Методика выполнения измерений содержания стрептомицина в продукции животного происхождения методом ИФА с использованием набора реагентов MaxSignal® производства BIOO Scientific Corporation (США) мви.мн

СОДЕРЖАНИЕ

1    Область применения.......................................................................................3

2    Точность измерений.......................................................................................3

3    Средства измерений, испытательное н вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы...............................................................................................3

4    Метод измерений.............................................................................................6

5    Требования безопасности и требования к квалификации операторов........6

5.1    Общие требования безопасности.......................................................................6

5.2    Требования к квалификации операторов...........................................................6

6    Условии выполнения измерений....................................................................6

7    Условия инкубации мнкротитровальных планшетов в помещении............6

8    Условия хранения набора реагентов..............................................................7

9    Подготовка к выполнению измерений...........................................................7

9.1    Отбор образцов.................................................................................................7

9.2    Подготовка лабораторной посуды.....................................................................7

9.3    Приготовление растворов.................................................................................7

9.4    Подготовка набора реагентов............................................................................8

9.5    Подготовка проб.............................................................................................10

10    Выполнение измерений.................................................................................12

10.1    Общие требования..........................................................................................12

10.2    Дозирование компонентов набора реагентов и последовательность операций

при выполнении анализа..........................................................................................13

11    Обработка результатов измерения...............................................................14

11.1    Расчет массовой концентрации.......................................................................14

11.2    Определение массовой концентрации стрептомицина при получении

результатов измерений больше значения, соответствующего верхней границе диапазона градуировки.............................................................................................15

11.3    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

повторяемости..........................................................................................................16

12    Оформление результатов измерений...........................................................16

12.1    Форма представления результатов измерения с использованием расширенной

неопределенности.....................................................................................................16

12.2    Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой

концентрации стрептомицина с использованием предела измерения ........................16

12.3    Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой

концентрации стрептомицина с использованием значения верхней границы диапазона измерений................................................................................................17

13    Контроль точности результатов измерений................................................17

13.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости. 17

13.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

промежуточной прецизионности..............................................................................17

13.3    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

воспроизводимости..................................................................................................18

13.4    Контроль правильности..................................................................................19

13.5    Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных

карт Шухарта (КК)...................................................................................................20

режиме: 4000 g, 5 мин. Шпателем или наконечником дозагора удаляют верхний жировой слой, образовавшийся на поверхности молока после центрифугирования. Для обезжиренного молока описанную выше процедуру по удалению жира нс производят.

Отбирают дозатором аликвоты обезжиренного молока объемом 100 мм и переносят в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см . В пробирки добавляют отмеренные дозатором 400 мм PBS-буфера с твином, приготовленного но п. 9.3.Э, и тщательно перемешивают содержимое на вортексе.

Полученные подготовленные пробы используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.5.3 Подготовка проб йогурта, кефира, сметаны, молочной сыворотки,

восстановленной сухой молочной сыворотки

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру представленного образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

Сухую молочную сыворотку восстанавливают следующим образом. В мерные колбы вместимостью 100 см⁵ помещают 2 параллельные навески образца массой 6,25 г, взвешенные с погрешностью не более 0,01 г. К навеске приливают небольшими порциями по 10-20 см³ дистиллированную воду, перемешивая содержимое вращением колбы до полного растворения, затем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

При наличии в образце йогурта частиц твердой консистенции их отбрасывают. Перед взятием навески испытуемый образец тщательно перемешивают.

От образца отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г, и помещают их в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. В пробирки с пробами добавляют отмеренные дозатором 125 мм³ реагента для очистки и перемешивают на вортексе в течение 30 с на максимальной скорости.

Пробирки центрифугируют в следующем режиме: 4000 g, 5 мин.

Дозатором отбирают аликвоты объемом 100 мм³ из нижнего (водного) слоя, избегая попадания в нее верхнего слоя жира и переносят их в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³. В пробирки дозатором добавляют 344 мм³ буфера для доведения проб № 1 и тщательно перемешивают на вортексе.

Полученные подготовленные пробы используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.5.4 Подготовка проб масла сливочного, сыра, творога

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Образец масла, охлажденный до температуры не выше минус 10 °С, измельчают с помощью терки и перемешивают. У образца сыра отделяют тесто от корки, полимерно-парафинового или воскового сплава, измельчают тесто с помощью терки и перемешивают. Доводя! температуру образца от плюс 20 °С до выдерживая его при комнатной Tg^grgrgai ц-^Образс» i твор гомогенизирую!, избе1^я отделения t

От гомогенизированного обрАзда /льирают две<| дельны

1,00 г, взвешенные с погрешностью 0,01г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные дозатором 4 см³ PBS-буфера с твином, приготовленного по п. 9.3.3. 11робирки с пробами выдерживают на водяной бане при температуре от 50 °С до 55 °С до расплавления пробы, но не менее двух минут.

Затем пробирки с пробами интенсивно встряхивают на шейкере или вручную в течение 5 мин, после чего центрифугируют в следующем режиме: 4000 g, 10 мин.

Дозатором отбирают аликвоты объемом 1 см³ из нижнего (водного) слоя, избегая попадания в нее верхнего слоя жира, и переносят их в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³.

