СОГЛАСОВАНО

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА) В СЫРЬЕ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЭЖХ-МС/МС

мвимн №90~Ц01Ъ

МВ И аттестована РУН ’’Белорусский государственный институт метрологии” Свидетельство об аттестации

от Я" гоузт.

Минск 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Область применения    3

Показатели прецизионности методики    3

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы, материалы 3 Метод измерения    5

Требования безопасности    3

Требования к квалификации оператора    6

Условия выполнения измерений    6

Подготовка к выполнению измерений    6

Выполнение измерений    11

Обработка результатов измерений    12

Оформление результатов испытаний    13

Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях 13 повторяемости

Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

промежуточной прецизионности    14

Проверка стабильности результатов измерений    15

Приложение А. Нормативные ссылки    17

Приложение Б. Пример расчета неопределенности измерений    18

Приложение В. Примеры хроматограмм    22

пробирок отстаивается в течение 10 мин для достижения межфазного равновесия. Гексановую фракцию отбрасывают, а полученный водный экстракт очищают методом твердофазной экстракции на картридже SampliQ (ОРТ 3 см³, 60 мг). Перед нанесением экстракта картридж кондиционируют последовательно 3 см³ метанола и 3 см³ деионизованной воды. После пропускания экстракта картридж промывают 6 см³ деионизованной воды, сушат под вакуумом в течение 10 минут. Затем экстракт элюируют 3 см³ метанола. Элюат упаривают на нагревательном модуле при (45 * 2) °С досуха. К сухому остатку приливают 1,0 см³ смеси ацетонитрил - вода (30:70) и тщательно перемешивают на встряхивателе, затем фильтруют через мембранный шприцевой фильтр (13 мм, 0,2 мкм) из регенерированной целлюлозы в виалу. Полученный раствор используют для дальнейшего ВЭЖХ-МС анализа.

8.8    Проведение пробоподготовки для анализа на содержание левомицетина сухих продуктов (сухое молоко, сухая детская молочная адаптированная смесь, спортивное питание и пид.)

К 1,000*0,001 г сухого пищевого продукта, взвешенного в полипропиленовой пробирке вместимостью 50 см³, вносят 100 мкл внутреннего стандарта (левомицетин-с!5) концентрацией 10 нг/см³(раствор Ж, полученный по п.8.2.3.7). В пробирку приливают 5 см³ дистиллированной воды и интенсивно встряхивают до растворения пробы. Далее приливают 5 см³ 4 М раствора сульфата аммония, тщательно перемешивают, добавляют 18 см³ этил ацетата и помещают на 10 минут на электровстряхиватель для экстракции. Далее пробу центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут при температуре (5 * 2) °С. После центрифугирования отбирают этил ацетатный слой и переносят его в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³. Упаривание растворителя и дальнейшая пробонодготовка осуществляется согласно п.8.7.

8.9    Проведение пробоподготовки для анализа на содержание левомицетина твердых пищевых продуктов (сыр, мясо, мясные изделия и т.д.)

К 1,000*0,001 г твердого пищевого продукта взвешенного в фарфоровой ступке вносят!00 мкл внутреннего стандарта (левомицстин-<15) концентрацией 10 нг/см³ (раствор Ж, полученный по п.8.2.3.7), затем содержимое ступки тщательно перетирают с 3-4 г сульфата аммония и количественно переносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ с помощью 15 см³ эта л ацетата. Далее в пробирку приливают 10 см³ дистиллированной воды и помещают на 10 минут на электровстряхиватель для экстракции. Затем пробу цен грифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут при температуре (5 * 2) °С. После центрифугирования отбирают этил ацетатный слой и переносят его в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³. Упаривание растворителя и дальнейшая пробоподготовка осуществляется согласи^

9 Выполнение измерений

Анализ полученных по п. 8.7 - 8.9 фильтратов проводят на жидо

масс-спектрометрическим детектором. Условия хроматографирования и параметры настройки масс-детектора такие же, как и при построении градуировочного графика п. 8.3. Определяют площади пиков, используя компьютерную систему обработки сигналов. Проводят анализ двух параллельных проб.

