-анализаторов, предназначенных для ускоренного обнаружения микроорганизмов на основе импедансных технологий, наибольшее распространение получили приборы серии «Бак Трак 4000» производства фирмы «SY-LAB Gerate GmbH» (Австрия).
Прибор «БакТрак» является автоматизированной экспресс-системой для ускоренной количественной и качественной оценки степени микробной контаминации продовольственного сырья,
8
МУК 4.2.2578-10
пищевых продуктов, косметической и фармацевтической продукции, питьевой воды и других объектов внешней среды.
Приборы «БакТрак 4300», «БакТрак 4100» и «БиоТрак 4250» внесены в Реестр средств измерений как кондуктометрические анализаторы для микробиологических исследований. Метод, основанный на измерении импеданса, приборы «БакТрак 4300», «Бак-Трак 4100» и «БиоТрак 4250», внесены в Национальные стандарты ряда европейских стран: Германии - DIN 10115, 10120, 10121, Австрии - ONORM 10115, 10120, 10121, Франции - AFNOR NF V08-105 (Микробиология продуктов питания и кормов: указания по импедансному методу для микробиологических исследований), AFNOR N F V08-106 (Определение количества Е. coli в морепродуктах качественным методом, используя метод прямого импеданса).
Метод валидирован как альтернативный метод анализа в соответствии с ISO 16140:2003 Институтом стандартизации AFNOR, Франция.
4. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды
4.1. Экспресс-анализатор «БакТрак 4300»
Экспресс-анализатор «БакТрак 4300» включает:
- 2 инкубаторных блока для одновременного анализа 64 образцов, каждый инкубаторный блок имеет независимую систему термостатирования;
- управляющий блок (персональный компьютер);
- программное обеспечение; программа позволяет подключать до 12 модулей «БакТрак 4300», обычная конфигурация: 1—3 «БакТрака» подключаются к управляющему блоку;
- измерительные ячейки:
• многоразовые измерительные ячейки (стеклянные) на 10 мл с 4 электродами (с зелеными, желтыми и красными крышками);
• многоразовые измерительные ячейки (стеклянные) на 10 мл с 4 электродами для анаэробов;
• одноразовые измерительные ячейки (пластиковые), стерильные на 20 мл;
• измерительные ячейки для определения дрожжей и плесеней с ограниченным сроком использования на 20 мл (для непрямого метода);
• одноразовые пластиковые стерильные внутренние пробирки для измерительных ячеек непрямого метода на 7 мл.
9