Полученные подготовленные пробы используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.5.5 Получение разбавленных растворов проб

При получении результатов измерений проб больших, чем значение, соответствующее верхней границе диапазона градуировки (10,0 нг/см³), .согласно п. 11.2 проводят разбавление приготовленных по п. 9.5.1-9.5.4 растворов проб следующими растворителями:

пробы масла сливочного, сыра, творога, молока, сухого молока - PBS-буфер с твином;

пробы йогурта, кефира, сметаны, молочной сыворотки, восстановленной сухой молочной сыворотки - буфер для доведения проб № 1.

Разбавлению должны подвергаться свежеприготовленные растворы проб.

При проведении разбавления отобранные дозатором аликвоты растворов проб объемом V_a% мм³, переносят в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³. В пробирки добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления проб объемом V_6> мм³, и перемешивают на вортексе в течение 30 с.

Коэффициент разбавления К рассчитывается по формуле

Величины У_аУ V₆ должны соответствовать условию (6), и выбираются таким образом, чтобы концентрация стрептомицина в разбавленном растворе пробы находилась в диапазоне градуировки.

500 5 (К„+К,) 51000    (6)

Полученные подготовленные пробы используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

10 Выполнение измерений

10.1 Общие требования

Для проведения измерений исполь: п. 9.5. Компоненты набора реагентов по.

10.2 Дозирование компонентов набора реагентов н последовательность операций при выполнении анализа

10.2.1    Внесение градуировочных растворов н растворов проб

В лунки микротитровального планшета, размеченного согласно п. 9.4.2, вносят отобранные дозатором две аликвоты объемом 50 мм³ каждого |радуировочного раствора. Каждую аликвоту вносят в отдельную лунку, внесение производится в порядке возрастания концентраций градуировочных растворов (т.е. 0,0,0,5, 1,0,2,5, 5,0,

10,0 нг/см³). Затем в соответствующие лунки микротитровального планшета вносят отобранные дозатором аликвоты объемом 50 мм³ двух параллельных проб каждого образца.

10.2.2    Добавление раствора антител № 1

В каждую лунку микротитровального планшета вносят отобранные дозатором 100 мм³ раствора антител №1. Перемешивают содержимое лунок медленными круговыми движениями планшета по поверхности стола в течение 1 мин.

10.2.3    Инкубации планшета

Помещают планшет в инкубатор при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 30 мин. При отсутствии инкубатора микротитровальный планшет инкубируют в течение 30 мин в помещении при условиях, указанных в разделе 7.

10.2.4    Промывка планшета

По окончании инкубации аккуратно удаляют пленку, закрывающую лунки (если инкубация проводилась в помещении). Выливают содержимое лунок планшета путем сю резкого переворачивания. Промывают планшет три раза, добавляя при этом каждый раз многоканальным дозатором в лунки планшета но 250 мм³ промывочного раствора, приготовленного по п. 9.4.3, и затем выливая его резким переворачиванием планшета.

Рекомендуется проводить процедуру промывки планшета с помощью устройства для отмывки планшетов, задавая следующие параметры профаммы: количество циклов промывки - от 3 до 4, объем заливаемою моющего раствора -250 мм³.

После последнего промывания планшег переворачивают и удаляют остатки жидкости легким постукиванием по поверхности стола, накрытого сухим листом фильтровальной бумаги.

10.2.5    Добавление конъюгата антител с пероксидазой № 2

Немедленно после удаления остатков промывочною раствора в лунки планшета добавляют по 150 мм³ конъюгата антител с пероксидазой № 2, приготовленного по п. 9.4.4, и аккуратными круговыми движениями планшета перемешивают содержимое лунок.

10.2.6    Инкубация планшета

Сразу же после добавлен помещают в инкубатор при темг течение 30 мин. При отсутствии

в течение 30 мин в защищенном от света месте при условиях, указанных в разделе 7.

10.2.7    Промывка планшета

11ромывают планшет в соответствии с п. 10.2.4.

10.2.8    Добавление ТМВ-субстрата

Немедленно после удаления остатков промывочного раствора в лунки нланшега добавляют отмеренные дозатором 100 мм³ ТМБ-субстрата, после чего сразу же начинают отсчет времени инкубации. Перемешивают содержимое лунок медленными круговыми движениями планшета по поверхности стола в течение 1 мин.

Не допускается выливать обратно в оригинальный флакон остатки субстрата во избежание его контаминации.

10.2.9    Инкубация планшета

I Гпаншет помещают в инкубатор при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 15 мин. При отсутствии инкубатора микротитровальный планшет инкубируют в течение 15 мин в защищенном от света месте при условиях, указанных н разделе 7.

10.2.10    Завершение реакции окрашивания

Сразу же после окончания времени инкубации в лунки планшета добавляют по 100 мм³ стоп-реагента, отмеренных дозатором, и аккуратными круговыми движениями планшега перемешивают содержимое лунок.

