Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской Федерации_
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение вредных веществ в биологических средах
Сборник методических указаний по методам контроля МУК 4.1.2771—4.1.2774—10
Издание официальное
Москва • 2011
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение вредных веществ в биологических средах
Сборник методических указаний по методам контроля МУК 4.1.2771-4.1.2774—10
7. Условия измерений
7.1. При приготовлении растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:
• температура воздуха (20 ± 5) °С;
• атмосферное давление 630—800 мм. рт. ст.;
• влажность воздуха не более 80 % при температуре 25 °С.
7.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.
8. Подготовка к выполнению измерений
Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.
8.1. Подготовка посуды
Посуду для анализа замочить на 1 час в свежеприготовленном 3 %-ном растворе двухромовокислого калия в серной кислоте (5,70 г двухромовокислого калия на 100 см3 концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.
8.2. Подготовка хроматографической колонки
Хроматографическая капиллярная колонка протестирована на заво-де-из1 отовителе: образец MN-Test температурный режим: колонка - от 80 °С до 320 °С при скорости нагрева колонки 8 °С/мин, детектор ионизации в пламени - 280 °С.
Колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии шумовых сигналов колонка готова к работе.
8.3. Приготовление стандартных растворов
Для построения градуировочного графика готовят серию стандартных растворов. Для этого применяют стандартные образцы.
8.3.1. Исходный стандартный раствор летучих жирных кислот. В мерную пробирку вместимостью 10 см3, вносят 3 см3 изо-бутилового спирта, добавляют 15 мм3 уксусной кислоты, по 10 мм3 пропионовой, изо-масляной, масляной кислот и по 5 мм3 валериановой, изо-капро-новой и капроновой кислот. Раствор доводят до 5 см3 изо-бутиловым спиртом, перемешивают. Концентрация компонентов в исходной стандартной смеси (с учетом плотности и содержания основного вещества) составляет для уксусной кислоты - 3 120 мкг/см3, пропионовой -
42
МУК 4.1.2773—10
1 996 мкг/см3, изо-масляной кислоты - 1 916 мкг/см3, масляной кислоты - 1918 мкг/см3, валериановой кислоты - 930 мкг/см3, изо-капроновой кислоты - 923 мкг/cir, капроновой кислоты - 923 мкг/см3. Срок хранения раствора 12 ч при комнатной температуре.
8.3.2. 1 % раствор серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 20 см3 дистиллированной воды, добавляют 1 см3 серной кислоты. Объем раствора в колбе доводят до метки после охлаждения дистиллированной водой, перемешивают.
8.3.3. 0,4% раствор натрия гидроксида. В мерную колбу объемом 100 см3 вносят 0,4 г натрия гидроксида и доводят до метки после охлаждения дистиллированной водой, перемешивают.
8.4. Установление градуировочной характеристики
8.4.1. Приготовление градуировочных растворов для калибровки. Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. По 5 стандартным смесям строят зависимость площади пика на хроматограмме (мм2) от концентрации кислоты (мкг/см3). Растворы готовят в мерных пробирках вместимостью 10 см3 из исходного стандартного раствора, в соответствии с табл. 3 объем раствора в каждой пробирке доводят до 2 см3 изобутиловым спиртом.
Таблица 3
Растворы для установления градуировочной характеристики при определении в крови летучих жирных кислот в диапазоне концентраций 0,5—1 мкг/см3 и I—16 мкг/см3 |
Градуировочный раствор |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Объем исходного стандартного раствора, мм3 |
1 |
3 |
5 |
7 |
10 |
Концентрация уксусной кислоты, мкг/см3 |
1,560 |
4,680 |
7,800 |
10,920 |
15,600 |
Концентрация пропионовой кислоты, мкг/см3 |
0,998 |
2,990 |
4,990 |
6,990 |
9,980 |
Концентрация изо-масляной кислоты, мкг/см3 |
0,960 |
2,870 |
4,790 |
6,710 |
9,580 |
Концентрация масляной кислоты, мкг/см3 |
0,960 |
2,880 |
4,790 |
6,710 |
9,590 |
Концентрация валериановой кислоты, мкг/см3 |
0,470 |
1,390 |
2,330 |
3,260 |
4,650 |
Концентрация изо-капроновой кислоты, мкг/см3 |
0,460 |
1,390 |
2,310 |
3,230 |
4,620 |
Концентрация капроновой кислоты, мкг/см3 |
0,460 |
1,390 |
2,310 |
3,230 |
4,620 |
|
8.4.2. Приготовление рабочих растворов. Для построения градуировочного графика используют цельную кровь, не содержащую исследуемые компоненты. В пробирки со стандартными смесями, приготовленными по п. 8.4.1, добавляют по 2 см3 крови, подкисляют 0,5 см3 1 %-го раствора серной кислоты до pH 2—3 (pH среды контролируется по индикаторной бумаге), экстрагируют 2 см* изо-бутилового спирта в течение 5—10 мин. Для отделения денатурированных белков экстракты центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость переносят в бюкс. Прибавляют по 0,1 см3 0,4 %-го раствора щелочи (pH среды контролируется по индикаторной бумаге), растворы упаривают досуха при температуре 50—55 °С (экстракты упариваются под ИК-лампой). Добавляют 0,05 см3 I %-го раствора серной кислоты, 0,1 см3 изо-бутанола, перемешивают.
