СОДЕРЖАНИЕ

1    Область применения.......................................................................................3

2    Точность измерений........................................................................................3

3    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы...............................................................................................3

4    Метод измерений.............................................................................................5

5    Требования безопасности и требования    к квалификации операторов........6

5.1    Общие требования безопасности.......................................................................6

5.2    Требования к квалификации операторов...........................................................6

6    Условия выполнения измерений....................................................................6

7    Условия инкубации микротитровальыых планшетов в помещении............6

8    Условия хранения набора реагентов..............................................................7

9    Подготовка к выполнению измерений...........................................................7

9.1    Отбор образцов.................................................................................................7

9.2    Подготовка лабораторной посуды.....................................................................7

9.3    Приготовление растворов.................................................................................7

9.4    Подготовка набора реагентов............................................................................8

9.5    Подготовка проб.............................................................................................11

10    Выполнение измерений.................................................................................13

10.1    Общие требования..........................................................................................13

10.2    Дозирование компонентов набора реагентов и последовательность операций

при выполнении анализа..........................................................................................13

11    Обработка результатов измерения...............................................................15

11.1    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

повторяемости..........................................................................................................16

12    Оформление результатов измерений.................................. 16

12.1    Форма представления результатов измерения с использованием расширенной

неопределенности.....................................................................................................16

12.2    Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой

концентрации пенициллина с использованием предела измерения..........................17

12.3    Форма представления результатов в виде односторонней оценки .массовой

концентрации пенициллина с использованием значения верхней границы диапазона измерений.................................................................................................................17

13    Контроль точности результатов измерений................................................17

13.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости. 17

13.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

промежуточной прецизионности..............................................................................18

13.3    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

воспроизводимости..................................................................................................18

13.4    Контроль правильности..................................................................................19

13.5    Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных

карл Шухарта (КК)...................................................................................................20

14    Нормативные ссылке....................................................................................22

Библиография.........................................................................................................23

где N_w - количество лунок микротитровального планшета, используемых при проведении измерений, рассчитывается по п. 9.4.2;

V, - объем конъюгата антител с пероксидазой X® 2, приготавливаемого в запас, мм³ (не мснсс 200 мм³).

Конъюгат антител с пероксидазой № 2 приготавливается непосредственно перед проведением ИФА и хранению не подлежит.

9.4.8 Приготовление раствора белка, связывающего пенициллин

В стеклянную пробирку вместимостью 5 см³ отбирают дозатором аликвоту 10* концентрата раствора белка, связывающего пенициллин, добавляют дозатором в 9 раз больший по отношению к объему добавленной аликвоты концентрата объем экстракционного буфера для пенициллина, приготовленного по п. 9.3.1. Содержимое пробирки тщательно перемешивается путем вращения закрытой пробирки.

Объем используемой аликвоты V, см³, концентрата рассчитывается на основании количества используемых лунок микротитровального планшета по формуле

где N_w - количество лунок микротитровального планшета, используемых при проведении измерений, рассчитывается по н. 9.4.2;

У_х - объем раствора белка, связывающего пенициллин, приготавливаемого в запас, мм³ (нс менее 100 мм³).

Раствор белка, связывающего пенициллин, приготавливается непосредственно перед проведением ИФА и хранению не подлежит.

9.5 Подготовка проб

9.5.1 Подготовка проб сырого, стерилизованного и пастеризованного молока

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с разделом 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

Образец молока переносят в коническую колбу вместимостью 100 см³ в таком количестве, чтобы колба заполнилась примерно до половины своей вместимости, и тщательно перемешивают на вортсксе.

От образца молока с помощью дозатора отбирают две параллельные пробы объемом 5 см³ и помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. Центрифугируют пробы в следующем режиме: 4000 об/мин, 10 мин. Шпателем или наконечником дозатора удаляют верхний жировой слой, образовавшийся на поверхности молока после центрифугирования. Для обезжиренного молока описанную выше процедуру по удалению жира не производят.

Отбирают дозатором аликвоты обезжиренного молока объемом 100 мм³ и переносят в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³. В пробирки добавляют отмеренные дозатором 400 мм³ экстракционного буфера для пенициллина, приготовленного по и. 9.3.1, и тщательно перемешивают содержимое на i

Полученные подготовленные проб:

Допускается хранение подготовленных 25 °С в течение двух часов.    В if

9.5.2 Подготовка проб сухого молока

Для подпуговки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. От образца сухого молока отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с погрешностью 0,0! г. Навески помещают в стеклянные пробирки вместимостью 10 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные с помощью дозатора 9 см³ дистиллированной воды. Содержимое пробирок вегряхивают до полного растворения, после чего выдерживают н течение 15 мин и перемешивают.

От образца молока с помощью дозатора отбирают две параллельные пробы объемом 5 см³ и помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. Центрифугируют пробы в следующем режиме: 4000 об/мин, 10 мин. Шпателем или наконечником дозатора удаляют верхний жировой слой, образовавшийся на поверхности молока после центрифугирования. Для обезжиренного молока описанную выше процедуру по удалению жира не производят.