10.2.11    Измерение оптической плотности

Немедленно после перемешивания вытирают микрофибровой салфеткой нижнюю наружную поверхность лунок планшета и измеряют оптическую ллогность лунок планшета с помощью автоматического микропланшетного фотометра при длине волны 450 нм. Измерения проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

11 Обработка результатов измерения

11.1 Расчет массовой концентрации

Программное обеспечение «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», разработанное BIOO Scientific Corporation (C1I1A), далее «программное обеспечение» производит обработку результатов измерений оптической плотности, введенных оператором с помощью интерфейса программного обеспечения.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности В/В₀ от натурального логарифма концентрации стрептомицина вида

В₀ - оптическая ги

стрептомицина 0,00 hiYcm ;

С - концентрация стрснтоми] Расчет коэффициентов линей!

на основании пар значений B_t/B_Q , In С, полученных для пяти градуировочных растворов, где ( / = 2..6), C_t - концентрация /-го градуировочного раствора, Я -среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го фадуировочного раствора.

Массовая концентрация стрептомицина в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле

(8)

где X — концентрация стрептомицина в пробе, мкг/кг,

В_я - оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F - фактор разбавления пробы, F= 5.

При получении результатов измерений проб выше значения, соответствующего верхней границе диапазона градуировки (10нг/см³), выполняются действия согласно п. 11.2.

За окончательный результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов двух измерений параллельных проб при выполнении условия повторяемости по и. 11.3

(9)

где Х_1%Х₂ -результаты двух измерений массовой концентрации стрептомицина н параллельных пробах, мкг/кг.

Окончательный результат измерений округляют до первого десятичного знака.

Если окончательный результат измерений X оказывается меньше, чем предел измерений, то дается односторонняя оценка массовой концентрации стрептомицина в образце с использованием предела измерения согласно п. 12.2.

Если окончательный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений, то дается односторонняя оценка массовой концс|гтрации стрептомицина в образце с использованием значения верхней 1раницы предела измерений согласно п. 12.3.

11.2 Определение массовой концентрации стрептомицина при получении результатов измерений больше значения, соответствующего верхней границе диапазона градуировки

При получении результатов измерений проб больше значения, соответствующего верхней границе диапазона градуировки, проводят разбавление растворов проб согласно п. 9.5.5.

В этом случае при обработке результатов измерений массовой концентрации стрептомицина в вышеупомянутых пробах при расчете по формуле (8) для разбавленных растворов проб в качестве фактора разбавления задается значение, рассчитанное по формуле

где К коэффициент разбавле

11.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, проводят в соответствии с требованиями СТЬ ИСО 5725-6 следующим образом.

Рассчитывают расхождение между результатами измерений параллельных проб одного образца \Х_х-Х₂\, значение которого сравнивают с абсолютным значением предела повторяемости г_акг. Если выполняется условие

\Х,-Х_г\£г*.,    (И)

то оба результата считают приемлемыми и в качестве результата измерений указывают среднее арифмегическое значение X, рассчитанное по формуле (9).

Абсолютное значение предела повторяемости г_ш , мкг/кг, рассчитывают по формуле

r_ail=O_tO\rX,    (12)

где X - среднее арифметическое значение результатов измерений параллельных проб одного образца, мкг/кг,

г - относительное значение предела повторяемости, приведенное в таблице 3, %.

При невыполнении условия (11) проводят повторные измерения согласно разделу 10.

12 Оформление результатов измерений

12.1 Форма представления результатов измерения с использованием расширенной неопределенности

Результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в

виде

(X±U(AО), мкг/кг при доверительной вероятности Р =» 0,95, К=2

где X -результат измерений, мкг/кг, полученный в соответствии с настоящей методикой и рассчитанный согласно разделу 11;

U(X) - расширенная неопределенность результатов измерений, мкг/кг. Расширенную неопределенность результата измерений ЩХ) , мкг/кг, рассчитывают по формуле

£/(*) = 0,01-С/ X,    (13)

где U - относительная расширенная неопределенность результата измерений, выполняемых в соответствии с МВИ, %, приведенная в таблице 1.

При необходимости может быть проведена оценка расширенной неопределенности измерений, выполняемых в соответствии с данной МВИ при ее реализации в конкретной лаборатории.

Зк«м^^о^торонней оценки ^тьзова fra taft^pe д ел а пиейшш—

\^^к»Ьгвас1ея мены^/ч—*------⁴'

измерения X, равный 5,0 мкг/кг, то дается односторонняя оценка массовой концентрации стрептомицина в образце с использованием предела измерения, в мкг/кг

менее Хщ

где Х_ш - значение предела измерений, приведенное выше.

12.3 Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой концентрации стрептомицина с использованием значения верхней границы диапазона измерений

Если конечный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений Х_т , равное: 250,0 мкг/кг, то дается односторонняя оценка массовой концентрации стрептомицина в образце с использованием значения верхней границы диапазона измерений, в мкг/кг

более X_HL,

где Х_нс - значение верхней границы диапазона измерений, приведенное выше.

13 Контроль точности результатов измерений

Контроль качества проведения измерений выполняется с периодичностью, установленной системой менеджмента качества в лаборатории, но обязательно:

•    при внедрении методики;

• при появлении факторов, влияющих на стабильность процесса по результатам анализа контрольных карт;

•    при значимых изменениях в условиях измерений (другая партия реагентов, новые средства измерений, ремонт оборудования и т.д.);

• при любых выявленных несоответствиях в работе лаборатории, применительно к методике выполнения измерений.

