СОГЛАСОВАНО

УТВЕРЖДАЮ

---

Методика выполнения измерений содержания хлорамфсникола (левомицетина) в продукции животною происхождения с использованием тест-систем RTDASCREEN®Chloramphenicol и ПРОДОСКРИ11®Хлорамфеннкол

МВИ.МН 2436-2015

(взамен МВИ.МН 2436-2013)

.../йнкгииое унитарное предприятие _; ...ни ;:судзрс^енный институт метрологии» (БелГИМ)

ев !ЙВИ от    г.

МИНСК 2015

СОДЕРЖАНИЕ

1    Область применения.......................................................................................3

2    Точность измерений........................................................................................3

3    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы...............................................................................................5

3.1    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы..................................................................................................................5

3.2    Реактивы...........................................................................................................7

4    Метод измерений.............................................................................................8

5    Требования безопасности и требования к квалификации операторов........9

5.1    Общие требования безопасности.......................................................................9

5.2    Требования безопасности при работе с метанолом...........................................9

5.3    Требования к квалификации операторов...........................................................9

6    Условия выполнения измерений....................................................................9

7    Условия инкубации микротнтровальных планшетов в помещении............9

8    Условия хранения тест-систем.....................................................................10

9    Подютовка к выполнению измерений.........................................................10

9.1    Отбор образцов...............................................................................................10

9.2    Подготовка лабораторной посуды...................................................................10

9.3    Приготовление растворов ...............................................................................10

9.4    Подготовка тест-систем..................................................................................12

9.5    Подготовка проб.............................................................................................14

10    Выполнение измерений.................................................................................23

11    Обработка результатов измерения...............................................................24

11.1    Расчет массовой концентрации.......................................................................24

11.2    Определение массовой концентрации хлорамфеникола при получении

результатов измерений больше значения, соответствующего верхней границе диапазона градуировки.............................................................................................26

12    Контроль холостой пробы.............................................................................26

13    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

повторяемости........................................................................................................27

14    Оформление результатов измерений...........................................................27

14.1    Форма представления результатов измерения с использованием расширенной

неопределенности.....................................................................................................27

14.2    Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой

концентрации хлорамфеникола с использованием предела измерения.....................28

14.3    Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой

концентрации хлорамфеникола с использованием значения верхней границы диапазона измерений................................................................................................28

15    Контроль точности результатов измерений................................................28

15.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости.28

15.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

промежуточной прецизионности..............................................................................28

15.3    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

воспроизводимости..................................................................................................29

15.4    Контроль правильности..................................................................................30

15.5    Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных

карт Шухарта (КК)...................................................................................................31

16    Нормативные ссылки....................................................................................33

Библиография.........................................................................................................34

2

метанола и его растворов.

9.3.2    Приготовление раствора метанола (2:8 по объему)

В    коническую колбу вместимостью 500 см³ приливают 200 см³

дистиллированной воды, отмеренные цилиндром, затем приливают отмеренные цилиндром 50 см³ метанола и перемешивают. Хранят раствор при комнатной температуре (от плюс 20 °С до плюс 25 °С) в плотно закрытой посуде из темного стекла не более одного месяца в соответствии с установленными правилами хранения метанола и его растворов.

9.3.3    Приготовление реактива Карреза I с молярной концентрацией

[/ч>(С7У)_б^ 0,36 моль/дм³

В    стакан вместимостью 100 cm^j вносят навеску 7,6 г    калия

железистосиперодистого 3-водного, взвешенного с точностью до 0,1 г, затем добавляют 26 см³ - 36 см³ дистиллированной воды. После растворения навески раствор из стакана количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят объем до метки дистиллированной водой. Полученный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 7 дней.

9.3.4    Приготовление реактива Карреза II с молярной концентрацией ZnSO_t

1,04 моль/дм³

В стакан вместимостью 100 см³ вносят навеску 15,0 г цинка сернокислого 7-водиого, взвешенную с точностью до 0,1 г, затем добавляют 26 см³ - 36 cm^j дистиллированной воды. После растворения навески раствор из стакана количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят объем до метки дистиллированной водой. Полученный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 7 дней.

9.3.5    Приготовление 30 % раствора гидроокиси натрия

Навеску гидроокиси натрия массой 15,0 г, взвешенную с точностью до 0,1 г, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³. В колбу приливают 35 см³ дистиллированной воды, отмеренной цилиндром. После растворения гидроокиси натрия раствор охлаждают до комнатной температуры (от плюс 20 °С до плюс 25 °С).

После приготовления раствора его переносят в полиэтиленовую или фторопластовую посуду и хранят при комнатной температуре (от плюс 20 °С до плюс 25 ^СС) не более трех месяцев.

9.3.6    Приготовление 20 мМ фосфатного буфера

Навески натрия фосфата одноосновного моногидрата массой 0,55 г (или натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного массой 0,62 г), натрия фосфата двуосновного дигидрата массой 2,85 г (или натрия фосфорнокислого двузамещениого 12-водного массой 5,73 г), хлористого натрия массой 9,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы колба заполнилась примерно до половины своей вместимости, перемешивают до полного растворения и доводят до метки дистиллированной водой. После приготовления раствора его переносят в стакан вместимостью 1000 см³ и доводят pH раствора до 7,4, добавляя по каплям 30 % раствор гидроокиси натрия, приготовленный по и. 9.3.5. pH раствора проверяют с помощью

п

рИ-метра. Раствор храпят при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С пе более одного месяца.

9.4 Подготовка тест-систем

9.4.1    Предварительная подготовка и правила обращения с тест-системами

Тест-систему извлекают из холодильника, не открывая упаковку микротигровального планшета, выдерживают при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С от 0,5 до 1 ч, доводят температуру остальных реагентов от плюс 20 °С до плюс 25 °С.

Растворы из тест-системы следует готовить непосредственно перед проведением ИФА. Перед использованием реагенты необходимо аккуратно перемешать круговыми движениями флаконов.

Замена отдельных реагентов на реагенты из тест-систем других партий не допускается.