Отбирают дозатором аликвоты обезжиренного молока объемом 100 мм³ и переносят в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³. В пробирки добавляют отмеренные дозатором 400 мм³ экстракционного буфера для пенициллина, приготовленного но п. 9.3.1, и тщательно перемешивают содержимое на вортексс.

Полученные подготовленные пробы используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.5.3 Подготовка проб йогурта, кефира, сметаны, молочной сыворотки,

восстановленной сухой молочной сыворотки

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру представленного образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

Сухую молочную сыворотку восстанавливают следующим образом. В мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 2 параллельные навески образца массой 6,25 г, взвешенные с погрешностью нс более 0,01 г. К навеске приливают небольшими порциями по 10-20 см³ дистиллированную воду, перемешивая содержимое вращением колбы до полного растворения, затем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

При наличии в образце йогурта частиц твердой консистенции их огбрасываюг. Перед взятием навески испытуемый образец тщательно перемешивают.

От образца отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г, и помещают их в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. В пробирки с пробами добавляют отмеренные дозатором 1,0 см³ буфера язя доведения проб, приготовленного по п. 9.3.2, 3,0 см³ экстракционного буфера для пенициллина, приготовленного но п. 9.3.1, и перемешивают на вортексс в течение 3 мин на максимальной скорости.

Затем пробирки центрифугирую^у|Л^^5^1_;£сж^имс^: 4000 об/мин, 5 мин.

Дозатором* отбирают ал hi попадания в нес верхнеш слоя вместимостью 5 см.

Полученные подготовленные

Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 ^вС в течение двух часов.

9.5.4 Подготовка проб масла сливочного, сыра, творога

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Образец масла, охлажденный до температуры нс выше минус 10 °С, измельчают с помощью терки и перемешивают. У образца сыра отделяют тесто от корки, полимерно-парафинового или воскового сплава, измельчают тесто с помощью терки и перемешивают. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. Образец творога тщательно гомогенизируют, избегая отделения сыворотки.

От гомогенизированного образца отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с погрешностью 0,01г. Навески помещают в пробирки для ценгрифугирования вместимостью 15 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные дозатором 4 см³ экстракционного буфера для пенициллина, приготовленного но п. 9.3.1. Пробирки с пробами выдерживают на водяной бане при температуре от 50 °С до 55 °С до расплавления пробы, но не менее двух минуг.

Затем пробирки с пробами интенсивно встряхивают на шейкере или вручную в течение 5 мин, после чего центрифугируют в следующем режиме: 4000 об/мин, 10 мин.

Дозатором отбирают аликвоты объемом 1 см³ из нижнего (водного) слоя, избегая попадания в нее верхнего слоя жира и переносят их в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³.

Полученные подготовленные пробы используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

10 Выполнение измерений

10.1    Общие требования

Для проведения измерений используют пробы, подготовленные в соответствии с п. 9.5. Компоненты набора реагентов подготавливают в соответствии с п. 9.4.

10.2    Дозирование компонентов набора реагентов н последовательность операций при выполнении анализа

10.2.1    Внесение градуировочных растворов н растворов проб

В лунки микротитровального планшета, размеченного согласно и. 9.4.2, вносят отобранные дозатором две аликвоты объемом 50 мм³ каждого градуировочного раствора, приготовленного согласно п. 9.4.5. Каждую аликвоту вносят в отдельную лунку, внесение производится в порядке возрастания концентраций градуировочных растворов (т.е. 0,00, 0,08, 0,20, 0,40, 0,80, 1,20 нг/см¹). Затем в соответствующие лунки микротитровального планшета вносят отобранные дозатором аликвоты объемом 50 мм³ двух параллельных проб каждого образца.    _

---

10.2.2    Добавление раствора белке,     //as    '•*'

В каждую лунку микротитроваи|

100 мм³ раствора белка, связывающего пенициллин, приготовленного по п. 9.4.8. Перемешивают содержимое лунок медленными круговыми движениями планшета по поверхносги стола в течение 1 мин.

10.2.3    Инкубация планшета

Помещают планшет в инкубатор при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 30 мин. При отсутствии инкубатора микротитровальный планшет инкубируют в течение 30 мин в помещении при условиях, указанных в разделе 7.

10.2.4    Промывка планшета

По окончании инкубации аккуратно удаляют пленку, закрывающую лунки (если инкубация проводилась в помещении). Выливают содержимое лунок планшета путем его резкого переворачивания. Промывают планшет три раза, добавляя при этом каждый раз многоканальным дозатором в лунки планшета по 250 мм³ промывочного раствора, приготовленного по п. 9.4.6, и затем выливая его резким переворачиванием планшета.

Рекомендуется проводить процедуру промывки планшета с помощью устройства для отмывки планшетов, задавая следующие параметры программы: количество циклов промывки - от 3 до 4, объем заливаемого моющего расгвора -250 мм³.

После последнего промывания планшет переворачивают и удаляют остатки жидкости легким постукиванием по поверхности стола, накрытого сухим листом фильтровальной бумаги.

10.2.5    Добавление конъюгата антител с перокендазой № 2

Немедленно после удаления остатков промывочногт) раствора в лунки планшета добавляют по 150 мм³ конъюгата антител с перокендазой № 2, приготовленного по п. 9.4.7, и аккуратными круговыми движениями планшета перемешивают содержимое лунок.