13.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости

Оперативный контроль повторяемости выполняется для каждой пробы после измерения концентрации стрептомицина при расчете конечного результата измерений по результатам двух параллельных определений в соответствии с п. 11.3.

13.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности с изменяющимися факторами оператор-время, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6 следующим образом.

Лаборатория получает два результата измерений Х_х%Х_г согласно разделу 10, варьируя факторы промежуточной прецизионности (оператор, время) и обеспечивая контроль повторяемости по п. 11.3. За результат измерений принимают среднее арифметическое значение двух результатов X_ltX₂

при их соответствии условию (1

|Х_х-~Ц й CD*,,    (15)

где CD^ - абсолютное значение критической разности, мг/кг, рассчитываемое по формуле

GCU-O^Ol-CD-JT,    (16)

где CD - относительное значение критической разности, приведенное в таблице 3, %.

13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят в соагветствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6 следующим образом.

Каждая из двух лабораторий проводи! измерения согласно разделу 10 и получает результат измерений, обеспечивая контроль повторяемости по п. 11.3.

Рассчитывают    среднее    арифметическое значение    X    , мкг/кг, результатов

измерений двух лабораторий X, и Х₇ соответственно

J ₌    (17)

Рассчитывают    абсолютное расхождение между    результатами измерений

- Х₂\ , полученными в двух лабораториях, значение, которого сравнивают с абсолютным значением критической разности CD_R. Если выполняется условие

\X_x-X₂\zCD_%t    (18)

то оба конечных результата, полученные двумя лабораториями считаются

приемлемыми и общее среднее значение X, рассчитанное но формуле (17), может быть использовано в качестве заявляемого результата.

Абсолютное значение критической разности CD_K , мкг/кг, рассчитывают по формуле

CD_r =0,01 k-CDX,    (19)

где X - среднее арифметическое значение результатов измерений двух лабораторий, мкг/кг;

к - коэффициент, равный 1,2;

CD - относительное значение критической разности, %, приведенное в таблице 3.

При превышении значения критической разности для разрешения различий между результатами, полученными двумя лабораториями, используют процедуры, указанные н разделе 5 СТБ ИСО 5725-6.

разности и норматива контроля правильности

Диапазон измерений, мкг/кг Предел повторяемости г,% Критическая разность CD, % Норматив контроля правильности , % от 5,0 до 250,0 в ключ. 10 24 19

13.4 Контроль правильности

Контроль правильности определения массовой концентрации стрептомицина производится путем анализа образцов для контроля (ОК) с заранее известным значением концентрации вещества (рабочая проба с добавкой).

Контроль правильности проводится с использованием добавок стрептомицина. Неопределенность аттестованного значения массовой концентрации стрептомицина в ОК не должна превышать одной трети от значения неопределенности результата измерений.

13.4.1 ОК, представляющие собой рабочие пробы с добавкой

Данные образцы для контроля представляют собой навеску пробы, массовая концентрация стрептомицина в которой менее предела измерения данной МВИ, в которую внесена добавка раствора стрептомицина. Добавка вносится непосредственно в пробирки с навесками (аликвотами) проб. Значение массовой концентрации стрептомицина Х^ в пробе с добавкой рассчитывается по формуле

С •V

₉ (20)

т

где От - концетпрация раствора стрептомицина, нг/см³;

Vst - объем раствора стрептомицина, см³;

т - масса навески пробы, г.

Примечание: принимается, что для сырого, пастеризованного, стерилизованного молока масса т численно равна объему аликвоты, см³.

Величина массовой котщентрации стрептомицина в пробе с добавкой должна находиться в диапазоне измеретгий.

Для внесения добавки используется раствор стрептомицина, приготовленный из стрептомицина сульфата в соответствии с прилагаемой инструкцией. Допускается использовать для внесения добавок готовые spike-растворы, при условии, что относительная стандартная неопределенность добавленной массовой концентрации нс превышает 3 %.

13.4.2 Проведение контрольной процедуры

11олучают результаты измерений ОК в соответствии с требованиями раздела 10. За результат контрольного измерения принимают результат измерения массовой

концентрации стрептомицина Х_к в ОК, мкг/кг, рассчитанный по формуле (17) при

где - относительный норматив контроля правильности, %, приведенный в таблице 3.

- установленное значение массовой концагграции стрептомицина в ОК,

м кг/кг.

При невыполнении данного условия контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (21) выясняют причины, приводящие к неудовлсгворигельным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.5 Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных карт Шухарта (КК)

С помощью КК контролируют следующие показатели точности:

•    повторяемость (R-карта или карта размахов);

•    наличие смещения или правильность (Recovery-карта).

Подготовка и оформление исходных данных, расчеты параметров КК. ведение, управление и интерпретация КК должны осуществляться в соответствии с требованиями | 3 ] и СТБ ИСО 5725-6-2002, раздел 6.

Для проверки стабильности соответствия результатов испытаний показателям повторяемости, установленным данной методикой, применяются КК с заданными стандарты ми значениями. В этом случае для построения КК используют показатели повторяемости в соответствии с таблицей 1.