8.4.3. Хроматографирование растворов. В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях: температура термостата колонок 70—160—180—280 °С при скорости нагревания 10—5—25 °С/мин; расход газа-носителя (азот) - 30 см3/мин; деление потока 1:10.
Время удерживания:
-уксусной кислоты -21 мин (47 ± 23) с;
- пропионовой кислоты - 23 мин (47 ± 23) с;
- изо-масляной кислоты - 24 мин (9 ± 23) с;
- масляной кислоты - 25 мин (43 ± 23) с;
- валериановой кислоты - 29 мин (46 ± 23) с;
- изо-капроновой кислоты - 32 мин (22 ± 23) с;
- капроновой кислоты - 34 мин (29 ± 23) с.
Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:
Zcf/s,
К = —-, где
п
С/ - концентрация вещества в градуировочной смеси, мкг/см3;
Si - среднее значение пяти измерений площади пика /-ой концентрации, расхождение между минимальным и максимальным значением которое не должно превышать 4 % сигнала милливольт (Мв).
п - количество градуировочных смесей (п = 5).
8.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят
I раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация летучих жирных кислот
МУК 4.1.2773—10
соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:
I*-С] < 0,10-С, где
С - заданная концентрация кислоты в градуировочном растворе;
X - результат измерения массовой концентрации кислоты в градуировочном растворе.
При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики экспериме1гг повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.
8.5. Отбор проб
Отбор проб венозной крови объемом не менее 4 см3 производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой. Анализ крови проводят в течение суток. Возможно хранение пробы крови в морозильной камере не более пяти дней.
9. Выполнение измерений
Отбирают 2 см3 крови и помещают в химически чистую центрифужную пробирку вместимостью 10 см3, добавляют 0,5 см3 1 %-го раствора серной кислоты до достижения pH 2—3 и экстрагируют 2 см3 изобутанола в течение 10 мин. Экстракт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость переносят в бюкс, прибавляют 0,1 см3 0,4 %-го раствора щелочи. Раствор упаривают досуха, добавляют 0,05 см3 1 %-го раствора серной кислоты, 0,1 см3 изо-бутанола и проводят количественное определение кислот в подготовленной пробе газохроматографическим методом. Для каждого образца делают по три ввода подготовленной пробы.
Условия выполнения измерений по п. 8.4.3.
10. Обработка (вычисление) результатов измерений
10.1. Концентрацию анализируемых кислот в крови С, мкг/см3 рассчитывают по формуле:
С = ^,гле (1)
VI - объем рабочего раствора, см3;
V2 ~ объем вводимой пробы, мм3;
45
А - количество компонента в объеме вводимой пробы, найденное по калибровочному графику, мкг;
В - объем крови, см3;
К - коэффициент пересчета, учитывающий степень экстракции кислот из крови. Коэффициент устанавливается в результате расчета отношения площадей хроматографических пиков, полученных при анализе стандартного образца до и после экстракции:
^уксусная -2,100, КПропионо«ая 1,500 - Киз0_масляная ~М40,
кислота кислота кислота.
К — 1 990* К — 1 0QS’ К — 1
**масляная валериановом и JO-капроновая
кислота кислота кислота
**капроновая = Ы^О. кислота
За результат измерения принимают среднее арифметическое значение С двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости Снах* Ст,„ (параллельных определений), для которых выполняется условие:
|С, - С2| S 0,01-где (2)
г - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.
При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:
lc^.4 -CmiM| < 0,01 • С7?095(4)■ Ci + ^ — —— , где (3)
С/?о.95(4) - критический диапазон. Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.
10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости:
<0,01 R-
С, и С2 - результаты измерений массовых концентраций летучих жирных кислот, полученные в разных лабораториях - средние арифме-
МУК 4.1.2773—10
тические двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие (4).
В случае, если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание уксусной кислоты в пробе менее 3,0 мкг/см3, где 3,0 мкг/см3 - предел обнаружения».