10.2.6    Инкубация планшета

Сразу же после добавления конъюгата антител с перокендазой №2 планшет помещают в инкубатор при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 30 мин. При отсутствии инкубатора микротигровальный планшет инкубируют в течение 30 мин в защищенном от света месте при условиях, указанных в разделе 7.

10.2.7    Промывка планшета

Промывают планшет в соответствии с п. 10.2.4.

10.2.8    Добавление ТМВ-субсграта

Немедленно после удаления остатков промывочного расгвора в лунки планшета добавляют отмеренные дозатором 100 мм³ ТМБ субстрата, после чего сразу же начинают отсчет времени инкубации. Перемешивают содержимое лунок медленными

Нс допускается выливать об избежание его контаминации.

10.2.9    Инкубация планшета

Планшет помешают в инкубатор при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 15 мин. При отсутствии инкубатора микротитровальный планшет инкубируют в течение 15 мин в защищенном от света месте при условиях, указанных в разделе 7.

10.2.10    Завершение реакции окрашивания

Сразу же после окончания времени инкубации в лунки планшета добавляют по 100 мм³ стоп-реагснта, отмеренных дозатором, и аккуратными круговыми движениями планшета перемешивают содержимое лунок.

10.2.11    Измерение оптической плотности

Немедленно после перемешивания вытирают микрофибровой салфеткой нижнюю наружную поверхность лунок планшета и измеряют оптическую плотность лунок планшета с помощью автоматического микропланшетного фотометра при длине волны 450 нм. Измерения проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

11 Обработка результатов измерения

Программное обеспечение «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», разработанное BIOO Scientific Corporation (США), далее «программное обеспечение» производит обработку результатов измерений оптической плотности, введенных оператором с помощью интерфейса пршраммного обеспечения.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности В/В₀ от натурального логарифма концентрации пенициллина вида

значение результатов двух измерений параллельных проб при выполнении условия повторяемости по п. 11.1

(8)

где X_yt Х₂ - результаты двух измерений массовой концентрации пенициллина в

параллельных пробах, мкг/кг.

Окончательный результат измерений округляют до второго десятичного знака. Если окончательный результат измерений X оказывается меньше, чем предел измерений, то дастся односторонняя оценка массовой концентрации пенициллина в образце с использованием предела измерения согласно п. 12.2.

Если окончательный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений, то дается односторонняя оценка массовой концентрации пенициллина в образце с использованием значения верхней границы предела измерений согласно н. 12.3.

11.1 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений, получешых в условиях повторяемости, проводят в соответствии с требованиями С'ГБ ИСО 5725-6 следующим образом.

Рассчитывают расхождение между результатами измерений параллельных проб одного образца \Ху~Х₂\, значение которого сравнивают с абсолютным значением предела повторяемости г•_аЬг. Если выполняется услоние

\Ху-Х₂\$

то оба результата считают приемлемыми и в качестве результата измерений указывают среднее арифметическое значение X, рассчитанное по формуле (8).

Абсолютное значение предела повторяемости r_wij , мкг/кг. рассчитывают по формуле

г*, =0,01-г

где X - среднее арифметическое значение результатов измерений параллельных проб одного образца, мкг/кг,

г - относительное значение предела повторяемости, приведенное в таблице 4, %. При невыполнении условия (9) проводят повторные измерения согласно разделу 10.

12 Оформление результатов измерений

12.1 Форма представления результатов измерения с использованием расширенной неопределенности

Результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в

виде

при доверительной вероятности Р = где X -результат измерений, мпгарг; методикой и рассчитанный согласно рякйь

U(X)- расширенная неопределенность результатов измерений, мкг/кг. Расширенную неопределенность результата измерений U(X) , мкг/кг, рассчитывают по формуле

U(X) = 0,01 их

где U - относительная расширенная неопределенность результата измерений, выполняемых в соответствии с МВИ, %, приведенная в таблице 1.

При необходимости можег быть проведена оценка расширенной неопределенности измерений, выполняемых в соответствии с данной МВИ при ее реализации в конкретной лаборатории.

12.2 Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой концентрации пенициллина с использованием предела измерения

Если конечный результат измерений X оказывается меньше, чем предел измерения Х_щ , равный 1,00 мкг/кг, то дается односторонняя оценка массовой концентрации пенициллина в образце с использованием предела измерения, в мкг/кг

менее X_LQ

где X_ljQ - значение предела измерений, приведенное выше.

12.3 Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой концентрации пенициллина с использованием значения верхней границы диапазона измерений

Если конечный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений X_№ , равное 6,00 мкг/кг, то дается односторонняя оценка массовой концентрации пенициллина в образце с использованием значения верхней границы диапазона измерений, в мкг/кг

более X_HL,

где X_HL - значение верхней границы диапазона измерений, приведенное выше.

13 Контроль точности результатов измерений

Контроль качества проведения измерений выполняется с периодичностью, установленной системой менеджмента качества в лаборатории, но обязательно:

•    при внедрении методики;

• при появлении факторов, влияющих на стабильность процесса по результатам анализа контрольных карт;

•    при значимых изменениях в условиях измерений (другая партия реагентов, новые средства измерений, ремонт оборудования и та);

• при любых выявленных несоответствиях в работе лаборатории, применитсльно к методике выполнения измерений.