Нс допускается использование реагентов, имеющих следующие признаки распада:

•    голубая окраска раствора субстрата/хромогена (хромогена) до внесения его в лунки;

•    оптическая плотность градуировочного раствора № 1 с концентрацией 0,0 мкг/дм³ меньше 0,6.

9.4.2    Подготовка микротитровальпого планшета

Количество лунок микротитровального планшета, необходимых для проведения измерений А_и., рассчитывается по формуле

^=12 + 2^, (1)

где N_SMI, - количество образцов;

12 - количество лунок для градуировочных растворов.

Микротитровальный планшет со стрипами, предварительно подготовленными в соответствии с п. 9.4.1, вынимают из упаковки. В микротитровальный планшет помещают необходимое количество стрипов, рассчитанное исходя из требуемого для проведения измерений количества лунок N_w. Оставшиеся стрипы сразу же помещают в упаковку, закрывают и хранят в соответствии с разделом 8.

Размечают положения лунок, предназначенные для градуировочных растворов и растворов проб, согласно рисунку 1.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

С-1

С-1

п-з

Г1-3

П-11

П-11

Б

С-2

С-2

П-4

П-4

П-12

Г1-12

С

С-3

С-3

П-5

П-5

П-13

П-13

D

С-4

С-4

11-6

П-6

П-14

П-14

Е

С-5

С-5

П-7

П-7

П-15

П-15

F

С-6

С-6

П-8

П-8

П-16

П-16

G

П-1

П-1

П-9

П-9

П-17

П-17

II

П-2

П-2

П-10

П-10

11-18

П-18

Рисунок 1 - Схема расположения лунок для градуировочных растворов и растворов проб

12

где    С -1, С -2, ... С -6 - градуировочные растворы,

П -1, /7-2, ... Я -18 - исследуемые пробы,

1,2,3.... 12 - номера стрипов в планшете,

А, В, ... Н - обозначения лунок в стрипах.

При необходимости одновременно использовать более 6-ти стрипов рекомендуется выполнять анализ в несколько этапов.

9.4.3    Приготовление моющего буфера

При использовании тест-систем Ridascreen ® Chloramphenicol в зависимости от планируемого срока использования моющий буфер го товят двумя приведенными ниже способами.

•    Способ    1.    Содержимое    пакета для    приготовления    моющего    буфера

количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³. Добавляют небольшое количество дистиллированной поды, содержимое колбы перемешивают до полного растворения осадка, после чего доводят до метки дистиллированной водой. Полученный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 6-ти недель в стеклянной или полиэтиленовой посуде.

•    Способ    2.    Содержимое    пакета для    приготовления    моющего    буфера

количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³. Добавляют 50 - 60 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения осадка и доводят до метки дистиллированной водой. Полученный концентрированный раствор (10-кратное концентрирование) хранят при температуре от плюс 20°С до плюс 25 °С не более 12 недель. Для приготовления готового раствора моющего буфера 10 см³ концентрата переносят в мерную колбу вмест имостью 100 cm^j и доводят до метки дистиллированной водой.

При использовании тест-систем 11РОДОСКРИП®Хлорамфеникол моющий

буфер готовят следующим образом. Содержимое флакона с концентратом моющего буфера интенсивно встряхивают в течение (10-20) с, в случае образования кристаллов - подогревают на водяной бане при температуре 50 °С. Отмеренный мерным цилиндром необходимый объем концентрата наливают в стакан вместимостью 1000 см\ после чего в ст акан наливают в 9 раз больший объем дистиллированной воды и перемешивают. Полученный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более месяца в стеклянной или полиэтиленовой посуде.

9.4.4    Приготовление рабочего раствора конъюгата

Концентрат конъюгата подготавливают но п. 9.4.1 и перемешивают непосредственно перед приготовлением рабочего раствора конъюгата.

В пробирку вместимостью 5 см³ добавляют отмеренные дозатором буфер для разбавления концентрата конъюгата и растворов проб объемом V₆, мм³, и аликвоту концентрата конъюгата хлорамфешгкола объемом V_a, мм³. Содержимое пробирки тщательно перемешивают круговыми движениями, не допуская образования пепьъ Концентрат конъюгата сразу же убирают в холодильник и хранят в соответствии с п. 8.

Требуемый объем концентрата конъюгата и буфера для разбавления рассчитывают но формулам

V_a=5-N„+0,l-A V, = 10-F

13

где N_H. - количество лунок, используемых в анализе, определяется согласно п. 9.4.2;

А - объем рабочего раствора конъюгата, приготавливаемого в запас, mm^j (не менее 200 мм³).

Примечание; рабочий раствор конъюгата готовится не более чем за 15 мин до выполнения ИФА.

9.4.5 Приготовление раствора субстрата/хромогсна (только при использовании тест-систем ПРОДОСКРИН®Хлорамфсникол)

Раствор субстрата/хромогепа готовят непосредственно перед выполнением ИФА из растворов субстрата и хромогена, подготовленных по п. 9.4.1. Посуда, используемая при приготовлении раствора субстрата/хромогена, моется без применения синтетических моющих средс тв.

В чистый флакон из темной пластмассы или стекла вместимостью 20 см"' приливают необходимое количество субстрата, отмеренного дозатором, и добавляют в 20 раз меньшее по объему количество раствора хромогена, интенсивно перемешивают в течение (30-40) с. Приготовленный раствор необходимо предохраня ть от действия света. Приготовленный раствор храпению не подлежит.

Объем используемой аликвоты V, см³, раствора хромогена рассчитывается на основании количества используемых в анализе лунок микротитровальпого планшета N_w. по формуле

0.1- А„„ + V,

21

где \\ - объем раствора субстрата/хромо! ена, приготавливаемого в запас, см' (не менее 0,1 см³).

9.5 Подготовки проб

9.5.1 Подготовка проб яиц, яичного порошка

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

Образец яичного порошка перемешивают и восстанавливают в соответствии с п. 5.2.2 ГОС Г 30364.0. Перед отбором навесок восстановленный яичный порошок тщательно перемешивают. Яйца освобождают от скорлупы и гомогенизируют с помощью гомогенизатора или блендера.