Примечание: При применении КК в течение длительного времени, для расчета |раниц КК могут быть использованы данные измерений, накопленные в процессе ведения и обработки КК. Однако соответствие результатов измерений требованиям данной методики может быть заявлено только в том случае, если показатель повторяемости, рассчитанный по накопленным лабораторией данным, статистически не превышает установленных методикой значений.

Для построения и ведения R-карт в качестве образцов для котроля (ОК) могут использоваться рабочие образцы.

Для построения и ведения Recovery-карт используются ОК, представляющие собой рабочие пробы с добавками раствора стрептомицина, приготовленного из бею ил стрептомицина калиевой или натриевой соли в соответствии с прилагаемой инструкцией. Предварительно установленная массовая концентрация стрептомицина в данных пробах без добавки должна быть менее предела измерения данной МВИ. Рекомендуется вносить добавку стрептомицина в образцы для контроля на уровне массовых концентраций в рабочих пробах.

13.5.1 Расчет параметров, ведение и оформление данных, интерпретация КК размахов для контроля стабильности СКО повторяемости

Рассчитываются значения центральной линии, фаниц регулирования и предупреждающих границ по формулам • Центральная линия

d₇ cx_r *1,128 а,,    (22)

где

1 Область применения

Настоящая методика распространяется на молоко (сырое, пастеризованное, стерилизованное), молоко сухое¹, масло сливочное, сыр, творог, молочную сыворотку, восстановленную сухую молочную сыворотку, йогурт, кефир, сметану и устанавливает метол конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) для определения содержания стрептомицина.

Методика предназначена для проведения измерений массовой концентрации стрептомицина с использованием набора реадентов «MaxSignal ® для определения стрептомицина», каталожный номер 1014-01В («MaxSignal® Streptomycin ELISA Test Kil», Reference # 1014-01 В) производства BlOO Scientific Corporation (США), далее набор pcaicHTOB.

Диапазон измерений методики составляет от 5,0 до 250,0 мкг/кг. Предел измерения данной методики составляет 5,0 мкг/кг.

Настоящая методика разработана в соответствии с требованиями ГОСТ 8.010.

2 Точность измерений

Настоящая методика обеспечивает измерение массовой концентрации стрептомицина в указанном выше диапазоне с показателями точности, указанными в таблице 1.

В таблице 1 также приведены значения оценок относительной суммарной стандартной неопределенности и относительной расширенной неопределенности, рассчитанные с учетом обнаруживаемого смещения.

Таблица 1 - Относительные значения показателей повторяемости и промежуточной прецизионности

Диапазон измерений, мкг/кг Относительное стандартное отклонение повторяемости <г,, % Относительное стандартное отклонение промежуточной прецизионности °71ID)» ^ Относительная суммарная стандартная неопределенность ие, % Относительная расширенная неопределенность и, %, К=2,Р = 95 % от 5,0 до 250,0 в ключ. 3,4 8,5 11 22

Значения оценок неопределенности. Указанные в таблице 1 метрологические характеристики получены на

основании данных эксперимента в соответствии с:

•    показатели прецизионности - СТБ ИСО 5725-2;

•    показатели правильности — [ 1 ];

•    оценки неопределенности - [ 1 ], [ 2 ].

3 Средства измерений, испытательное оборудование, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего точности с наибольшим пределом вз.

Графическое построение KK состоит в проведении на выбранной шкале центральной линии и контрольных границ.

Ведение КК предусматривает набор данных Х_х, Х₇ при выполнении испытаний ОК в условиях повторяемости в полном соответствии с методикой, расчсга фактических относительных значений размаха W по формуле (25), оформлении Листа данных КК и нанесения данных на КК.

_]V 200-|ЛГ, - Х₂\ Х_}+Х₂    *

где Х_х, Х₇ - значение результатов измерений в условиях повторяемости.

Интерпретация данных КК осуществляется в соответствии с [ 3 ], п. 7.

Оценку СКО повторяемости S_r за контролируемый период получают по формулам (25), (26)

где N - общее число измерений (точек) на КК, для получения значений центральной линии и границ необходимо, чтобы N = 15..20; d₂ - коэффициент, d₂*-1,128.

13.5.2 Расчет параметров, ведение и оформление данных, интерпретация Recovery-карт для контроля стабильности правильности

Рассчитываются значения центральной линии, границ регулирования и предупреждающих границ но формулам • Центральная линия

_ t***

Rec = -^-,    (27)

N    ^V '

где N - количество измерений для расчета значений центральной линии и границ КК;

Re с, - значение извлечения (Recovery), %, рассчитываемое по результатам /-го

измерения пробы с добавкой стрептомицина, по формуле

R^cc/ *~“*100,    (28)

где X, массовая концентрация стрептомицина в пробе с добавкой, полученное для /“го измерения, мкг/кг;

Х^ ~ рассчитанное значение массовой ком централи и стрептомицина в пробе с добавкой, мкг/кг.

•    Предупреждающие границы

UCL - Rec

•    Границы регулирования

Автоматический микропланшетный фотометр с фильтром на 450 нм (допускаемая noipeumocn» измерения оптической плотности не более ± 5 %), например iMark Microplate Absorbance Reader, производства Bio-Rad Laboratories, Inc.,

Программное обеспечение «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», разработанное BIOO Scientific Corporation (США).