13.1 Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости

Оперативный контроль измерения концентрации пени но результатам двух параллель:

13.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности с изменяющимися факторами оператор-время, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6 следующим образом.

Лаборатория получает два результата измерений Х_х,Х₂ согласно разделу 10, варьируя факторы промежуточной прецизионности (оператор, время) и обеспечивая контроль повторяемости по п. 11.1. За результат измерений принимают среднее арифметическое значение двух результатов X_ltX₂

*    = *'**’ ■    О²)

при их соответствии условию (13)

|т;-^| s си*.,    (и)

где СЦ*. - абсолютное значение критической разности, мг/кг, рассчитываемое по формуле

СД*=О,О1-С0-5,    (14)

где CD - относительное значение критической разности, приведенное в таблице 4, %.

13.3    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6 следующим образом.

Каждая из двух лабораторий проводит измерения согласно разделу 10 и получает результат' измерений, обеспечивая контроль повторяемости по п. 11.1.

Рассчитывают среднее арифметическое значение X , мкг/кг, результатов измерений двух лабораторий Х_} и Х₂ соответственно

*    = ^    05)

Рассчитывают абсолютное расхождение между результатами измерений \Х_У - Х₂\ , полученными в двух лабораториях, значение, которого сравнивают с абсолютным значением критической разности Сй_я . Нели выполняется условие

S CD„,    (16)

то оба конечных результата, полученные двумя лабораториями считаются приемлемыми и of быть использовано

Абсолютное формуле

где X - среднее арифметическое значение результатов измерений двух лабораторий, мкг/кг;

к - коэффициент, равный 1,4;

CD - относительное значение критической разности, %, приведенное в таблице 4.

При превышении значения критической разности дня разрешения различий между результатами, полученными двумя лабораториями, используют процедуры, указанные в разделе 5 СТБ ИСО 5725-6.

Таблица 4 — Относительные значения предела повторяемости, критической

разности и норматива контроля правильности

Диапазон измерений, мкг/кг Предел повторяемости г,% Критическая разность CD, % Норматив контроля правильности Км , % от 1,00 до 6,00 в ключ. 9 14 14 _ i

13.4 Контроль правильности

Кошроль правильности определения массовой концентрации пенициллина производится путем анализа образцов для котроля (ОК) с заранее известным значением концентрации вещества (рабочая проба с добавкой).

Контроль правильное™ проводится с использованием добавок пенициллина. Неопределенность аттестованного значаща массовой концентрации пенициллина в ОК нс должна превышать одной трети от значения неопределенности результата измерений.

13.4.1 ОК, представляющие собой рабочие пробы с добавкой

Данные образцы для контроля представляют собой навеску пробы, массовая концс1прация пенициллина в которой менее предела измерения данной МВИ, в которую внесена добавка раствора пенициллина. Добавка вносится непосредственно в пробирки с навесками (аликвотами) проб. Значение массовой концентрации пенициллина Х^ в пробе с добавкой рассчитывается по формуле

X_ae = ^CSL'^Vs^.

где С„ - концентрация раствора пенициллина, нг/см³;

- объем раствора пенициллина, см³; m - масса навески пробы, г.

Примечание: принимается, что для сырого, пастеризованною, стерилизованного молока масса m, г численно равна объему аликвоты, см³.

Величина массовой концентрации пенициллина в пробе с добавкой должна находиться в диапазоне измерений.

Для внесения добавки используется раствор пенициллина, нриютовленный из бензил пенициллина калиевой или натриевой соли в соответствии с прилагаемой инструкцией. Допускается использовать для внесения добавок готовые spike^ при условии, что относительная стандартна^,иаод^дсденносп добавлен концентрации нс превышает 3 %.

13.4.2 Проведение контрольной процедуры

Получают результаты измерений ОК в соответствии с требованиями раздела 10.

За результат контрольною измерения принимают результат измерения массовой

концетрации пенициллина Х_к в ОК, мкг/кг, рассчитанный по формуле (15) при выполнении условия повторяемости по пЛ1.1.

Критерием приемлемости является условие

s о,01/с_ т;,    (19)

где К_ояш - относительный норматив контроля правильности, %, приведенный в таблице 4.

X" - установленное значение массовой конценчрации пенициллина в ОК, мкг/кг.

При невыполнении данного условия контрольную процедуру повторяю!. При повторном невыполнении условия (19) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.5 Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных карт Шухарта (КК)

С помощью КК контролируют следующие показатели точности:

•    повторяемость (R-карта или карта размахов);

•    наличие смещения или правильность (Recovery-карта).

Подготовка и оформление исходных данных, расчеты параметров КК, ведение, управление и интерпретация КК должны осуществляться в соответствии с требованиями [ 3 ] и С1Ъ ИСО 5725-6-2002, раздел 6.

Для проверки стабильности соответствия результатов испытаний показателям повторяемости, установлатым данной методикой, применяются КК с заданными стандартными значениями. В этом случае для построения КК используют показатели повторяемости в соответствии с таблицей 1.