ВЭЖХ-МС анализ образцов должен выполняться в виде серии измерений включающей: 1) градуировочные растворы, 2) исследуемый образец, 3) образцы контроля стабильности градуировки (QC).

Результаты измерений округляют до второго знака после запятой и выражают в мкг/кг.

Если массовая доля аналита в анализируемой пробе превышает значение максимального градуировочного уровня, то анализ повторяют с уменьшенной в 2-5 раз навеской.

10 Обработка результатов измерений

Расчет содержания левомицетина, X, мкг/кг, проводят по формуле:

СхУ

где С - концентрация левомицетина, найденная по градуировочному графику, нг/см³;

m - масса навески, г;

V - объем разведения сухого остатка, 1,0 см³.

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений. Вычисления проводят до третьего знака после запятой и округляют до второго.

Допустимые расхождения между параллельными определениями по отношению к величине среднего арифметического значения не должны превышать г.

Результат анализа X, представляют в следующем виде:

X.Z±*L.    (3)

где X/ - результат первого параллельного определения;

X2 - результат второго параллельного определения;

Гарантированный результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в виде:

{X±ЩХ))_% г/кг,    (4)

где X - среднее арифметическое из результатов измерений 2-х параллельных проб, полученное в соответствии с п.9 и рассчитанное согласно п.10;

U(X) - абсолютное значение максимальной расширенной Рассчитывается по формуле:

U(X) = U х 0,01 хХ,

где U - относительное значение максимальной расширенной стандартной неопределенности.

Если величина X оказывается меньше предела измерения методики (CLOQ), то вычисления по формуле (2) не производят, а дают одностороннюю оценку массовой концентрации углевода в пробе в виде X < (CLOQ), где (CLOQ) - нижний предел измерения методики.

11    Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют по форме, установленной действующей в лаборатории системой регистрации данных.

Результаты должны включать следующую информацию:

-    Наименование (шифр) пробы;

-    Дату проведения измерений;

-    Результаты измерений, включая все необходимые данные и промежуточные расчеты;

-    Результаты параллельных определений;

-    Окончательный результат измерений;

-    Фамилию оператора.

12    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости осуществляют согласно п. 5.2.2.1 СТБ ИСО 5725-6. Два результата испытаний должны быть получены в условиях повторяемости.

Рассчитывают абсолютное расхождение между результатами единичных наблюдений \X_t значение которого сравнивают с абсолютным значением предела повторяемости Абсолютное значение предела повторяемости , мкг/кг, рассчитывают по формуле

0,01 т-7    (6)

где 0,01 - коэффициент пересчета из процентов;

X - среднее арифметическое значение двух результатов единичных наблюдений, г/100г; г - относительное значение предела повторяемости, %, указанное в таблице 1.

Если для значения абсолютного расхождения между двумя результатами единичных наблюдений выполняется условие

I*,(7)

то оба результата считают приемлемыми и в качестве результата измерений указывают среднее

арифметическое значение X, рассчитанное по формуле (3).

Если абсолютное значение разности превышает значение г_овс, то результата. Если размах четырех результатов испытаний равен или мен

(формула 7), то среднее арифметическое четырех результатов (формула 10) должно указываться как конечный заявляемый результат.

|*«. -XJ&Rom где CR0.95 - 3,6xsr

Значения s, представлены в таблице 1.

Д «в ³    ■

Если данное условие не выполняется, то следует отказаться от полученных данных, выяснить и устранить причины, приводящие к неудовлетворительным результатам.

13 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности, осуществляют согласно СТБ ИСО 5725-6.