Термометр лабораторный частичного погружения класса точности 1 с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая относительное центробежное ускорение не менее 4000 g (пробирки вместимостью 15 см³), например 1236, производства I^aboGene Aps, Дания.

Холодильник бытовой, позволяющий поддерживать температуру ог плюс 2 °С до плюс 8 °С в холодильной камере и не выше минус 18 °С в морозильной камере.

Лабораторный вортекс, обеспечивающий скоросгь вращения не менее 1800 об/мин, например MSV-3500, производства BioSan Ltd, Латвия.

Лабораторный шейкер, обеспечивающий скорость до 300 об/мин.

Гомогенизатор лабораторный типа TissueRuptor производства QIAGEN Group (Германия) или бытовой блендер.

Баня водяная, обеспечивающая поддержание температуры от 50 °С до 55 °С.

Дозаторы пипеточные с комплектом одноразовых наконечников, например Acura manual 825, Acura manual 835, Acura manual 855 производства Socorex ISBA S.A., Швейцария:

-    с диапазоном объемов дозирования от 10 до 100 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 2,5 %;

-    с диапазоном объемов дозирования от 100 до 1000 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,5 %;

-    с диапазоном объемов дозирования от 1 до 10 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального * 2,0 %;

-    многоканальный с диапазоном объемов дозирования от 40 до 350 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального * 1,5 %.

Использование следующего оборудования не является обязательным, но рекомендуется для увеличения производительности и повышения точности измерений:

•    Инкубатор для микротитровальных планшетов, обеспечивающий поддержание температуры от плюс 20 °С до плюс 25 °С с точностью ± 1 °С, например PST-60HL производства BioSan Ltd, Латвия.

•    Устройство отмывки иммунологических планшетов автоматическое с диапазоном объемов моющего раствора, заливаемого в каждую микрокювету от 100 мм³ до 350 мм³, например ELx 50/8, производства Bio Гек Instruments, Inc., США.

Пленка «парафильм» или скотч.

Микрофибровые салфетки для очистки оптических поверхностей.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Шпатели пластиковые.

Штатив для пробирок.

полипропилена вместимостью 2 см³ ил Пробирки стеклянные вместим

П-2-10-14/23 ХС по ГОСТ 1770.

Колбы конические вместимостью 100 см, 250 см типа Кн-2-100-14/23 ХС, Ki1-2-250-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Колбы мерные вместимостью 50 см³ 2-50-2 по ГОСТ 1770.

Воронки типа В-56-80 ХС, В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканы 11-1 - 100 или Н-1 -150 но ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные вместимостью 25 см³, 100 см³ типа 3-25-2, 3-100-2 по ГОСТ 1770.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Твин-20, производства S1GMA, каталожный номер Р9416.

Лабораторный детергент, например Triton Х-100.

Набор реагентов «MaxSignal ® для определения стрептомицина», каталожный номер 1014-01В («MaxSignal® Streptomycin ELISA Test Kit», Reference # 1014-0IB) производства BIOO Scientific Corporation (США) - набор реактивов и микротитровальный планшет, необходимые для выполнения измерений по определению концентрации стрептомицина методом иммуноферментного анализа в составе (таблица 2).

Таблица 2 - Состав набора реагентов

Компонент набора Количество в комплекте Микротитровальный планшет (12 стрнпов по 8 лунок, покрытых стрептомицином) 1 шт Градуировочные растворы стрептомицина с концентрацией 0 нг/см3, 0,5 нг/см3, 1,0 нг/см3,2,50 нг/см3, 5,0 нг/см3, 10,0 нг/см3 6 х0,8 см3 [ Антитела к стрептомицину №1 12 см3 1 HRP-коньюгат антител № 2 (100х концентрат) 0,25 см3 Растворитель для антител № 2 20 см* Оке тракционный буфер для образцов (200х концентрат) 25 см3 Промывочный раствор (20х концентрат) 28 см3” Стоп-реагеиг 14 см3 ТМБ субстрат 12см3" Буфер для доведения проб 0,5 см3 PBS буфер(10х концентрат) 25 см5 Реагент для очистки 12 см3 Буфер для доведения проб К? 1 (IX Balance Buffer) 28 см3

Следующие компоненты набора реагентов являются взаимозаменяемыми в пределах их срока хранения при условии совпадения их номера в наборах реагентов производства BIOO Scientific Corporation:

•    растворитель для антител № 2;

•    концентрат экстракционного буфера для образцов;

•    промывочный раствор;

•    стоп-реагент;

•    ТМБ субстрат;

•    Буфер для доведения проб;

•    Концентрат PBS буфера.

4 Метод измерений

Используемый метод основан на конкурентном колориметрическом иммуноферментном анализе. В ходе анализа в лунки планшета, покрытого стрептомицином, вместе с пробой или градуировочным раствором добавляют первичные антитела, специфичные к стрептомицину. Присутствующий в пробе стрептомицин конкурируют со стрептомицином, нанесенным на стенки лунок, за связывание с первичными антителами. После внесения вторичных антител, конъюгированных с ферментом пероксидазой, последние связываются с первичными антителами, связанными со стрептомицином на стенках лунки. После добавления субстрата, а затем стоп-рсагонта, измеряется оптическая плотность раствора при 450 нм. Измеренная оптическая плотность находится в образной зависимости от концентрации стрептомицина в градуировочном растворе и стрептомицина в растворе пробы. Массовая концентрация стрептомицина в образце определяется по 1радуировочной зависимости, построенной с использованием 6 градуировочных растворов.