Примечание: При применении КК в течете длительного времени, для расчета границ КК могут быть использованы данные измерений, накопленные в процессе ведения и обработки КК. Однако соответствие результатов измерений требованиям данной методики может быть заявлено только в том случае, если показатель повторяемости, рассчитанный по накопленным лабораторией данным, статистически не превышает установленных методикой значений.

Для построения и ведения R-карт в качестве образцов для контроля (ОК) могут использоваться рабочие образцы.

Для построения и ведения Recovery-карт используются ОК, представляющие собой рабочие пробы с добавками раствора пенициллина, приготовленного из бензил пенициллина калиевой или натриевой соли в соответствии с прилшвемой инструкцией. Предварительно установленная массовая концентрация пенициллина в данных пробах без добавки должна быть менее предела измерения данной МВИ. Рекомендуется вносить добавку пенициллина в образны для контроля на уровне массовых концентраций в рабочих пробах.

1    Область применения

Настоящая методика распространяется на молоко (сырое, пастеризованное, стерилизованное), молоко сухое¹, масло сливочное, сыр, творог, молочную сыворотку, восстановленную сухую молочную сыворотку, йогурт, кефир, сметану и устанавливает метод конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) для определения содержания пенициллина (бегаилпенициллина).

Методика предназначена для проведения измерений массовой концентрации пенициллина с использованием набора реагентов «MaxSignal ® для определения пенициллина», каталожный номер 1065-01В («MaxSignal® Penicillin ELISA Test Kit», Reference # 1065-0IB) производства BlOO Scientific Corporation (США), далее набор реагентов.

Диапазон измерений методики составляет от 1,00 до 6,00 м кг/кг. Предел измерения для данной методики составляет 1,00 мкг/кг.

Настоящая методика разработана в соответствии с требованиями ГОСТ 8.010.

2    Точность измерений

Настоящая методика обеспечивает измерение массовой концентрации пенициллина в указанном выше диапазоне с показателями точности, указанными в таблице 1.

В таблице 1 также приведены значения оценок относительной суммарной стандартной неопределенности и относительной расширенной неопределенности.

Таблица 1 - Относительные значения показателей повторяемости и промежуточной прецизионности

Диапазон измерений, мкг/кг Относительное стандартное отклонение повторяемости а,, % Относительное стандартное отклонение промежуточной прецизионности <Г/(ГО)> % Относительная суммарная стандартная неопределенность и(, % Относительная расширенная неопределенность и, %, К=2,Р = 95% от 1,00 до 6,00 включ. 3,0 5,2 7 14

Указанные в таблице 1 метрологические характеристики получены на основании данных эксперимента в соответствии с:

•    показатели прецизионности СТБ ИСО 5725-2;

•    показатели правильности - ( 1 ];

•    оценки неопределенности - [ 1 ], [ 2 ].

Весы лабораторные of точности с наибольшим пред*

Результат измерений массовой kohi согласно данной методике продукту

13.5.1 Расчет параметров, ведение и оформление данных, интерпретация КК размахов для контроля стабильности СКО повторяемости

Рассчитываются значения центральной линии, границ регулирования и предупреждающих 1раниц по формулам • Центральная линия

</₂<7, = 1,128<т_г,    (20)

где    <т_г - относительное СКО повторяемости, %, приведенное в таблице 1.

•    Предупреждающие границы

UCL = D₂ -<х, =2,834-<т,    (21)

•    Границы регулирования

UCL = D₂ a_r = 3,686 о,    (22)

Графическое построение КК состоит в проведении на выбранной шкале центральной линии и контрольных границ.

Ведение КК предусматривает набор данных X_lt Х₂ при выполнении испытаний ОК в условиях повторяемости в полном соответствии с методикой, расчета фактических относительных значений размаха W по формуле (23), оформлении Листа данных КК и нанесения данных на КК.

200\Х,-Х,\

х,+х₂ ’

где Х_у, Х₂ - значение результатов измерений в условиях повторяемости. Интерпретация данных КК осуществляется в соответствии с [ 3 1, п. 7.

Оценку СКО повторяемости S_r за контролируемый период получают но формулам (23), (24)

где N - общее число измерений (точек) на КК, для получения значений центральной линии и границ необходимо, чтобы N = 15..20; d₂ - коэффициент, d₂ =*1,128.

13.5.2 Расчет параметров, ведение и оформление данных, интерпретация Recovery-карт для контроля стабильности правильности

Рассчитываются значения центральной линии, границ регулирования и предупреждающих границ по формулам • Центральная линия

Автоматический микропланшетный фотометр с фильтром на 450 нм (допускаемая погрешность измерения оптической плотности не более ± 5 %), например iMark Microplate Absorbance Reader, производства Bio-Rad Laboratories, Inc.,

Программное обеспечение «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», разработанное BIOO Scientific Corporation (США).

Термометр лабораторный частичного пстружения класса точности 1 с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая частоту вращения 4000 об/мин (пробирки вместимостью 2 и 15 см³), например 1236, производства LaboGene Aps, Дания.

Холодильник бытовой, позволяющий поддерживать температуру от плюс 2 °С до плюс 8 °С в холодильной камере и нс выше минус 18 °С в морозильной камере.

