УТВЕРЖДАЮ Заместитель Министра — Главный государственный санитарный врач

^-у'^Лес-публини Беларусь

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРОЗАМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

инструкция по применению

Учреждение-разработчик:    Государственное    Учреждение

«Республиканский научно-практический центр гигиены» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Авторы: Марусич Н.И., Перцовский АЛ., Левошук Н.П., Турко Н.Н., Масалов И.Н.

1    Область применения

Настоящий документ «Методика определения нитрозаминов в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» устанавливает методику выполнения измерений массовой концентрации (далее -концентрация) суммы летучих нитрозаминов (далее - НА) - диметилнитрозамин (далее -ДМНА) и диэтилнитрозамина (далее - ДЭНА) - в пищевых продуктах (мясных и колбасных изделиях, в рыбе и рыбных изделиях, в детском питании на основе мясных, рыбных и мучных продуктов) и продовольственном сырье (в зерне, сыром мясе, рыбе) методом жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором.

Методика предназначена для органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор, для научно-исследовательских и других заинтересованных организаций.

Диметилнитрозамин - маслянистая жидкость, плотность (далее - d¹⁸) 1,01, температура кипения 152- 153°С, растворим в воде, этаноле, эфире и других органических растворителях. Структурная формула - (СИзДИ - N=0, молекулярная масса - 74,08.

Диэтилнитрозамин - маслянистая жидкость, d²⁰ 0,95, температура кипения 176,9°С, растворим в воде, этаноле, эфире и других органических растворителях. Структурная формула - (СгЬДДИ - N=0, молекулярная масса -102,13.

ДМНА и ДЭНА обладают широким спектром токсического действия и могут вызывать опухоли различной локализации.

В соответствии с Санитарными правилами и нормами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» № 11 63 РБ 98, утвержденными постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 2 июля 1998 г. № 22, предельно допустимая концентрация (ПДК) НА в мясе, мясных изделиях, колбасах - не более 0,002 мг/кг, в копченостях - не более 0,004 мг/кг, в рыбе свежей - не более 0,003 мг/кг, в продуктах для детского питания - не допускается при чувствительности метода 0,001 мг/кг, в зерне (пивной солод) - не более 0,015 мг/кг. [1]

Метод основан на выделении НА перегонкой с водяным паром и экстракции органическим растворителем, денитрозировании НА бромистым водородом в уксусной кислоте до соответствующих аминов, синтезе производных полученных аминов с 5-(диметиламино)-нафталин-1-сульфохлоридом (далее - дансилхлоридом), хроматографическом разделении и количественном определении образовавшихся производных на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором.

Чувствительность жидкостного хроматографа с флуоресцентным детектором в анализируемом объеме (20 мкл) - 0,5 нг - для ДМНА, 0,75 нг - для ДЭНА.

Идентификация дансилпроизводных НА производится по временам удерживания, а количественное определение содержания ДМНА и ДЭНА - методом внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта применяется дипропилнитрозамин (далее -ДПНА), который соответствует требованиям, предъявляемым к выбору внутреннего стандарта при количественном анализе методом жидкостной хроматографии и является наиболее приемлемым для надежного результата. [2]

2    Показатели ирецизионности методики

Относительные значения показателей прецизионности (повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости) при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ представлены в таблицах 1-2.

2

9    Проведение анализа

9.1    Выделение НА путем отгонки с водяным паром

Навеску 100 г измельченного в мясорубке или измельчителе пищевого продукта (напитков 250 см³ или детского питания) помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 cm^j. соединенную с паровиком и прямым холодильником в соответствии с рисунком приложения 2 настоящей методики. К продукту добавляют 100-150 см³ дистиллированной воды (в зависимости от влажности продукта) и добавляют при помощи пипетки емкостью 1 см³ раствор ДПНА концентрацией 4 мкг/см'³ в количестве0,5 см³ и перемешивают. В смесь добавляют 10 г хлорида натрия, 10 г сульфата натрия или магния, 1 г сульфаниловой кислоты, 10 см³ 1 н раствора серной кислоты. Все перемешивают, подсоединяют колбу к системе и отгоняют НА с водяным паром, собирая 200-250 cm^j дистиллята. Схема прибора для перегонки с водяным паром изображена в приложении А.