После проверки полученных результатов параллельных определений по критерию

повторяемости по п.12 рассчитывают среднее арифметическое X двух результатов измерений X i и X1 соответственно, мкг/кг:

(Н)

где Х\ и Xi - средние значения, рассчитанные на основании двух параллельных измерений, вычисленные по формуле (3) в условиях промежуточной прецизионности.

Рассчитывают абсолютную разность результатов Xi и Хг, и сравнивают с абсолютным значением предела промежуточной прецизионности CRaec-

С= 0,01 • СЛ₀ ,_$ • X    (12)

где 0,01 - коэффициент для пересчета процентов;

CRo<n ^ш fi—:,    (13)

где г и г/_(ТО) - относительные значения пределов повторяемости и промежуточной прецизионности, указанные в таблице 2.

Если для значения абсолютного расхождения между результатами выполняется условие

(14)

то оба конечных результата, полученные в условиях промежуточной прецизионности, считаются

приемлемыми и среднее значение X, рассчитанное но формуле (11), может быть использовано в качестве заявляемого результата.

При превышении указанного норматива должны быть выяснены и приводящие к неудовлетворительным результатам контроля промежуточной п{ф(изив»10е£$;_и

14 Проверка стабильности результатов измерений

Стабильность результатов измерений проверяется с использованием контрольной карты Шухарта (R-карта размахов по ИСО 8258) в соответствии с СТБ ИСО 5725-6 п.6.2.2.

При построении контрольной карты используют контрольную рабочую пробу стабильную во времени (например, пищевой продукт с внесением левомицетина, соответствующий области применения данной методики с установленным сроком годности). Содержание левомицетина в контрольной рабочей пробе должно соответствовать диапазону измерений. Контрольная рабочая проба должна храниться в условиях, обеспечивающих стабильность концентрации левомицетина во времени.

Рассчитывают:

-    центральную линию: «fcxs,,

где d₂ = 1,128 (коэффициент для расчета центральной линии для п^и2);

-    границы регулирования: UCL=D2xs,,

где Eh * 3,686 (коэффициент для расчета границы регулирования для п=2);

-    предупреждающие границы: UCL^sD2(2)xSr,

где D2(2) = 2,834 (коэффициент для расчета предупреждающих границ для п=2);

s, - стандартное отклонение повторяемости, % (таблица 1).

Оценку стандартного отклонения повторяемости s, за отчетный период (20 - 30 измерений)

получают по формуле:

05)

\Х,, " *J

где w. --"    х    100% - размах;

^Хср>

Х„ и X* - результаты первого и второго определения для i-ой пары, г/кг;

Хер, - среднее значение результатов первого и второго определений для i-ой пары, г/кг L - количество пар проведенных измерений за отчетный период (20 - 30 измерений).

Полученные значения заносят в лист данных контрольной карты:

Дата проведения анализа Наблюдаемые значения Размах w, % Описание X, х2 Хея Сумма I Среднее значение

Графически по оси X откладывают дату проведения анализа, по оси Y отмечают центральную линию и линии предупреждающей и регулирующей i “. и aepiutinM* ДМ1Тиигтаи»и|

Интерпретацию результатов проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6-2002 п.6.

Методика разработана лабораторией химии пищевых продуктов ГУ «РНПЦ гигиены» М3 РБ. Разработчики:

Заведующая лабораторией, к.х.н.

Старший научный сотрудник Старший научный сотрудник, к.х.н.

Научный сотрудник

Нормативные ссылки

Машины, приборы н другие технические изделия. Исполнения для различных климатических районов. Категории, условия эксплуатации, хранения и транспортирования в части воздействия климатических факторов внешней среды.

Инструкции «Основные правила безопасности работы в химических лабораториях». - М.: Химия, 1979 г. ; Общие правила пожарной безопасности Республики Беларусь для общественных зданий и сооружений.»

Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования.

Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности.

Продукты пищевые и продовольственное сырье. Мегоды отбора проб для определения показателей безопасности.

Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике (ISO 5725-6:1994/Соч. 1:2001ДОТ)

Пример методики расчета неопределенности измерений 1 Описание измеряемой величины

Измерение содержания левомицетина в пищевых продуктах в концентрациях 0,2 - 1,0 мкг/кг согласно МВИ включает следующие операции:

-    Отбор навески анализируемой пробы;

-    Экстракцию левомицетина этилацетатом из пищевой матрицы;

-    Обезжиривание пробы с помощью гексана;

-    Доочистку пробы и концентрирование левомицетина с помощью твердофазной экстракции;

-    Фильтрацию элюата через мембранный фильтр миллшюре;

-    Хроматографирование на жидкостном хроматографе.

Математическая модель измерений выражается соотношением:

* - ^

т х Rcc *

где С - концентрация левомицетина, найденная по градуировочному графику, нг/см ,

m - масса навески г;

V - объем разведения сухого остатка 1,0 см^{1 2};

Rec ~ степень извлечения;

Fuq, - фактор повторяемости.

Исходя из полученной модели, неопределенность измеренной массовой концентрации левомицетина включает следующие основные составляющие:

а)    неопределенность, обусловленную случайными факторами (фактор повторяемости);

б)    неопределенность, обусловленную построением и использованием градуировочной характеристики (ГХ);

в)    неопределенность, обусловленную смещением метода;

г)    другие составляющие неопределенности, не учтенные при исследовании прецизионности и смещения.

Учитывая, что результат измерения получают усреднением результатов двух параллельных определений, оценку относительной стандартной неопределенности (ОСН) рассчитывали по

формуле:

(2)

% = 75 Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 - Относительные стандартные неопределенности, обусловленные случайными факторами

Наименование антибиотика Показатель повторяемости, % S, Относительная стандартная неопределенность, % _ЧГТЗЛ_ Левомнцетин 5,2 3,68

3 Оценивание относительной стандартной неопределенности, обусловленной смещением метода

При метрологической аттестации методики установлено, что максимальное значение относительной стандартной неопределенности, обусловленной смещением следующее:

Для левомицетина: u(Rec) % - 0,72 %.

4 Оценивание неопределенности, обусловленной построением и использованием градуировочной характеристики (ГХ)

При метрологической аттестации методики установлены значения относительной стандартной неопределенности, обусловленной построением и использованием градуировочной характеристики (ГХ). Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты исследований относительной стандартной неопределенности, обусловленной построением и использованием градуировочной характеристики (ГХ) (левомнцетин)

х„ нг/см3 U«i, % и™. % Urn, % 0,100 7,7 3,5 8,4 0,200 3,9 1.7 4,3 0,400 2 0.9 2,2 0,800 1,1 0.4 1,2 1,000 1 0,3 1.1

5 Оценивание других составляющих неопределенности Математическая модель измерения, кроме представленных выше вх< оцененных по имеющимся данным по прецизионности и извлечению составляющие неопределенности, связанные с пробоподготовхой и_п.

Значение u„ составляет:

где Unm - СЮН, связанная с взвешиванием пробы;

Unv - ОСН, связанная с измерением общего объема экстракта Uov(ic*³)-Значение и™, вычисляется по формуле:

=^-х100%    (4)

т

где ш - минимальная навеска для анализа 1000 мг;

Исходя из того, что при взвешивании применялись весы лабораторные электронные с погрешностью взвешивания ± 0,3 мг, вычисляем iucoi по формуле:

(5)

и    0    2449

“« = — х 100 -    х 100 = 0,024495%    (6)

" т    1000

Значение u^v вычисляется по формуле:

«.к = >/“*+«»    (7)

Оценивалась стандартная неопределенность объема пипетки 1 см³, исходя из предположения, что температура в лаборатории колебалась в пределах (20±5)°С, а коэффициент расширения воды (70% подвижной фазы) составляет - 0.000207.

Д, 0,01

В таблице 3 представлен бюджет неопределенности измерений, рассчитанные для проб с содержанием левомнцетина в указанном диапазоне измеряемых концентраций.