Лабораторный вортекс, обеспечивающий скорость вращения нс менее 1800 об/мин, например MSV-3500, производства BioSan Ltd, Латвия.

Лабораторный шейкер, обеспечивающий скорость до 300 об/мин.

Гомогенизатор лабораторный типа TissueRuptor производства QIAGEN Group (Германия) или бытовой блендер.

Баня водяная, обеспечивающая поддержание температуры от 50 °С до 55 °С.

Дозагоры пипсточные с комплектом одноразовых наконечников, например Acura manual 825, Acura manual 835, Acura manual 855 производства Socorex ISBA S.A., Швейцария:

-    с диапазоном объемов дозирования от 10 до 100 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 2,5 %;

-    с диапазоном объемов дозирования от 100 до 1000 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,5 %;

-    с диапазоном объемов дозирования от 1 до 10 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального * 2,0 %;

-    многоканальный с диапазоном объемов дозирования от 40 до 350 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,5 %.

Использование следующего оборудования нс является обязательным, но рекомендуется для увеличения производительности и повышения точности измерений:

•    Инкубатор для микротитровальных нланшегов, обеспечивающий поддержание температуры от плюс 20 ®С до плюс 25 °С с точностью ± 1 °С, например PST-60HL производства BioSan Ltd, Латвия.

•    Устройство отмывки иммунологических планшетов автоматическое с диапазоном объемов моющего раствора, заливаемого в каждую микрокювету от 100 мм³ до 350 мм³, например ELx 50/8, производства BioTek Instruments, Inc., США.

Пленка «иарафильм» или скотч.

Микрофибровые салфетки для очистки оптических поверхностей.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Шпатели пластковые.

Штатив для пробирок.

Пробирки полипропилене!

полипропилена вместимостью 2 < Пробирки стеклянные вм

ГМ-10-14/23 ХС по ГОСТ 1770.

Колбы конические вместимостью 100 см³, 250 см типа Кн—2-100-14/23 ХС, Кн-2-250-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Воронки типа В-56-80 ХС, В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканы Н-1 - 100 или Н-1 -150 по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные вместимостью 25 см³, 100 см³ типа 3-25-2, 3-100-2 по ГОСТ 1770.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Лабораторный детергент, например Triton Х-100.

Набор реагентов «MaxSignal® для определения пенициллина», каталожный номер 1065-01В («MaxSignal® Penicillin EUSA Test Kit», Reference# 1065-0IB) производства BlOO Scientific Corporation (США) - набор реактивов и микротитровальнмй планшет, необходимые для выполнения измерений по определению концентрации пенициллина методом иммуноферментного анализа в составе (таблица 2).

Таблица 2 - Состав набора реагентов

Компонент набора Количество I в комплекте 1 Микротитровальный планшет (12 стрипов но 8 лунок, покрытых пенициллином) 1 шт Основной стандарт пенициллина (бензилпенициллина, пенициллина G) массой 1000 нг (порошок) для приготовления i-радуировочных растворов 2 шт Флаконы для приготовления фадуировочных растворов пенициллина с концентрацией 0 нг/см3, 0,08 нг/см3, 0,20 нг/см3, 0,40 нг/см3, 0,80 нг/см3, 1,20 нг/см3 6 шт I Раствор белка, связывающего пенициллин (10х концентрат) 1,8 см3 1 Буфер 1 для разбавления градуировочных растворов молока 15 см3 HRP-конъюгат антител № 2 (200х концентрат) 0,1 см3 Растворитель для антител № 2 20 см3 Экстракционный буфер для пенициллина (1 Ох концентрат) 2x25 см3 Промывочный раствор (20х концентрат) 28 см5 Стоп-реагент 14 см3 ТМБ субстрат 12 см3 Буфер для доведения проб (10х концентрат) 10 см ‘

Следующие компоненты набора реагентов являются взаимозаменяемыми в пределах их срока хранения при условии совпадения их номера в наборах реагентов производства BIOO Scientific Corporation:

•    растворитель для антител № 2;

•    экстракционный буфер для пенициллина;

•    промывочный раствор;

•    стоп-рсагент;

•    ТМБ субстрат.

4 Метод измерений    *S*^!1%*Z

Используемый метод оси    01

иммупофсрмснтном анализе. В ходе анализа в лунки планшета, покрытого пенициллином, вместе с пробой добавляют белок, высоко-афинный к захвату пенициллина. Присутствующий в пробе пенициллин конкурирует с пенициллином, нанесенным на стенки лунок, за связывание с белком. После внесения вторичных антител, коньюшрованных с ферментом пероксидазой, последние связываются с белком, связанными с пенициллином на стенках лунки. После добавления субстрата, а затем стол-реагента, измеряется оптическая плотность раствора при 450 нм. Измеренная оптическая плотность находится в обратной зависимости от концентрации пенициллина в градуировочном растворе и пенициллина в растворе пробы. Массовая концентрация пенициллина в образце определяется по градуировочной зависимости, построенной с использованием 6 градуировочных растворов.