9.2    Экстракция НА из дистиллята

200-250 см³ дистиллята, полученного по п.9.1, экстрагируют в делительной воронке хлористым метиленом три раза порциями по 20 см³ в течение 5 мин. Каждую порцию экстракта сливают через воронку с бумажным фильтром, заполненную 5 г безводного сульфата натрия. Фильтр с безводным сульфатом натрия промывают 10 cm^j экстрагента. Далее в осушенный экстракт добавляют 2 см³ 3%-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, приготовленного по п. 8.2.2., перемешивают и оставляют для процесса денитрозирования не менее чем на 30 минут при комнатной температуре. Упаривают хлористый метилен на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 30°С. Полученный экстракт количественно переносят в фарфоровую чашку, колбу для упаривания омывают 0,5 cm^j уксусной кислоты и присоединяют к содержимому фарфоровой чашки. Экстракт осторожно упаривают на песчаной бане при температуре не более 120°С.

Чашку с сухим остатком охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения в фарфоровую чашку добавляют 0,6 cm^j буферного раствора и круговыми движениями растворяют сухой остаток. К полученному экстракту добавляют 0,8 см³ раствора дансилхлорида, приготовленного по п. 8.2.1., перемешивают и немедленно переносят смесь в пробирку с притертой пробкой вместимостью 5 см³. Плотно закрытую пробирку помещают в водяную баню с температурой 55°С не менее чем на 40 минут для прохождения процесса получения дансил-производных.

Затем пробирки извлекаются из водяной бани и охлаждаются до комнатной температуры. К полученному раствору добавляют 1 см³ бензола, интенсивно встряхивают в течении 5 минут и оставляют до момента четкого разделения фаз. Из верхнего прозрачного бензольно-ацетонового слоя пипеткой емкостью 2,0 см³ отбирают 1,62 см³ экстракта и переносят в пробирку емкостью 5 см³ с пришлифованной пробкой. Полученный экстракт выдувают в токе воздуха досуха строго в вытяжном шкафу. К полученному сухому остатку добавляют 0,9 см³ подвижной фазы, плотно закрывают и растворяют сухой остаток путем встряхивания.

Дансилпроизводные анализируют на жидкостном хроматографе, записывая хроматограммы не менее 3-х раз.

10    Результаты анализа

Для расчета конечного содержания суммы НА в исследуемом образце замеряют площади пиков дансилпроизводных диметиламина, диэтиламина и дипропиламина в

И

В случае получения результатов выходящих за пределы максимальной концентрации по калибровочному графику необходимо повторить определение с уменьшенной навеской анализируемого образца.

11    Оформление результатов испытаний

Результаты измерений оформляют по форме, установленной действующей в лаборатории системой регистрации данных.

Результаты должны включать следующую информацию:

-    наименование (шифр) пробы;

-    дату проведения измерений;

-    результаты измерений;

-    фамилию оператора.

Гарантированный результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в виде

(Х±и(Х)),т/кг    (10)

где X - результат измерений, полученный в соответствии с настоящей методикой и рассчитанный согласно п. 10, по результатам не менее 2-х параллельных исследований одного образца;

U(X) - расширенная неопределенность результата измерений X, мг/кг.

Расширенную неопределенность рассчитывают по формуле

U = кх и_с(Х),    (11)

где к - коэффициент охвата, равный 2 при доверительной вероятности Р=0,95;

и_с (X) - суммарная стандартная неопределенность результата измерений X, мг/кг.

12    Проверка приемлемости результатов испытаний

Проверку приемлемости результатов осуществляют согласно п. 5.2.2.1 СТБ ИСО 5725-6-2002. Два результата испытаний должны быть получены в условиях повторяемости. В процессе внутреннего оперативного контроля проводят контроль стабильности градуировочного графика, определяют соответствие полученных результатов пределам повторяемости и воспроизводимости, нормативу точности.

Контроль стабильности градуировочного графика ДПНА проводится ежедневно с контрольной пробой. Вносится концентрация ДПНА, лежащая в середине концентраций градуировочного графика. Градуировочный график считается стабильным если выполняется условие:

I    г -С I

изм зад ^ ут*    /1    \

^II    < К_гр, где    (12)

^ зад

С_зад - заданное значение концентрации ДПНА в градуировочном растворе, мкг/см³.

Сдам - измеренное значение концентрации ДПНА в контрольной пробе, мкг/см³.

К_ф - норматив контроля градуировочного графика, % получен по пункту 7.1 Отчета

Диапазон измерений, мкг/см3	Норматив контроля Кф, %	Иф(Х), %
0,05-0,50	18,95	8,6
0,50-5,00	3,38	1,6

Если абсолютное значение разности гк между двумя результатами испытаний не превышает предел повторяемости г_п (таблица 2), то оба результата считаются приемлемыми, и конечный заявляемый результат является их средним арифметическим. г_к рассчитывается по формуле:

13

(С™-С,*,)*100

^гк -    р    и-⁵;

ср

г_к - найденное расхождение между двумя результатами, %;

С_тах - максимальный результат определения;

Стт ' минимальный результат определения;

С_ср - среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.