1    Область применения

Методика предназначена для идентификации и количественного определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола) в сырье животного происхождения и пищевых

продуктах.

Метод основан на экстракции левомицетина этилацетатом, отгонке растворителя, растворении остатка в дистиллированной воде, обезжиривании раствора с помощью гексана, очистке экстракта и концентрировании аналита при помощи твердофазной экстракции и количественном анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Диапазон определяемых концентраций левомицетина - 0,2- 1,0 мкг/кг.

Нижний предел измерения методики (LOQ) составляет 0,2 мкг/кг.

2    Показатели прецизионности методики

Относительные значения показателей прецизионности (повторяемости, промежуточной прецизионности, пределов повторяемости и промежуточной прецизионности) и максимальной расширенной неопределенности при доверительной вероятности Р=0,95 представлены в таблице 1.

Таблица 1    - Относительные значения показателей повторяемости, промежуточной прецизионности, пределов повторяемости и промежуточной прецизионности, максимальной расширенной неопределенности методики при доверительной вероятности Р=0,95

Наименование антибиотика Показатель повторяемости s.% Показатель промежуточной прецизионности ■Т«ТО>*о Предел повторяемости, г. У. Предел промежуточной прецизионности г1П0).54 Максимальная 1 расширенная неопределенность измерения, U, У. Левомииетин 5,2 6.0 14,6 16,8 18,4 1

3 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1 Средства измерений

Жидкостный хроматограф Agilent 1200 с масс-спектрометрическим детектором Agilent 6410

Весы лабораторные общего назначения ВЛР 200,2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г Колбы мерные    2-25-2

(ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) ГОСТ 1770-7,

(ИСО 1042

Таблица 20 - Бюджет неопределенности измерений, рассчитанный для пробы с содержанием левомицетина в диапазоне измеряемых концентраций 0,2 -1,0 мкг/кг

Источник неопределенности Тип оценки Относительная стандартная неопределенность, % Повторяемость результатов измерений массовой концентрации левомицетина в пробе А U(F.q>) 3,68 Обработка пробы В Ur 0,41 Извлечение А u(Rcc) 0,72 Построение и использование I градуировочной характеристики А Ur* __ M Суммарная стандартная неопределенность Uc 9.2 Расширенная неопределенность (к*2) и 18,4

* Суммарная стандартная неопределенность вычисляется по формуле: ие = yj^uj

1-5 см³ 0,1-1,0 см³ 0,01-0,10 см³

Цилиндр мерный    100    см³    ГОСТ    1770-71

3.2 Вспомогательные устройства и оборудование Колонка хроматографическая Zorbax SB-C18 размером 2,1 мм х 150 мм, зернение 3,5 мкм Предколонка Zorbax SB-C18 5 мкм, (2,0 мм х 12,5 мм)

Пробирки полипропиленовые вместимостью 15 и 50 см¹ с завинчивающимися крышками Центрифуга лабораторная охлаждаемая 3-18К Электровстряхиватель вортексного типа Multi Reax Электровстряхиватсль вортексного типа Reax Control Ультразвуковая баня Sonorex super RK 103Н Вакуумное устройство для твердофазной экстракции

Мембранный вакуумный насос N 022 АТ. 18

Картриджи для твердофазной экстракции

«SampliQ ОРТ» Зсм³,60 мг

Система очистки воды Easy pure II RF/UV; D7035

Испаритель аналитический Zipvap 20

Виалы для автосамплера вместимостью 2 см¹

с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками

Измельчитель

Шприцевой мембранный фильтр Chromafii RC-20/15 MS с размером пор 0,2 мкм диаметром 15 мм Шприц инъекционный однократного применения 2А Кондиционер

Компьютер HP xw 4600 Workstation с установленным программным обеспечением Mass Hunter Установка компрессорная CB4-16.GMS150K Холодильник с морозильной камерой