От гомогенизированного образца яиц или восстановленного яичного порошка отбирают две параллельные навески массой 2,00 г, взвешенные с точностью до 0.01 г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³. В каждую пробирку добавляют отмеренные дозатором 12 см³ этилацетата. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на шейкере или при переворачивании на рота торе в течение 10 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 3000 g, в течение 10 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором надое ад очную жидкость (этилацетат) объемом 6 см³, и переносят ее в стеклянные пробирки вместимостью 10 см³.

14

Выпаривают этилацетат из пробирок в слабом токе азота при температуре до 60 °С до отсутствия запаха этилацстата.

К сухому остатку в пробирках добавляют отмеренный дозатором и-гсксан объемом 1 см³, перемешивают содержимое пробирок на вортексе в течение 1 мин. Далее в пробирки добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления проб объемом 1 см"* и перемешивают на вортексе в течение 1 мин, после чего содержимое переливают в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³.

Центрифугируют пробы в следующем режиме: от 20 °С до 25 °С, 3000 g, 10 мин.

После центрифугирования из пробирок удаляют дозатором верхний органический слой.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных растворов проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

9.5,2 Подготовка проб мяса, готовых к употреблению мясных продуктов

Доводят температуру образца, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. С готовых к употреблению мясных продуктов удаляют оболочку и поверхностный слой. Образцы гомогенизируют с помощью гомогенизатора или блендера.

От гомогенизированного образца отбирают две параллельные навески массой 3,00 г, взвешенные с точностью до 0,01г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные дозатором 3 см³ дистиллированной воды и 6 см³ этилацегата. Содержимое пробирок интенсивно перемешиваю г на шейкере или при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 3000 g, в течение 10 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором надосадочпую жидкость (этилацетат) объемом 4 см^-5, и переносят ее в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³.

Выпаривают этилацетат из пробирок в слабом токе азота при температуре до 60 °С до отсутствия запаха этилацстата.

ТС сухому остатку в пробирках добавляют отмеренный дозатором н-гексан объемом 1 см³, перемешивают содержимое пробирок на вортексе в течение 1 мин. Далее в пробирки добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления проб объемом 0,5 см³ и перемешивают на вортексе в течение 1 мин, после чего содержимое переливают в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³.

Центрифугируют пробы в следующем режиме: от 20 °С до 25 °С, 3000 g, 10 мин.

После центрифугирования из пробирок удаляют дозатором верхний органический слой.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных растворов проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

15

9.5.3    Подготовка проб рыбы, креветок, продуктов из рыбы, жиров животных,

шпика, субпродуктов, консервов мясных и мясораститсльных (только при

использовании тест-систем ПРОДОСКРИН®Хлорамфеннкол)

Подготовку проб рыбы, креветок, продуктов из рыбы, жиров животных, шпика, субпродуктов, консервов мясных и мясорастительных проводят по п. 9.5.2.

9.5.4    Подготовка проб сыра

Доводят температуру образца сыра, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. Отделяют гесто от корки, полимерно-парафинового или воскового сплава, измельчают тесто с помощью терки и перемешивают.

От измельченного образца сыра отбирают две параллельные навески массой 15,0 г, взвешенные с точностью до 0,1 г. Навески помещают в стаканы вместимостью 150 см³ или в контейнеры, входящие в комплект миксера. К навескам сыра добавляют отмеренные пипеткой 30 см³ раствора метанола (1:9 по объему), приготовленного по п. 9.3.1. Смесь гомогенизируют с помощью лабораторного миксера, не допуская ее разбрьшттания.

Переносят гомогенизированную смесь в пробирку для центрифугирования вместимостью 50 см³ и выдерживают ее на водяной бане при температуре от 40 °С до 45 °С в течение 10 мин. За это время смесь перемешивают три раза, энергично встряхивая пробирку.

Пробирки помещают на лед и, выдерживают в течение 15 мин. После этого проводят центрифугирование при температуре 4 °С, 3000 g, в течение 15 мин.

Переносят дозатором 4,8 см³ водного слоя в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³, добавляют отмеренные дозатором 8 см³ этилацетата и интенсивно перемешивают на шейкере или при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин.

Центрифугируют пробирки при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 3000 g, в течение 10 мин.

Отбирают дозатором 4 см³ органического слоя . (этилацетат) и переносят в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³.

Выпаривают этилацетат из пробирок в слабом токе азота при температуре до 60 °С до отсутствия запаха этилацетата.

К сухому остатку в пробирках добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления проб объемом 1 см³ и перемешивают на вортексе в течение 1 мин.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных растворов проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

9.5.5    Подготовка проб масла

Образец масла, отобранный в соответствии с п. 9.1, охлажденный до температуры не выше минус 10 °С, измельчают с помощью терки и перемешивают. Доводят температуру образца масла от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

От образца масла отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г, и помещают их в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. Выдерживают пробирки на водяной бане при температуре

16

40 °C ± 5 °C до полного расплавления навески масла.

Сразу же после расплавления масла в пробирки с пробами добавляют 1 см³ гексана, отмеренного дозатором, и интенсивно перемешивают на вортексе в течение 20 с. Добавляют в пробирки отмеренный дозатором 1 cm^j раствора метанола (2:8 по объему), приготовленного по п. 9.3.2. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на вортексе в течение 20 с, после чего продолжают перемешивание на шейкере или при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин.

Центрифугируют пробирки при 4 °С, 2000 g, в течение 10 мин. Осторожно удаляют верхний гексановый слой с помощью пипетки Пастера.

В пробирки с пробами снова добавляют 1 см³ гексана, отмеренного дозатором, и интенсивно перемешивают на вортексе в течение 20 с. Повторяют центрифугирование при 4 °С, 2000 g, в течение 10 мин, после чего осторожно удаляют верхний гексановый слой пипеткой Пастера.

700 мм'⁵ водного слоя переносят дозатором в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³. Пробирки помещают на лед и выдерживают в течение 10 мин. После этого проводят центрифугирование при температуре от 20 °С до 25 °С, 20000 g, в течение 5 мин. При отсутствии центрифуги, обеспечивающей вышеуказанный режим, вместо центрифугирования проводят фильтрование через ттшриц-фильтр.