5 Требования безопасности и требования к квалификации операторов

S.1 Общие требования безопасности

При выполнении работ в соответствии с данной методикой персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

•    электробезопасности по ГОСТ 12.2.003;

•    пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004;

•    техники безопасности при работе в химической лаборатории в соответствии с инструкциями, утвержденными в установленном порядке;

•    техники безопасности, изложенные в инструкции по эксплуатации средств измерений и оборудования, применяемых при проведении измерений.

5.2 Требования к квалификации операторов

К проведению работ по данной методике допускаются лица, имеющие высшее специальное или среднее специальное образование но профилю выполняемых работ, прошедшие обучение приемам работы на оборудовании, освоившие выполнение всех операций, предусмотренных методикой, владеющие техникой постановки иммунофермс1ггного анализа.

6 Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

•    температура окружающего воздуха от плюс 20 °С до плюс 25 °С;

•    температура при приготовлении растворов (20 ± 2) °С;

•    относительная влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С.

Условия инкубации микротитро£

ЕИЬПЮ/ИП/ШИИ следующих услов н|ь/ 1С XII нчп м>й V*

л* (    .    _\    X    К_    ПИфО^ЧЛПИИ    I,

I BoW$a д6|<^»бЦть?.от ПЛЮС ИНСидочмюо* /i

25 °C;

•    нс должно происходить попадание прямых солнечных лучей на планшет;

•    планшет не должен подвергаться воздействию сильных естественных или искусственных потоков воздуха, вызванных, например, принудительной вентиляцией;

•    с целью устранения воздействия холодной поверхности стола, на котором находится планшет, рекомендуется помещать под него теплоизоляционный материал, например, сложенное в несколько слоев бумажное полотенце;

•    при низкой относительной влажности воздуха и наличии воздушных потоков с целью устранения возможности испарения содержимого лунок рекомендуется покрывать планшет пленой «парафильм» или заклеивать скотчем;

•    в особых случаях, которые оговорены по тексту МВ И, требуется помещать планшет в защищенное от света место, например в ящик стола.

8 Условия хранения набора реагентов

Хранение набора реагентов осуществляется в холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в оригинальных флаконах и упаковке. Микротитровальные планшеты должны храниться в плотно закрытой упаковке. Дополнительные рекомендации по хранению набора реагентов приведены в инструкции производителя.

9 Подготовка к выполнению измерений

9.1    Отбор образцов

Отбор образцов для анализа проводят по СТБ 1036. Отобранные образцы могут храниться в защищенном от света месте при температуре от плюс 2 °С до плюс 4 °С в течение 2-х дней или в замороженном виде при температуре не выше минус 18 °С в течение 14 дней. Перед проведением подготовки проб по п. 9.5 замороженные образцы должны быть разморожены при температуре от плюс 2 °С до плюс 4 °С.

9.2    Подготовка лабораторной посуды

Силыюзагрязненную лабораторную посуду предварительно обрабатывают хромовой смесью. Лабораторную посуду после мойки в растворе специализированного моющего средства промывают водопроводной, ополаскивают дистиллированной водой 2 раза и высушивают.

Запрещается:

•    многекратное использование одноразовой лабораторной посуды;

•    использование бытовых моющих средств для мойки лабораторной посуды.

9.3    Приготовление растворов

9.3.1 Приготовление PBS-буфера

В коническую колбу вместимостью 100 см³ или 250 см³ (в зависимости от объема приготавливаемого раствора) приливают дозатором или цилиндром аликвоту Юх концентрата PBS-буфсра, добавляют цилиндром в 9 раз больший по отпои объему добавленной аликвоты концентрата объем дистиллиров перемешивают раствор.

Объем используемой аликвотьь^    3S    бу<]

на основании количества анализир;

ю

где N, - количество анализируемых образцов молочной сыворотки, восстановленной сухой молочной сыворотки, йогурта, кефира, сметаны;

V_x - объем PBS-буфера, приготавливаемого в запас, см³ (нс менее 1 см³).

PBS-буфер приютавливается непосредственно перед использованием и хранению не подлежит.

9.3.2    Приготовление 10 % раствора твин-20

В мерную колбу вместимостью 50 см³ дозатором помещают навеску твин-20 массой 5,00 г, взвешенную с точностью до 0,01 г, навеску растворяют в 20 - 25 см³ дистиллированной воды, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

10 % раствор твин-20 хранят защищенным от действия света в плотно закрытой стеклянной посуде не более 3 месяцев.

Допускается использовать готовый 10% раствор твин-20, который хранят в соответствии с инструкцией производителя.

9.3.3    Приготовление PBS-буфера с твином

В коническую колбу вместимостью 100 см³ или 250 см³ (в зависимости от объема приготавливаемого раствора) приливают дозатором или цилиндром аликвоту 10х концентрата PBS-буфсра, добавляют цилиндром в 8,9 раз больший по отношению к объему добавленной аликвоты концентрата объем дистиллированной воды и перемешивают. Затем в колбу добавляют дозатором 10% раствор твин-20, приготовленный по п. 9.3.2, объемом в десять раз меньшим по отношению к объему добавленной аликвоты концентрата, и перемешивают раствор.