При выполнении условия (4) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 4.
Таблица 4
Значения пределов повторяемости, воспроизводимости и критического диапазона при доверительной вероятности Р = 0,95 |
Диапазон
измерений,
мкг/см3 |
Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости), г, % |
Предел внутрилабора-торной прецизионности (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в условиях внут-рилабораторной прецизионности),
% |
Предел воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), /?, % |
от 0,5 до I в ключ. |
25 |
28 |
31 |
св. 1 » 16 » |
17 |
20 |
22 |
|
10. Оформление результатов измерений |
Результат измерения представляют в виде (С ± Д) мкг/см3, где Л- характеристика погрешности, мкг/см3, при /> = 0,95, значение Д рассчитывают по формуле:
Значение 6 приведено в табл. 2.
Примечание. При представлении результата измерений в документах, выдаваемых лабораторией, указывают:
- количество результатов параллельных определений, использованных для расчета результата измерений;
47
ББК 28.072 060
060 Определение вредных веществ в биологических средах: Сборник методических указаний по методам контроля.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011.—67 с.
ISBN 978—5—7508—0893—9
Методические указания разработаны Федеральным государственным учреждением науки «Федеральный научный центр медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора.
ББК 28.072
ISBN 978—5—7508—0893—9
<D Роспотребнадзор, 2011 О Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изо-масляная, масляная, валериановая, изо-капроновая, капроновая) в биосредах (кровь) газохроматографическим методом
Методические указания МУК 4.1.2773—10
МУК 4.1.2773—10
1. Разработаны Федеральным государственным учреждением науки «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (авторы Н. В. Зайцева, Т. С. Уланова, Т. В. Нурисламова, Г. И. Леготкина, Н. А. Попова, В. М. Митрофанова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 22 ноября 2010 г.
4. Введены впервые.
36
МУК 4.1.2773—10
УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
22 ноября 2010 г.
Дата введения: с момента утверждения.
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изо-масляная, масляная, валериановая, изо-капроновая, капроновая) в биосредах (кровь) газохроматографическим методом
Методические указания _МУК 4.1.2773—10_1. Общие положения и область применения
1.1. Методические указания по определению массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изо-масляная, масляная, валериановая, изо-капроновая, капроновая) в биосредах (кровь) предназначены для использования территориальными органами и подведомственными организациями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, осуществляющие деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.
1.2. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием летучих жирных кислот в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.
Методические указания метрологически аттестованы (свидетельство № 223Л .11.11.98/2009.)
1.3. Уксусная кислота (СН3СООН), мол. масса 60,05.
Уксусная кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом.
Тцип= 118,1 °С. Растворяется в воде и органических растворителях.
Плотность уксусной кислоты (15 °С) 1,0553 г/см3. Обладает сильным раздражающим действием. Вызывает гипертрофические и атрофические
37
МУК 4.1.2773—10
фарингиты, ларингиты, а также конъюктивиты и бронхиты [пункт 1 приложения настоящих МУК]'.
1.4. Пропионовая кислота (СН3СН2СООН), мол. масса 74,08.
Пропионовая кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом. Т»,,, = 141,3 °С. Смешивается в любых соотношениях с водой. Растворяется в органических растворителях. Плотность пропионовой кислоты (20 °С) 0,993 г/см3. Вызывает изменения функционального состояния центральной и вегетативной нервной систем, а также функций печени, изменения интенсивности тканевого дыхания [1].
1.5. Изо-масляная кислота (СН3СН2СН2СООН), мол. масса 88,00.
Изо-масляная кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом. Тки|1 * 163,5 °С. Растворяется в органических растворителях. Плотность изо-масляной кислоты (20 °С) 0,958 г/см3. Раздражает кожу и слизистые оболочки [1].
1.6. Масляная кислота (СН3СН2СН2СООН), мол. масса 80,10.
Масляная кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом.
Ткип - 163,5 °С. Растворяется в органических растворителях. Плотность масляной кислоты (20 °С) 0,958 г/см3. Раздражает кожу и слизистые оболочки [1].
1.7. Валериановая кислота (СНз(СН2)эСООН), мол. масса 102,14.
Валериановая кислота - бесцветная прозрачная жидкость с характерным запахом. T„,n = 185,4 °С. Плотность валериановой кислоты (25 °С) 0,9391 г/см3. Вызывает изменения функций печени [1].
1.8. Капроновая кислота (СНз(СН2)4СООН), мол. масса 116,16.
Капроновая кислота - бесцветная прозрачная жидкость с резким
неприятным запахом. Ткип = 205,3 °С. Плотность капроновой кислоты (25 °С) 0,929 г/см3. Вызывает патологические сдвиги в центральной и периферической нервных системах, печени и миокарде [1].