Отбирают дозатором 200 мм³ водной фазы и переносят в стеклянную пробирку вместимостью 5 см³. Затем в пробирку дозатором добавляют 700 мм³ буфера для разбавления проб и тщательно перемешивают содержимое пробирок на вортексе.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных растворов проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

9.5.6 Подготовка проб молока, восстановленных сухих молочных смесей для

детского шп анки (метод экстракции)

9.5.6.1 Восстановление сухого молока, сухих молочных смесей для детского питания

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с и. 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

В стаканы вместимостью 100 см³ или 150 см³ помещают 2 параллельные навески образца сухого молока, взвешенные с точностью до 0,1 г. Массы навесок в зависимости от содержания жира составляют:

•    9,0 г сухого обезжиренного молока;

• 12,0 г сухого молока с содержанием жира 20 %;

• 12,5 г сухого молока с содержанием жира 25 %;

•    10,0    г    сухого    молока    с    содержанием    жира,    отличным    от    перечисленного

выше.

Затем в стаканы с навесками порциями по 5-10 см³ приливают дистиллированную воду, перемешивая содержимое стеклянной палочкой до полного растворения образца. После растворения сухого молока растворы из стаканов количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Восстановление проб сухих молочных смесей для детского питания производят

17

по приведенной выше схеме, используя отношение массы смеси к объему воды, указанное в инструкции производителя.

9.5.6,2 Получение подготовленных проб сырого, пастеризованного, стерилизованного и восстановленного сухого молока, восстановленных сухих молочных смесей для детского питания

Доводят температуру образца сырого, пастеризованного, стерилизованного молока, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре, после чего образец перемешивают путем встряхивания и переворачивания упаковки. Перед отбором аликвоты образец переносят в коническую колбу вместимостью 100 см³ в таком количестве, чтобы колба заполнилась примерно до половины своей вместимости, и тщательно перемешивают на вортексе.

От образца сырого, пастеризованного, стерилизованного молока, подготовленного, как описано выше, или восстановленных согласно н. 9.5.6.1 сухого молока или сухих молочных смесей для детского питания с помощью дозатора отбирают две параллельные пробы объемом 10 см³ и помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. В пробирки добавляют отобранные дозатором 500 мм" реактива Карреза I, приготовленного по п. 9.3.3 и тщательно перемешивают содержимое пробирок. Далее, в пробирки добавляют отобранные дозатором 500 мм³ реактива Карреза И, приготовленного по п. 9.3.4, перемешивают на вортексе в течение 1 мин и центрифугируют в следующем режиме: 4 °С, 3000 g, 10 мин.

При отсутствии центрифуги с охлаждением пробы перед центрифугированием выдерживают в морозильной камере холодильника в течение 10-15 мин, охлаждая пробы молока до температуры от плюс 2 °С до плюс 4 °С, контролируя температуру •гермометром.

Дозатором переносят 4,4 см³ надосадочного слоя в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³ и добавляют отмеренные дозатором или пипеткой 8 см³ этилацетата. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на шейкере или при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 3000 g, в течение 10 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором надосадочную жидкость (этилацетат) объемом 4 см³, и переносят ее в стеклянные пробирки

3    3

вместимостью 5 см или 10 см .

Выпаривают этилацетат из пробирок в слабом токе азота при температуре до 60 °С до отсутствия запаха этилацетата.

К сухому остатку в пробирках добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления проб объемом 400 мм³ и перемешивают на вортексе в течение 1 мин.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных растворов проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

18

9.5.6.3 Получение подготовленных проб сгущенного молока

Доводят температуру образца, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

От образца отбирают две параллельные навески массой 5,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. В пробирки добавляют отобранные дозатором 5 см³ дистиллированной воды и перемешивают до образования однородной смеси.

Затем в пробирки добавляют отобранные дозатором 500 мм³ реактива Карреза I, приготовленного по и. 9.3.3 и тщательно перемешивают содержимое пробирок. Далее в пробирки добавляют отобранные дозатором 500 мм'’ реактива Карреза II, приготовленного но п. 9.3.4, перемешивают на вортексе в течение 1 мин и центрифугируют в следующем режиме: 4 °С, 3000 g, 10 мин.

При отсутствии центрифуги с охлаждением пробы перед центрифугированием выдерживают в морозильной камере холодильника в течение 10-15 мин, охлаждая пробы до температуры от плюс 2 °С до плюс 4 °С, контролируя температуру термометром.

Дозатором переносят 4 см³ надосадочного слоя в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 cm^j и добавляют отмеренные дозатором или пипеткой 8 см³ этилацетата. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на шейкере или при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 3000 g. в течение 10 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором надосадочную жидкость (этилацетат) объемом 4 см³, и переносят ее в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³.

Выпаривают этилацетат из пробирок в слабом токе азота при температуре до 60 °С до отсутствия запаха этилацетата.

К сухому остатку в пробирках добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления проб объемом 400 мм³ и перемешивают на вортексе в течение 1 мин.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается храпение подготовленных растворов проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

9.5.7 Подготовка проб молока, восстановленных сухих молочных смесей для

детского питания (прямой метод, только при использовании тест-систем

Г1РОДОСКРИН®Хлорамфеникол)

Доводят температуру образца сырого, пастеризованного, стерилизованного молока, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре, после чего образец перемешивают путем встряхивания и переворачивания упаковки. Перед отбором аликвоты образец переносят в коническую колбу вместимостью 100 см³ в таком количестве, чтобы колба заполнилась примерно до половины своей вместимости, и тщательно перемешивают на вортексе.

От образца сырого, стерилизованного, пастеризованного молока, подготовленного, как описано выше или восстановленного сухого молока, восстановленных сухих молочных смесей для детского питания, приготовленных по

19

n. 9.5.6.1, с помощью дозатора отбирают две параллельные пробы объемом 10 см³ и помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. Центрифугируют пробы в следующем режиме: 10 °С, 3000 g, 10 мин.

При отсутствии центрифуги с охлаждением пробы перед центрифугированием выдерживают в морозильной камере холодильника в течение 10-15 мин, охлаждая их до температуры от плюс 2 °С до плюс 4 °С, контролируя температуру термометром.