5    Требования безопасности и требования к квалификации операторов

5.1    Общие требования безопасности

При выполнении работ в соответствии с данной методикой персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

•    электробезопасности по ГОСТ 12.2.003;

•    пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004;

•    техники безопасности при работе в химической лаборатории в соответствии с инструкциями, утвержденными в установленном порядке;

•    техники безопасности, изложенные в инструкции по эксплуатации средств измерений и оборудования, применяемых при проведении измерений.

5.2    Требования к квалификации операторов

К проведению работ по данной методике допускаются лица, имеющие высшее специальное или среднее специальное образование по профилю выполняемых работ, прошедшие обучение приемам работы на оборудовании, освоившие выполнение всех операций, предусмотренных методикой, владеющие техникой постановки иммуноферментного анализа.

6    Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

•    температура окружающего воздуха от плюс 20 °С до плюс 25 °С;

•    температура при приготовлении растворов (20 * 2) °С;

•    относительная влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С.

7    Условия инкубации мнкротитровальных планшетов в помещении

При отсутствии инкубатора микротитровалышс планшеты могут инкубироваться в помещении при выполнении следующих условий:

25 °С;

•    не должно происходи

•    планшет нс должен

искусственных потоков воздух!

•    с целью устранения воздействия холодной поверхности стола, на котором находится планшет, рекомендуется помещать под него теплоизоляционный материал, например, сложенное в несколько слоев бумажное полотенце.

•    при низкой относительной влажности воздуха и наличии воздушных потоков с целью устранения возможности испарения содержимого лунок рекомендуется покрывать планшет пленой «иарафильм» или заклеивать скотчем.

•    в особых случаях, которые оговорены по тексту МВИ, требуется помещать планшет в защищенное от света место, например в ящик стола.

8    Условия хранения набора реагентов

Хранение набора реагентов осуществляется в холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в оригинальных флаконах и упаковке. Микротитровальныс планшеты должны храниться в плотно закрытой упаковке. Дополнительные рекомендации по хранению набора рсагеигов приведены в инструкции производителя.

9    Подготовка к выполнению измерений

9.1    Отбор образцов

Отбор образцов для анализа проводят по СТБ 1036. Отобранные образцы могут храниться в защищенном от света месте при температуре от плюс 2 °С до плюс 4 °С в течение 2-х дней или в замороженном виде при температуре не выше минус 18 °С в течение 14 дней. Перед проведением подготовки проб по п. 9.5 замороженные образцы должны быть разморожены при температуре от плюс 2 °С до плюс 4 °С.

9.2    Подготовка лабораторной посуды

Силыюза1рязнснную лабораторную посулу предварительно обрабатывают хромовой смесью. Лабораторную посуду после мойки в растворе специализированного моющего средства промывают водопроводной, ополаскивают дистиллированной водой 2 раза и высушивают.

Запрещается:

•    многократное использование одноразовой лабораторной посуды;

•    использование бытовых моющих средств для мойки лабораторной посуды.

9.3    Приготовление растворов

9.3.1 Приготовление экстракционного буфера для пенициллина

В коническую колбу вместимостью 100 см³ или 250 см³ (в зависимости от объема приготавливаемого раствора) приливают дозатором или цилиндром аликвоту 10х концентрата экстракционного буфера для пенициллина, добавляют цилиндром в 9 раз больший по отношению к объему добавленной аликвоты концентрата объем дистиллированной воды и перемешивают раствор.

Объем используемой аликвоты К, см³, концентрата экстракционного буфера для пенициллина рассчитывается формуле

где N_{ - количество анализируемых образцов молока;

N₂ - количество анализируемых образцов масла сливочного, сыра или гворога;

N) - количество анализируемых образцов молочной сыворотки, восстановленной сухой молочной сыворотки, йогурта, кефира, сметаны;

У_х - объем экстракционного буфера для пенициллина, приготавливаемого в

запас, см³ (не менее 1 см³).

Экстракционный буфер для пенициллина приготавливается непосредственно перед использованием и хранению не подлежит.

9.3.2 Приготовление буфера для доведения проб

В коническую колбу вместимостью 100 см³ приливают дозатором аликвоту Юх концентрата буфера для доведения проб, добавляют цилиндром в 9 раз больший по отношению к объему добавленной аликвоты концентрата объем дистиллированной

воды и перемешивают раствор.

Объем используемой аликвоты V, см³, концентрата буфера для доведения проб рассчитывается на основании количества анализируемых образцов по формуле

где А',    —    количество    анализируемых    образцов    молочной    сыворотки,

восстановленной сухой молочной сыворотки, йогурта, кефира, сметаны;

У, - объем буфера для доведения проб, приготавливаемого в запас, см³ (не менее 0,5 см³).

Буфер для доведения проб приготавливается непосредственно перед использованием и хранению не подлежит.

9.4 Подготовка набора реагентов

9.4.1 Предварительная подготовка и правила обращения с наборами реагентов

Набор реагентов извлекают из холодильника, нс открывая упаковку микротитровального планшета, выдерживают при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С от 1 до 2 ч, доводят температуру остальных реагентов от плюс 20 ®С до плюс 25 °С.

При работе необходимо исключить прямое попадание солнечных лучей на компоненты набора реагентов.

Растворы из набора реагентов следует готовить непосредственно перед проведением ИФА. Перед использованием жидкие реагенты необходимо перемешать путем осторожного вращения или переворачивания флаконов. Не допускается переливать остатки реагентов обратно в оригинальные флаконы.