Система для фильтрования и дегазации элюента

Мембранные фильтры из регенерированной целлюлозы с размером пор 0,45 мкм диаметром 47 мм Колба плоскодонная    200    см³

Ступка фарфоровая

3.3 Реактивы и материалы

Левомицетин, содержание основного вещества >99,8 %

Левомицетин-dj. содержание основного вещества > 99,8 %

Ацетонитрил для ВЭЖХ, > 99,9 %

Эти л ацетат для ВЭЖХ, > 99,5 %

Метанол для ВЭЖХ, > 99,9 % н-Гексан для ВЭЖХ, > 99,9 %

Аммоний сернокислый, х. ч.

Вода дистиллированная

Могут быть использованы другие средства измерения и вспомогательные устройства по точности, не уступающие рекомендуемым, а также реактивы не ниже указанной чистоты.

4    Метод измерения

Метод основан на экстракции левомицетина этил ацетатом, отгонке растворителя, растворении остатка в дистиллированной воде, обезжиривании раствора с помощью гексана, очистке экстракта и концентрировании аналита при помощи твердофазной экстракции и количественном анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

5    Требования безопасности

При выполнении работ персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

-    электробезопасности (ГОСТ 12.2.003)

-    пожарной безопасности (ГОСТ 12.1.004)

-    техники безопасности при работе в химической лаборатории (ППБ 1.04)

-    техники безопасности, изложенные в эксплуатационных документах на оборудование, применяемые при проведении измерений.

Помещение, в котором проводится определение антибиотиков, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и подводкой воды. Работу с растворителями следует проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки).

6    Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений могут быть допущены лица, имеющие высшее образование, изучившие настоящую методику, прошедшие подготовку для работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором.

7    Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории согласно ГОСТ 15150 должны быть соблюдены следующие условия:

- температура воздуха при приготовлении растворов, в том числе градуировочных (20 ± 2) °С;

-    температура воздуха при выполнении измерений (20 ± 5) °С;

-    атмосферное давление (630 - 800) мм рт. ст.;

-    влажность воздуха (65 ± 15) % при температуре 25 °С;

-    напряжение питающей сети (230 ± 10) В;

-    частота переменного тока (50 ± 0,4) Гц

Помещения для проведения измерений должны быть оснащены приточно-вытяжной вентиляцией и подводкой воды.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе с масс-сиектромстрическим детектором проводятся в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и настоящей методикой.

8 Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб к анализу.

8.1    Подготовка измерительной аппаратуры

Включают хроматограф согласно инструкции по эксплуатации. Устанавливают рабочие режимы для колонки и детектора. Проводят стабилизацию работы хроматографа на рабочих режимах в течение 40 - 60 мин. Стабилизацию работы детектора после отключения электропитания проводят в течение 1 суток.

8.2    Приготовление растворов

8.2.1 Приготовление 4 Мраствора сульфата аммония В коническую колбу вместимостью 200 см³ взвешивают (52,84±0,01)у приливают 71,3 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного рас Раствор хранится в колбе с пробкой при комнатной температуре в тсч\|

8.2.2    Приготовление смеси ацетонитрил - вода (30:70)

К 70 см³ деионизованной воды приливают 30 см³ ацетонитрила и тщательно перемешивают.

Смесь хранится в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре в течение 12 мес.

8.2.3    Приготовление градуировочных растворов

8.2.3.1    Приготовление    основного    стандартного    раствора    левомицетина

концентрацией 100,0 мкг/см³ (раствор А)

На аналитических весах взвешивают навеску стандарта левомицетина эквивалентную (0,010±0,0003) г чистого вещества и переносят в мерную колбу вместимостью 100 см*. Добавляют 80 см* метанола, перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 1 минуту, затем доводят объем полученного раствор до метки метанолом и перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при температуре (-20 ± 2)°С в течение 1 года.