Шпателем или пипеткой Пастера удаляют верхний жировой слой, образовавшийся на поверхности после центрифугирования.

Отбирают по 2 см³ обезжиренной пробы из каждой пробирки и переносят в чистые пробирки (перед тем как вылить молоко в пробирку, наконечник пи пег-дозатора вытирают фильтровальной бумагой для удаления следов жира). При необходимости пробы хранят в соответствии с н. 9.1.

Для обезжиренного молока описанную выше процедуру по удалению жира не производят.

9.5.8    Подготовка проб мороженого, коктейлей молочных (только при

использовании тест-систем ПРОДОСКРИН®Хлорамфеникол)

Для подготовки проб используют образцы, отобранные в соответствии с п. 9.1. От образца предварительно отделяют твердые немолочные компоненты и отбрасывают. Температуру образца доводят от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. Образцы коктейлей молочных перемешивают путем встряхивания и переворачивания упаковки.

От образца, подготовленного как описано выше, отбирают две параллельные навески массой 10,0 г и далее проводят подготовку проб согласно и. 9.5.6.2.

9.5.9    Подготовка проб йогурта и других кисломолочных продуктов, молочной

сыворотки, восстановленной сухой молочной сыворотки

9.5.9.1    Восстановление сухой молочной сыворотки

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

В стаканы вместимостью 100 cm^j или 150 см³ помещают 2 параллельные навески образца массой 6,25 г, взвешенные с точностью до 0,01 г.

Затем в стаканы с навесками порциями по 5-10 см³ приливают дистиллированную воду, перемешивая содержимое стеклянной палочкой до полного растворения образца. После растворения навески растворы из стаканов количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

9.5.9.2    Получение подготовленных проб

Доводят температуру образца йогурта или других кисломолочных продуктов, молочной сыворотки, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре, после чего перемешивают. При наличии в образце йогурта частиц твердой консистенции их огбрасывают

От образца йогурта или других кисломолочных продуктов, молочной сыворотки, подготовленного, как описано выше, или восстановленной согласно и. 9.5.9.1 сухой молочной сыворотки отбирают две параллельные навески массой

20

Область применения

Методика предназначена для проведения измерений массовой концентрации хлорамфеникола (лсвомицетина) в указанной ниже продукции животного происхождения методом конкурентного иммунофермент ного анализа (ИФА) с использованием тест-систем Ridascreen ® Chloramphenicol производства R-Biopharm AG. Г ермания или тест-систем 11РОДОСКРИ1 РХлорамфеникол, производезва Института биоорганической химии ПАП Ьеларуси.

Настоящая методика распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное, сухое восстановленное и сгущенное молоко, восстановленные сухие молочные смеси для детскою низания, творог, сыр (мягкий, полутвердый, твердый, сверхтвердый), масло сливочное, йогурт и другие кисломолочные продукты (сметана, кефир, пахта и тлт), молочную сыворотку, восстановленную сухую молочную сыворотку, мясо (мышцы), готовые к употреблению мясные продукт, яйца, порошок яичный¹, мед при использовании обоих вышеуказанных тест-систем, а также на рыбу, продукты из рыбы, креветки, жиры животные, шпик, субпродукты, консервы мясные и мясорастительные    при    использовании    только    тест-систем

ПРОДОСКРИП^Хлорамфспикол.

Диапазон измерений методики приведен в разделе 2. таблица 1. Предел измерения для дайной методики приведен в разделе 2, таблица 1, как нижняя граница диапазона измерений.

Настоящая методика разработана в соответствии с требованиями ГОСТ 8.010.

2 Точность измерений

Настоящая методика обеспечивает измерение массовой концентрации хлорамфеникола в соответствии с областью применения, приведенной в разделе 1. в диапазоне измерений с показателями точности согласно таблице 1.

Для всех видов продукции в диапазоне измерений методики смещение незначимо.

Значения опенок относительной суммарной стандартной неопределенности и относительной расширенной неопределенности приведены в таблице 2.

Указанные метрологические характеристики получены на основании данных эксперимента, проведенного в соответствии с:

•    показатели прецизионности - СТБ ИСО 5725-2;

•    показатели правильности - [ 1 ];

•    оценки неопределенности - ( 1 ], [ 2 ].

10,0 г, взвешенные с точностью до 0,1 г помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³. В пробирки добавляют отобранные дозатором 8 см³ 20 мМ фосфатного буфера, приготовленного по п. 9.3.6, и перемешивают содержимое.

Затем в пробирки добавляют отобранные дозатором 1 см³ реактива Карреза 1, приготовленного по п. 9.3.3 и тщательно перемешивают содержимое пробирок. Далее в пробирки добавляют отобранные дозатором 1 cm^j реактива Карреза II, приготовленного по п. 9.3.4, перемешивают при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин и центрифугируют в следующем режиме: 10 °С, 4000 g, 10 мин.

При отсутствии центрифуги с охлаждением пробы перед центрифугированием выдерживают в морозильной камере холодильника в течение 10-15 мин, охлаждая их до температуры от плюс 2 °С до плюс 4 °С, контролируя температуру термометром.

Дозатором переносят 4 см³ надосадочного слоя в пробирки для центрифугирования вместимостью 50 cm^j и добавляют отмеренные дозатором или пипеткой 8 см³ этилацетата. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на шейкере или при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 3000 g, в течение 10 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором надосадочную жидкость (этилацетат) объемом 4 cm^j, и переносят ее в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³.

Выпаривают этилацетат из пробирок в слабом токе азота при температуре до 60 °С до отсутствия запаха этилацетата.

К сухому остатку в пробирках добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления проб объемом 400 мм³ и перемешивают на вортексе в течение 1 мин.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных растворов проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

9.5.10 Подготовка проб творога, творожных продуктов

От образца предварительно отделяют твердые пемолочиые компоненты и отбрасывают. Доводят температуру образца, отобранного в соответствии с и. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре, после чего перемешивают.