1.9. Диапазон измерений массовых концентраций летучих жирных кислот приведен в табл. 1.
Таблица 1
Наименование определяемых веществ и диапазоны измерений |
Наименование определяемого вещества |
Диапазон измерений, мкг/см3 |
1. Уксусная кислота |
от 1,56 до 16 в ключ. |
2. Пропионовая кислота |
» 1 » 10» |
3. Изо-масляная кислота |
» 1 » 10» |
4. Масляная кислота |
» 1 » 10 » |
5. Валериановая кислота |
» 0,5 » 5 » |
6. Капроновая кислота |
» 0,5 » 5 » |
|
Далее по тексту ссылка на номер пункта приложения указывается одним номером в квадратных скобках |
МУК 4.1.2773—10
2. Приписанные характеристики погрешности измерений
Методика обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2.
Таблица 2
Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, внутрилабораториой прецизионности, воспроизводимости
Диапазон
измерений,
мкг/см3 |
Показатель повторяемости (относительное значение среднеквадратического отклонения повторяемости), аг, % |
Показатель внут-рилабораторной прецизионности (относительное значение среднеквадратического отклонения внут-рилабораторной прецизионности), о % |
Показатель воспроизводимости (относительное значение среднеквадратического отклонения воспроизводимости), аЛ, % |
Показатель точности* (границы относительной погрешности при вероятности Р - 0,95), ± 5, % |
от 0,5 до 1 включ. |
9 |
10 |
11 |
22 |
св. 1 » 16» |
6 |
7 |
8 |
16 |
* Соответствует относительной расширенной неопределенности измерений при коэффициенте охвата 2. |
3. Сущность метода
Методика основана на экстракции летучих жирных кислот из крови изо-бутиловым спиртом в кислой среде и последующем газохроматографическим анализом экстракта.
Выполнение измерений массовой концентрации летучих жирных кислот выполняют методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора.
Длительность анализа, включая экстракцию пробы - 60 мин.
4. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы
При подготовке проб крови и измерении концентраций летучих жирных кислот в анализируемом растворе применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
4.1. Средства измерений
Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с пламенно-ионизационным детектором
Секундомер «Агат» ТУ 25-1894.003—90
Микрошприцы МШ-10 ТУ 2.833.106—2000
39
МУК 4.1.2773—10
Весы аналитические ВЛР-200 Разновесы Гг210
Колбы мерные вместимостью 100, 1 ООО см3 Пипетки вместимостью 5, 10 см3 Бюксы стеклянные
Пробирки конические вместимостью 10 см3
Дозаторы
Уксусная кислота
4.2. Вспомогательные устройства Хроматографическая капиллярная колонка HP-FFAP - 50 м х 0,32 мм х 0,5 мкм
Редуктор кислородный ТУ 26-05-236—73
Миницентрифуга СМ-4, 6 000 об./мин
4.3. Материалы Газообразный азот в баллоне ТУ 6-027376—65
Водород технический ГОСТ 3022-80
Воздух в баллоне ГОСТ 17433-80
Бумага индикаторная универсальная pH 1,0—
10,0 в упаковке 100 штук ПНД 50-975-84 (перечень нормативных документов) (Чешская Республика)
4.4. Реактивы
Пропионовая кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества
> 99,9 % (Sigma-AIdrich Buchs Switzerland) Изо-масляная кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества
> 99,9 % (Sigma-AIdrich USA)
Масляная кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества £ 99,9 % (Sigma-AIdrich USA)
Валериановая кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества
> 99,9 % (Sigma-AIdrich Buchs Switzerland) Изо-капроновая кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества
> 99,9 % (Sigma-AIdrich Buchs Switzerland))
МУК 4.1.2773—10
Капроновая кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества > 99,9 %
(Sigma-Aldrich Buchs Switzerland)
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Изо-бутиловый спирт, чда ГОСТ 6016-77
Серная кислота, осч ГОСТ 14262—78
Калий двухромовокислый, чда ГОСТ 4220-75
Натрий гидроксид, хч ГОСТ 4328-77
Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.
5. Требования безопасности
5.1. При выполнении работ соблюдаются меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-91 [2], имеются средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83 [3] и соблюдаются правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019— 79* 2001 [4].
5.2. При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях» (Утверждены М3 СССР 20.12.82), М., 1981 и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением» (Утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87), М.: Недра, 1989.
5.3. При работе с реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 [5] и 12.1.005—88 [6]. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.
5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322—08 [7].
5.5. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79* 2001 [4] и инструкции по эксплуатации прибора.
6. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.
41