где N_SMr - количество образцов;

12 - количество лунок для градуировочных растворов.

Микротитровапьный планшет со стрипами, предварительно подготовленные в соответствии с п. 9.4.1, вынимают из упаковки. В микропгитровальный планшет помещают необходимое количество стрипов, рассчитанное исходя из требуемого для проведения измерений количества лунок N_w. Оставшиеся стрипы сразу же помещают

в упаковку, закрывают и хранят в соответствии с разделом 8.

Распределение лунок для градуировочных растворов и проб проводят согласно схеме, предлагаемой программным обеспечением «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», с учетом выполнения по два параллельных измерения фадуировочных растворов и образцов.

Не рекомендуется одновременно использовать более шести стрипов. Если необходимо провести измерение более 18 образцов, ИФА выполняется несколько раз.

9.4.3 Приготовление основного раствора пенициллина с концентрацией 1000 нг/см³

К содержимому флакона с основным стандартом пенициллина добавляют отмеренные дозатором дозатором 1,0 см³ экстракционного буфера для пенициллина, приготовленного по п. 9.3.1. Содержимое закрытого флакона перемешивают на вортексе в течение 30 с. Основной раствор пенициллина делят на аликвоты для приготовления в соответствии с п. 9.4.5 раствора    пенициллина с

концентрацией 20 нг/см³, которые хранят при температуре не выше минус 18 °С нс более месяца. Осгатки аликвот после использования дальнейшему хранению не подлежат.

9.4.4 Приготовление основного раствора пенициллина с концентрацией 20 нг/см³

В стеклянную пробирку вместимостью 5 см³ добавляют 0,98 см³ экстракционного буфера для пенициллина, приготовленного по н. 9.3.1, и 20 мм основного раствора пенициллина с концет рацией 1000 нг/см³, приготовленного по п. 9.4.3. Раствор перемешивают на воргсксе в течение 30 с. Раствор приготавливается перед проведением анализа и хранения не подлежит.

9.4.5 Приготовление градуировочных растворов пенициллина

Градуировочные растворы пенициллина готовят путем последовательного разбавления основного раствора пенициллина с концентрацией 20 нг/см³, приготовленного по п. 9.4.4, следующим образом.

В соответствующий флакон для хранения градуировочных растворов вносят аликвоту раствора пенициллина и аликвоту растворителя для приготовления градуировочных растворов. Раствор пенициллина, от которого опирается аликвота, и объемы аликвот раствора и растворителя, используемые для приготовления градуировочных растворов, указаны в таблице 3. В качестве растворителя используется:

Полученные градуировочные растворы пенициллина хранению нс подлежат и должны быть использованы в течение дня. После использования остатки градуировочных растворов должны быть удалены из флаконов, подлежащих хранению. Пусгые флаконы должны храниться в составе набора реагентов в холодильнике при температуре от плюс 2°С до плюс 4°С и использоваться при последующем приготовлении градуировочных растворов.

Таблица 3 - Схема приготовления градуировочных растворов

! Номер град. раствора Концентрация градуировочного раствора, нг/см3 Источник аликвоты раствора пенициллина для приготовления фадуировочного раствора Объем аликвоты раствора пенициллина Объем растворителя для приготовления градуировочных растворов 6 1,20 основной раствор с концентрацией 20 нг/см3 60 мм3 940 мм3 5 0,80 град, раствор № 6 500 мм3 250 мм7- 4 0,40 фад. раствор К® 5 500 мм3 500 мм3 3 0,20 град, раствор № 4 500 мм3 500 мм3 2 0,08 фад. раствор X® 3 500 мм3 750 мм3 1 0,00 - 500 мм3

9.4.6 Приготовление промывочного раствора

Отмеренную дозатором аликвоту концентрата промывочного раствора объемом от 1 до 9 см³ приливают в коническую колбу вместимостью 250 см³ и добавляют отмеренную цилиндром вместимостью 25 см³ или 100 см³ (в зависимости от добавляемого объема) дистиллированную воду. Объем добавляемой дистиллированной воды должен быть в 19 раз больше, чем объем концентрата промывочного раствора. После перемешивания содержимое колбы перепивают в емкость с закручивающейся пробкой. Если приготовленный объем раствора нс превышает 50 см³, то для его приготовления н хранения могут использоваться пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³. 11олучепный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 6-ти недель в стеклянной или полиэтиленовой посуде.

9.4.7 Приготовление конъюгата антител с пероксидазой № 2

В стеклянную пробирку вместимостью 5 см³ или 10 см³ (в зависимости от объема приготавливаемого раствора) отбирают дозатором аликвоту концентрата конъюгата антител с пероксидазой № 2 объемом нс менее 10 мм³, добавляют дозатором в 199 раз больший по отношению к объему добавленной аликвоты концентрата объем растворителя для антител №2. Содержимое пробирки тщательно перемешивается нулем вращения закрытой пробирки.

Объем используемой аликвоты V , см³, концентрата конъюгата антител с пероксидазой № 2 рассчитывается на    ва    иснользу&мы&^унок

ммкротитровального планшета по фор!