От образца отбирают две параллельные навески массой 2,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³. В пробирки добавляют отобранные дозатором 16 см³ 20 мМ фосфатного буфера, приготовленного по п. 9.3.6, и 1 см³ реактиза Карреза 1, приготовленного но п. 9.3.3, и тщательно перемешивают содержимое пробирок.

Далее в пробирки добавляют отобранные дозатором 1 см³ реактива Карреза II, приготовленного по п. 9.3.4, перемешивают при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин и центрифугируют в следующем режиме: 4 °С, 3000 g, 15 мин.

Дозатором переносят 4 см³ надосадочного слоя в пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³ и добавляют отмеренные дозатором или пипеткой 8 см³ этилацетата. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на шейкере или при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин, После чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 3000 g, в течение

21

Таблица 1 - Относительные значения показателей повторяемости и промежуточной прецизионности

Виды продукции Диапазон измерений, мкг/кг Относительно е стандартное отклонение повторяемости о-г, % Относительное стандартное отклонение промежуточной прецизионности 0//° При использовании тест-систем Ridascreen Ф С ПРОДОСКРИН'^Хлорамфенит* lloramphenicol и I Сырое, пас теризованное, стерилизованное, сухое восстановленное молоко, восстановленные сухие молочные смеси для детского низания (метод экстракции) от 0,010 до 0,150 включ. 1 4,5 7,4 Сгущенное молоко от 0,020 до 0,300 включ. Йогурт с наполнителями от 0,100 до 0,750 включ. Йогурт без наполнителей и другие кисломолочные продукты, молочная сыворотка, восстановленная сухая молочная сыворотка от 0,020 до 0,750 включ. Творог от 0,100 до 1,500 включ. Масло сливочное’ от 0,130 до 5,025 включ. Сыр от 0,025 до 0,750 включ. Мясо, готовые к употреблению мясные продукты от 0,013 до 0,750 включ. Яйца, яичный порошок от 0,050 до 0,750 включ. Мед от 0,075 до 0,750 включ. 3,1 4,0 При использовании только тест-систем ПРОДОСКР 4Н®Хлорамфеникол Мороженое, коктейли молочные от 0,010 до 0,300 включ. 4,5 7,4 Сырое, пастеризованное, стерилизованное, сухое восстановленное молоко, восстановленные сухие молочные смеси для детского питания (прямой метод) от 0.025 до 0,750 включ. Рыба, продукты из рыбы, крепетки, жиры животные, шпик, субпродукты, консервы мясные и мясорасти тельные от 0,013 до 0,750 включ.

² Нижняя и верхняя границы диапазона измерений для масла сливочного зависят от его жирности и рассчитываются с учетом значения фактора разбавления, указанного в таблица 5, как (0,025хфактор разбавления) мкг/кг, (0,75хфактор разбавления) мкг/кг соответственно. Здесь и далее по тексту указашл минимальное значение предела измерений и максимальное значение верхней границы диапазона измерений

4

Таблица 2 - Оценки неопределенности результатов измерений, выполняемых в соответствии с МВ И

Вилы продукции Диапазон измерений, мкг/кг Относительная суммарная стандартная неопределенность ис, % Относительная расширенная неопределенность и, %, К - 2 95 °А При использовании тест-систем Ridascreen ® С ПРОДОСКРИН®Хлорамфеникоэ iloramphenicol и 1 Сырое, пастеризованное, стерилизованное, сухое восстановленное молоко, восстановленные сухие молочные смеси для детского низания (метод ■экстракции) у\ 0,010 до 3,150 включ. 10 20 Слущеннос молоко от 0,020 до 0,300 включ. Йогурт с наполнителями от 0,100 до 0,750 включ. Йогурт без наполнителей и другие кисломолочные продукты, молочная сыворотка, неостановленная сухая молочная сыворотка от 0,020 до 0,750 включ. Творог от 0,100 до 1,500 включ. Масло сливочное от 0,130 до 5,025 включ. Сыр от 0,025 до 0,750 включ. Мясо, готовые к употреблению мясные продукты от 0,013 до 0,750 включ. Яйца, яичный иорошок от 0,050 до 0,750 включ. Мед от 0,075 до 0,750 включ. 6 12 При использовании только тест-систем ПРОДОСКРИМ®Хлорамфеникол Мороженое, коктейли молочные от 0,010 до 0,300 включ. 10 20 Сырое, пастеризованное, стерилизованное, сухое восстановленное молоко, восстановленные сухие молочные смеси для детского питания (прямой метод) от 0,025 до 0,750 включ. Рыба, продукты из рыбы, креветки, жиры животные, шпик, субпродукты, консервы мясные и мясорастительные от 0,013 до 0,750 включ.

3 Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

3.1 Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, материалы

Весы лабораторные общего назначении по ГОСТ 24104 высокого класса

точности с наибольшим пределом взвешивания не менее 200 г, погрешностью ± 0,01 г.

Автоматический микроплапшетпый фотометр с фильтром на 450 нм (допускаемая погрешность измерения оптической плотности не более ± 5 %).

Программное обеспечение RIDA © SOFT, разработчик R-Biopharm AG, Германия.

Термометр лабораторный частичного погружения класса точности I с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая относительное центробежное ускорение не менее 4000 g (пробирки вместимостью 15 см³, 50 см³) и не менее 20000 g (пробирки вместимостью 2 см³), а также охлаждение до плюс 4 °С.

Система для выпаривания в токе азота, обеспечивающая поддержание температуры 60 °С ± 5 °С. Допускается проводить выпаривание в токе азота на водяной бане, обеспечивающей поддержание температуры 60 °С ± 5 °С.

Баня водяная, обеспечивающая поддержание температуры 40 °С ± 5 °С.

Холодильник бытовой, позволяющий поддерживать температуру от плюс 2 °С до плюс 8 °С в холодильной камере и не выше минус 20 °С в морозильной камере.

Лабораторный вортекс, обеспечивающий скорость вращения не менее 1800 об/мин.

Лабораторный шейкер, обеспечивающий скорость до 200 об/мин.

Лабораторный ротатор, обеспечивающий скорость вращения до 60 об/мин.

Гомогенизатор лабораторный или бытовой блендер.