8.2.3.2    Приготовление    основного    стандартного    раствора    левомицетина

концентрацией 1,0 мкг/см³ (раствор Б)

1 см³ основного стандартного раствора левомицетина массовой концентрацией 100 мкг/см³ (раствор А), приготовленного по 8.2.3.1, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят обьем до метки метанолом и тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при температуре (-20 ± 2)°С в течение 1 года.

8.2.3.3    Приготовление рабочего стандартного раствора левомицетина концентрацией

10.0    нг/см³ (раствор В)

1 см³ основного стандартного раствора левомицетина массовой концентрацией 1,0 мкг/см³ (раствор Б), приготовленного по 8.2.3.2, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем до метки метанолом и тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при температуре (-20 ± 2)°С в течение 1 месяца.

8.2.3.4    Приготовление рабочего стандартного раствора левомицетина концентрацией

2.0    нг/см³ (раствор Г)

5 см³ основного стандартного раствора левомицетина массовой концентрацией 10,0 мкг/см³ (раствор В), приготовленного по 8.2.3.3, переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводят объем до метки метанолом и тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при температуре (-20 ± 2)°С в течение 1 месяца.

8.2.3.5    Приготовление основного стандартного раствора внутреннего стандарта левомицетина-ds концентрацией 10,0 мкг/см³ (раствор Д)

1 мг внутреннего стандарта левомицетина-ds количественно псренс вместимостью 100 см*. Добавляют в колбу 80 см* метанола, перемети

ультразвуковую баню на 1 минуту, доводят объем полученного раствора до метки метанолом и перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при температуре (-20 ± 2)°С в течение 1 года.

8.2.3.6    Приготовление основного стандартного раствора внутреннего стандарта левомицетина-ds концентрацией 100,0 нг/см³ (раствор Е)

1 см³ основного стандартного раствора внутреннего стандарта левомицстина-б5 массовой концентрацией 10,0 мкг/см³ (раствор Д), приготовленного по 8.2.3.5, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем до метки метанолом и тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при температуре (-20 ± 2)°С в течение 1 месяца.

8.2.3.7    Приготовление рабочего стандартного раствора внутреннего стандарта левомицетина-ds концентрацией 10,0 нг/см³ (раствор Ж)

2,5 см³ основного стандартного раствора внутреннего стандарта левомицетина-б5 массовой концентрацией 100,0 нг/см³ (раствор Е), приготовленного по 8.2.3.6, переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводят объем до метки метанолом и тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при температуре - 20 °С в течение 1 месяца.

8.2.3.8    Приготовление градуировочных растворов левомицетина

Готовят 2 серии градуировочных растворов левомицетина концентрацией 0,1 нг/см³, 0,2 нг/см³, 0,4 нг/см³, 0,8 нг/см³, 1,0 нг/см³, содержащие по 1,0 нг/см³ внутреннего стандарта левомицетина-б5 каждый. Схема приготовления представлена в таблице 2. Для этого в виапы для автосамплера вместимостью 2 см³ последовательно приливают необходимое количество смеси ацетонитрил - вода, приготовленной по п.8.2.2 и рабочих стандартных растворов левомицетина и левомицетина-<15. Содержимое виал тщательно перемешивают.

Таблица 2 - Схема приготовления градуировочных растворов левомицетина

Концентрация левомицетина (нг/см3) V (смеси ацетонитрил - вода (30:70)), мкл V (рабочего, ст-ного р-ра левомицетина), мкл V (р-ра внутр. ст-та левомицетина-ч!5), мкл 0,1 850 50 (раствор Г) 100 (раствор Ж) 0.2 800 100 (раствор Г) 100 (раствор Ж) 0,4 860 40 (раствор В) 100 (раствор Ж) 0.8 820 80 (раствор В) 100 (раствор Ж) 1.0 800 100 (раствор В) 100 (раствор Ж)

Растворы готовят непосредственно перед применением. Хранению не подлежат.