Объем используемой аликвоты V, см³, концентрата PBS-буфера рассчитывается на основании количества анализируемых образцов по формуле

0,Щ+ 8^₃ + У_{ 10

где N₂ - количество анализируемых образцов молока;

Wj - количество анализируемых образцов масла, сыра, творога;

К, - объем PBS-буфера с твином, приготавливаемого в запас, см³ (не менее

PBS-буфер с твином приготавливается непосрсдсгвенно перед использованием и хранению не подлежит.

9.4 Подготовка набора реагентов

9.4.1 Предварительная подготовка и правила обращения с наборами реагентов

Набор реагентов извлекают микротитровального планшета, выдер> 25 °С от 1 до 2 ч, доводят температур

25 °С.

При работе необходимо исключить прямое попадание солнечных лучей на компоненты набора реагентов.

Растворы из набора реагентов следует готовить непосредственно перед проведением ИФА. Перед использованием жидкие реагенты необходимо перемешать путем осторожного вращения или переворачивания флаконов. Не допускается переливать остатки реагентов обратно в оригинальные флаконы.

9.4.2 Подготовка мнкротитровального планшета

Количество лунок микротитровального планшета, необходимых для проведения измерений N_w, рассчитывается по формуле

N_w = \2+2N_SMrt

где Msht ~ количество образцов;

12 - количество лунок для градуировочных растворов.

Микротитровапьный планшет со стрипами, предварительно подготовленные в соответствии с п. 9.4.1, вынимают из упаковки. В микротитровапьный планшет помещают необходимое количество стрипэв, рассчитанное исходя из требуемого для проведения измерений количества лунок N_w. Оставшиеся стрины сразу же помещают в упаковку, закрывают и хранят в соответствии с разделом 8.

Распределение лунок для градуировочных растворов и проб проводят согласно схеме, предлагаемой программным обеспечением «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», с учетом выполнения по два параллельных измерения 1радуировочных растворов и образцов.

Не рекомендуется одновременно использовать более шеста стрипов. Если необходимо провести измерение более 18 образцов, ИФА выполняется несколько раз.

9.4.3    Приготовление промывочного раствора

Отмеренную дозатором аликвоту концентрата промывочного раствора объемом от 1 до 9 см³ приливают в коническую колбу вместимостью 250 см³ и добавляют отмеренную цилиндром вместимостью 25 см³ или 100 см³ (в зависимости от добавляемого объема) дистиллированную воду. Объем добавляемой дистиллированной воды должен быть в 19 раз больше, чем объем концентрата промывочного раствора. После перемешивания содержимое колбы переливают в емкость с закручивающейся пробкой. Если приготовленный объем раствора нс превышает 50 см³, то для его приготовления и хранения могут использоваться пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³. Полученный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 6-ти недель в стеклянной или полиэтиленовой посуде.

9.4.4    Приготовление конъюгата антител с перокендазой № 2

В стеклянную пробирку вместимостью 5 см³ или 10 см³ (в зависимости от объема приготавливаемого раствора) отбирают дозатором аликвоту концентрата конъюгата

Объем используемой аликвоты V , см , концентрата конъюгата антител с пероксидазой №2 рассчитывается на основании количества используемых лунок микротитроьального планшета по формуле

к.    (4)

100

где - количество лунок микротитровального планшета, используемых при проведении измерений, рассчитывается по п. 9.4.2;

V_x - объем конъюгата антител с пероксидазой Хз 2, приготавливаемого в запас,

мм³ (не менее 200 мм³).

Конъюгат антител с пероксидазой Х° 2 приготавливается непосредственно перед проведением ИФЛ и хранению не подлежит.

9.5 Подготовка проб

9.5.1 Подготовка проб сырого, стерилизованного и пастеризованного молока

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая сю при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

Образец молока переносят в коническую колбу вместимостью 100 см³ в таком количестве, чтобы колба заполнилась примерно до половины своей вместимости, и тщательно перемешивают на вортсксе.

От образца молока с помощью дозатора отбирают две параллельные пробы объемом 5 см³ и помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. Центрифугируют пробы в следующем режиме: 4000 g, 5 мин. Шпателем или наконечником дозатора удаляют верхний жировой слой, образовавшийся на поверхности молока после центрифугирования. Для обезжиренною молока описанную выше процедуру по удалению жира не производят.

Отбирают дозатором аликвоты обезжиренного молока объемом 100 мм³ и переносят в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³. В пробирки добавляют отмеренные дозатором 400 мм¹ PBS буфера с твилом, приготовленною но п. 9.3.3, и тщательно перемешивают содержимое на вортсксе.

Полученные подготовленные пробы используются для проведения ИФЛ. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.5.2 Подготовка проб сухого молока

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. От образца сухого молока отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с погрешностью 0,01г. Навески помещают в стеклянные пробирки вместимостью 10 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные с помощью дозатора 9 см³ дистиллированной воды. Содержимое

чего выдерживают в течение

1

Результат измерений массовой концентрации согласно данной методике продукту