Лабораторный миксер, обеспечивающий скорость от 100 об/мин до 1200 об/мин, например IKA RW16 basic, производства IKA® Werke GmbH & Со. ICG, (Германия). Допускается использовать бытовой погружной блендер с плавной регулировкой скорости или миксер со скоростью насадки в диапазоне от 200 об/мин до 2000 об/мин.

Дозаторы пипеточные с комплектом одноразовых наконечников:

•    с диапазоном объемов дозирования от 20 мм³ до 200 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ±3,0 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 100 мм³ до 1000 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ±1,5 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 1 см³ до 5 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,5 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 2 см³ до 10 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,0 %;

•    многоканальный с диапазоном объемов дозирования от 50 мм³ до 350 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального не более ± 4,6 %.

Пленка «парафильм» или скотч.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Шпатели пластиковые.

Штатив для пробирок.

Пипетки Пастера.

Флаконы из темной пластмассы или стекла вместимостью 20 см³.

Палочки стеклянные оплавленные.

Пробирки для центрифугирования с крышкой (типа Эппендорф) из полипропилена вместимостью 2 см³.

Пробирки полипропиленовые для центрифугирования вместимостью 15 см³, 50 см³.

б

Пробирки стеклянные вместимостью 5 см³ или 10 cm^j по ГОСТ 1770.

Колбы мерные вместимостью 100 см³, 500 см³, 1000 cm^j типа 2-100-2, 2-500-2,

2- 1000-2 по ГОСТ 1770.

Колбы конические вместимостью 100 cm^j, 250 см³, 500 см³ типа Кн-1-100-29/32 ТС, Кн-1-250-29/32 ТС, Кн-Г-500-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Воронки типа В-56-80 ХС, В-75-110 ХС но ГОСТ 25336.

Стаканы И-1 - 100 или Н-1 - 150, Н-2-1000 по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-2-5, 1-2-10, 1-2-20, 1-2-25 по ГОСТ 29169.

Цилиндры мерные вместимостью 25 см³, 50 см³, 250 см³ типа 3-25-2, 3-50-2,

3- 250-2 по ГОСТ 1770.

Шприц-фильтры или шприцы и фильтрующие насадки на шприц диаметром 15 мм и диаметром пор 0,45 мкм на основе целлюлозы.

Использование следующего оборудования не является обязательным, но рекомендуется для увеличения производительности и повышения точности измерений:

•    инкубатор для микротитровальных планшетов, обеспечивающий поддержание температуры от плюс 20 °С до плюс 25 °С с точностью не более ± 1 °С;

•    устройство отмывки иммунологических планшетов автоматическое с диапазоном объемов моющего расгвора, заливаемого в каждую микрокговету от 100 мм³ до 350 мм³.

3.2 Реактивы

Метанол ч.д.а по ГОСТ 6995. .

Этилацетат ч.д.а. по ГОСТ 22300. н-Гексан ч. по [ 4 ].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Лабораторный детергент, например Triton Х-100.

Хлорамфеникол, каталожный номер SIGMA С0378, массовая доля основного вещесгва не менее 98 %.

Цинк сернокислый семиводный х.ч. по ГОСТ 4174.

Калий железистосинеродистый 3-водный ч.д.а. по ГОСТ 4207.

Натрия фосфат двуосновной дигидрат (Na₂HP0₄-2H₂O), каталожный номер Fluka 71645 или натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12-водный (Na₂HP0₄-12II₂O) ч.д.а по ГОСТ 4172.

Натрия фосфат одноосновной моногидрат (NaH₂P0₄-H₂O), каталожный номер Sigma-Aldrich 71504 или натрий фосфорнокислый однозамещенный, 2-водный (NaII₂P0₄-2H₂O) ч.д.а по ГОСТ 245.

Натрий хлористый ч.д.а. по ГОСТ 4233.

Натрия гидроокись х.ч. по ГОСТ 4328.

Азот 1азообразный повышенной чистоты но ГОСТ 9293.

Гест-сисгемы Ridascreen © Chloramphenicol (артикульный № R1505) производства R-Biopharm AG, Германия или тест-системы ПРОДОСКРИН®Хлорамфсникол, производства Института биооргаиической химии НАН Беларуси, арт. № 147 по [3] -набор реактивов и микротитровальный планшет, необходимые для выполнения измерений    по    определению    содержания    хлорамфеникола методом

иммуноферментного анализа в составе (таблицы 3, 4).

7

Таблица 3 - Состав тест-системы Ridascreen ® Chloramphenicol

Компонент тест-системы Количество в комплекте Микротитровальиый планшет (12 стрипов по 8 лунок, покрытых антителами к хлорамфениколу) 1 шт Градуировочные растворы хлорамфеникола с концентрацией 0 нг/дм3, 25 нг/дм3, 50 нг/дм3, 100 нг/дм3, 250 нг/дм3, 750 нг/дм3 6 шт. х 1,3 см3 Концентрат конъюгата хлорамфеникола с пероксидазой 1 шт. х 0,7 cmj Субсграт/хромоген, раствор, окрашенный в красный цвет 1 шт. х Ю см3 Стоп-реагент, содержит 1 и серную кислоту 1 шт. х 14 cmj Буфер, готовый к применению, используется для разбавления концентрата конъюгата и растворов проб 1 шт. х 100 см3 Моющий буфер, соль для приготовления 10 мМ фосфатного буфера (рЫ 7,4), содержит 0,05 % твина-20 1 уп.

Таблица 4 - Состав тест-системы ПРОДОСКРИН®Хлорамфеникол

Компонент тест-системы Количество в комплекте Микротитровальиый планшет (12 стрипов по 8 лупок, покрытых антителами к хлорамфениколу) 1 шт Градуировочные раст воры хлорамфеникола с концентрацией 0 пг/дм3, 25 нг/дм3, 50 нг/дм3, 100 нг/дм3, 250 нг/дм3, 750 иг/дм3 6 шт. х 1,3 см3 Концентрат конъюгата хлорамфеникола с пероксидазой хрена 1 шт. х 0,7 см"* Субстрат 1 шт. х И см3 Хромоген, раствор 3,3\5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) 1 шт. х 0,7 см3 Стоп-реагент, содержит 1 н серную кислоту 1 шт. х 14 см3 Буфер, готовый к применению, используется для разбавления концентрата конъюгат а и растворов проб 1 шт. х 100 см3 Моющий буфер, 10-кратный концен трат 1 шт. х ЮО см3

Примечание: в состав тсст-системы ПРОДОСКРИН® Хлорамфеникол вместо растворов хромогена и субстрата может быть включен субстраг-/хромогеи в виде готового к использованию раствора - 1 шт. ^х 12 см³.