8.3 Установление градуировочной характеристики Полученные по п. 8.2.3.8 растворы хроматшрафируют, начин концентрации. При этом должны соблюдаться нижеследующие условия X]

8.3.2 Параметры настройки масс-спектрометрического детектора

Напряжение на капилляре    4000 В

Температура газа десольвации    350 °С

Скорость потока 1лза десольвации    600 дм³/час

Давление на небулайзере (распылителе)    45 psi

В таблице 3 представлены параметры воздействия на ионы левомицетина в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).

Таблица 3 - Параметры воздействия на ионы левомицетина в режиме MRM с регистрацией отрицательных ионов (-)

Аналит Родительский ион. m/z Дочерние ионы, m/z Напряжение на фрагменторе, В Энергия диссоциации, эВ Левомицетин 321 (-) 152/257 120 5/0 Левомицетин - dj 326 (-) 157 120 5

Количественные измерения проводятся по одному, наиболее интенсивному, дочернему иону (m/z 152), а по соотношению откликов дочерних ионов (m/z 152 к m/z 257) подтверждается достоверность определения, так как эта величина является постоянной.

8.4 Построение градуировочных графиков

Для левомицетина при помощи про1раммного обеспечения Agilent Massllunter строят

(радуировочный график, устанавливая зависимость относительной площади пика

анализируемого вещества, деленная на площадь пика внутреннего стандарта) от ] относительной концентрации (концентрация анализируемого вещества!!

концентрацию внутреннего стандарта). По полученным данным рассчитывают коэффициент регрессии b прямой у = Ьх методом наименьших квадратов.

Градуировочный график строится с учетом вычисленных значений уравнения

У = bx,    (1)

где у- отношение площади пика левомицетина к площади пика внутреннего стандарта;

х- отношение концентрации левомицетина в градуировочном растворе к концентрации внутреннего стандарта;

Ь- коэффициент регрессии.

8.5    Контроль градуировочного графика

Построение градуировочного графика осуществляется каждый раз перед началом измерений. Контроль стабильности градуировочного графика осуществляется в конце измерений по любой точке градуировочного графика, исключая первую и последнюю концентрации градуировочных растворов. Расхождение между измеренной концентрацией антибиотика в выбранном градуировочном растворе и его фактической концентрацией, выраженное в процентах, не должно превышать норматива контроля Kq, ■ 8,3 %.

В противном случае необходимо провести построение нового градуировочного графика.

8.6    Подготовка анализируемых образцов

Отбирают не менее 1 кг средней пробы пищевого продукта или продовольственного сырья в соответствии с требованиями СТБ 1036-97 «Продукты пищевые и продовольственное сырье. Методы отбора проб для определения показателей безопасности».

Отобранные пробы хранят в холодильнике при (-18 - +8)°С.

Усредненную пробу образца предварительно термостатируют при температуре (20 ± 5) °С.

8.7 Проведение пробоподготовки для анализа на содержание левомицетина жидких, пастообразных продуктов (молоко, йогурт, сметана и т.д.) и продуктов с высоким содержанием жира (масло, спред и т.д.)

К 1,000*0,001 г жидкого или пастообразного пищевого продукта, взвешенного в полипропиленовой пробирке вместимостью 50 см³, вносят 100 мкл внутреннего стандарта (левомицетин-<15) концентрацией 10 нг/см³ (раствор Ж, полученный по п.8.2.3.7). В пробирку приливают 5 см³ 4 М раствора сульфата аммония, тщательно перемешивают, затем добавляют 15 см³ этилацетата и помещают на 10 минут на электровстряхиватель для экстракции. Далее пробу центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут при температуре (5 ± 2) °С. После центрифугирования отбирают этилацетатный слой и переносят его в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³. Этилацетатный экстракт упаривают на токе воздуха при (50 ± 2) °С до удаления органического растворителя. К дистиллированной воды и 5 см³ гексана, встряхивают в течение 5

1

Оценивание относительной стандартной неопределенности (ОСН), обусловленной

2

случайными факторами