Допускаемся использовать другие средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование по метрологическим и техническим характеристикам, а материалы и реактивы (кроме тест-систем) по качеству не хуже указанных.

4 Метод измерений

Используемый метод основан на взаимодействии антигена (хлорамфеникола) с антителами. В лунки микротитровального планшета, покрытого антителами к хлорамфениколу, добавляются градуировочные растворы хлорамфеникола или растворы проб вместе с раствором конъюгата хлорамфеникола с ферментом. Хлорамфеникол, присутствующий в градуировочных растворах или пробах, и хлорамфеникол, коньюгированный с ферментом, конкурируют за центры связывания антител. Затем несвязанный конъюгат фермента удаляется на стадии промывки. После добавления раствора(ов) субстрата/хромогсна связанный конъюгат фермента превращает хромоген в голубой продукт. Реакция окрашивания останавливается после

добавления стоп-реагента, который меняет цвет раствора па жел тый.

Измеренная при 450 нм оптическая плотность обратно пропорциональна массовой концентрации хлорамфеникола в растворе. Массовая концентрация хлорамфеникола в пробе определяется но градуировочной зависимости, построенной по 6 градуировочным растворам.

5    Требования безопасности и требования к квалификации операторов

5.1    Общие требования безопасности

При выполнении работ по определению массовой концентрации хлорамфеникола обслуживающий персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

•    электробезопасности по ГОСТ 12.2.003;

•    пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004;

•    техники безопасности при работе в химической лаборатории в соответствии с инструкциями, утвержденными в установленном порядке;

•    техники безопасности, изложенные в инструкции по эксплуатации средств измерений и оборудования, применяемых при проведении измерений.

5.2    Треб ования безопасности при работе с метанолом

Персонал, работающий с метанолом и его растворами, должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования инструкции по технике безопасности при работе с метанолом, утвержденной в установленном порядке.

Все работы с метанолом и его растворами должны проводиться строго в вытяжном шкафу с использованием средств индивидуальной защиты (фартуки, перчатки, очки). Запрещается работать с метанолом при выключенной приточно-вытяжной вентиляции и без применения средств индивидуальной защиты.

5.3    Требования к квалификации операторов

К проведению работ по данной методике допускаются лица, имеющие высшее специальное или среднее специальное образование по профилю выполняемых работ, прошедшие обучение приемам работы на оборудовании, освоившие выполнение всех операций, предусмотренных методикой, владеющие техникой постановки иммупоферментного анализа.

6    Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

•    температура окружающего воздуха от плюс 20 °С до плюс 25 ^сС;

•    относительная влажность воздуха не более 80 % при температуре 25 °С.

7    Условия инкубации микротитровальных планшетов в помещении

При отсутствии инкубатора микротитровальные планшеты могут инкубироваться в помещении при выполнении следующих условий:

•    температура окружающего воздуха должна быть от плюс 20 °С до плюс 25 °С;

•    нс должно происходить попадание прямых солнечных лучей на планшет;

•    планшет не должен подвергаться воздействию сильных естественных или искусственных потоков воздуха, вызванных, например, принудительной

9

вентиляцией;

•    с целью устранения воздействия холодной поверхности стола, на котором находится планшет, рекомендуется помещать под него теплоизоляционный материал, например, сложенное в несколько слоев бумажное полотенце.

•    при низкой относительной влажности воздуха и наличии воздушных потоков с целью устранения возможности испарения содержимого лунок рекомендуется покрывать планшет пленкой «парафильм» или заклеивать скотчем.

•    в особых случаях, которые оговорены по тексту МВИ, требуется помещать планшет в защищенное от света место, например в ящик стола.

8    Условия хранения тест-систем

Хранение тест-систем осуществляется в холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в оригинальных флаконах и упаковке. Не допускается замораживание реагентов с целью увеличения их срока хранения и использование тест-систем или их отдельных компонентов по истечении срока хранения, установленного изготовителем.

Хранение неиспользованных стрипов (лунок) осуществляется в холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в плотно закрытом оригинальном фольгированном пакете вместе с имеющимся там осушителем.

Необходимо исключить прямое попадание солнечных лучей на светочувствительный раствор хромогена.

9    Подготовка к выполнению измерений

9.1    Отбор образцов

Отбор образцов для анализа проводят по СТБ 1036. Отобранные образцы могут храниться в защищенном от света месте при температуре от плюс 2 °С до плюс 4 °С в течение 2-х дней или в замороженном виде при температуре не выше минус 20 °С в течение 14 дней. Перед проведением подготовки проб но и. 9.5 замороженные образцы должны быть разморожены при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С.

9.2    Подготовка лабораторной посуды

Силыюзагрязпеиную лабораторную посуду предварительно обрабатывают хромовой смесью. Лабораторную посуду после мойки в растворе специализированного моющего средства промывают водопроводной, ополаскивают дистиллированной водой 2 раза и высушивают.

Запрещается:

•    многократное использование одноразовой лабораторной посуды;

•    использование бытовых моющих средств для мойки лабораторной посуды.

9.3    Приготовление растворов

9.3.1 Приготовление раствора метанола (1:9 по объему)

В коническую колбу вместимостью 500 см³ приливают 225 см"⁵ дистиллированной воды, отмеренные цилиндром, затем приливают отмеренные цилиндром 25 см³ метанола и перемешивают. Хранят раствор при комнатной температуре (от плюс 20 °С до плюс 25 °С) в плотно закрытой посуде из темного стекла не более одного месяца в соответствии с установленными правилами хранения

ю

1

Результат измерений массовой концентрации хлорамфеникола а яичном порошке относится к восстановленному согласно ГОСТ 30364.0 продукту