Если значение г_к меньше либо равно г_п, то повторяемость параллельных определений признают удовлетворительной и конечный результат является их средним арифметическим значением, при превышении г_к значения г_п контроль повторяют. При повторном превышении указанного норматива должны быть выяснены и устранены причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля воспроизводимости.

13 Проверка стабильности результатов испытаний.

Стабильность результатов измерений может быть проверена с использованием метода добавок и разведений или с использованием контрольной карты Шухарта в соответствии с СТБ ИСО 5726-6-2002.

При построении контрольной карты используют рабочие пробы с ДМНА, ДЭНА и ДПНА. Содержание ДМНА, ДЭНА и ДПНА в рабочей пробе соответствует содержанию их в середине диапазона исследований.

Рассчитывают:

-    центральную линию: d₂xcт_г,

где d₂ =1,128 (коэффициент для расчета центральной линии для п=2);

-    границы регулирования: UCL= D₇ х оу,

где D₂ = 3,686 (коэффициент для расчета границы регулирования для п=2);

-    предупреждающие границы: UCL=D2(2) х оу,

где D₂ (2) = 2,834 (коэффициент для расчета предупреждающих границ для п=2);

су - стандартное отклонение повторяемости, мг/кг.

Оценку стандартного отклонения повторяемости s_r получают по формуле:

^,/2>,

L

где w = \х_г

X, и х₂ - результаты первого и второго определения, мг/кг;

L - количество проведенных измерений.

Полученные значения заносят в лист данных контрольной карты:

14

Графически по оси X откладываю дату проведения анализа, по оси У - размах w. Также отмечают центральную линию и линии предупреждающей и регулирующей границ.

Если размах w выходит за линии предупреждающей и регулирующей границ, то результаты признаются нестабильными. В этом случае выясняются причины нестабильности и проводятся мероприятия по их устранению.

Методика разработана лабораторией хроматографических исследования, отдела физико-химических исследований ГУ «РНПЦ гигиены» М3 РБ.

Разработчики:

Вед. научный сотрудник лаборатории хроматографических исследований, канд. химических наук

Ст. научный сотрудник

Мл. научный сотрудник

Литература

[1]    Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов № 11-63-РБ-98. Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача РБ от 2.07.1998 г. п 22.

[2]    Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В., Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. -М,: Химия, 1986. - 288 с.

[3]    СТБ ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. 4.6. Использование значений точности на практике. -Минск: Госстандарт, 2003 - 42 с.

15

Таблица 1    -    Относительные    значения показателей повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ при определении ДМНА___

Диапазон измерений ДМНА (мг/кг) Показатель повторяемости, % Or Показатель внутрилабораторной воспроизводимости, % or Расширенная относительная стандартная неопределенность, % и 0,0005-0,0050 4,0 5,4 67,0 0,0050-0,0500 5,9 6,4 22,0 0,0500-0,5000 5Д 5,6 -

Таблица 2    -    Относительные    значения показателей повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ при определении ДЭНА_______

Диапазон измерений ДЭНА (мг/кг) Показатель повторяемости, % ог Показатель внутрилабораторной воспроизводимости, % OR Расширенная относительная стандартная неопределенность, % и 0,00075-0,00750 5,4 5,9 45,0 0,00750-0,07500 5,3 5,8 18,0 0,07500-0,75000 5,1 6,2 -

Относительные значения пределов повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 указаны в таблицах 3-4.

Таблица 3    - Относительные значения пределов повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 при определении ДМНА___

Диапазон измерений Предел повторяемости (для Предел внутрилабораторной ДМНА двух результатов воспроизводимости (для двух (мг/кг) параллельных результатов анализа), % определений), % Гп Rn 0,0005-0,0050 10,5 15,0 0,0050-0,0500 16,5 17,5 0,0500-0,5000 14,2 15,6

Таблица 4    - Относительные значения пределов повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 при определении ДЭНА____

Диапазон измерений ДЭНА (мг/кг) Предел повторяемости (для двух результатов параллельных определений), % гп Предел внутрилабораторной воспроизводимости (для двух результатов анализа), % Rn 0,00075-0,00750 15,1 16,4 0,00750-0,07500 14,7 16,1 0,07500-0,75000 14,4 17,4

3 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1 Средства измерений

Хроматограф жидкостной с флуоресцентным детектором

Весы аналитические ВЛА-200, второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200г Микрошприц для хроматографа, «Hamilton» 50мкл, цена деления 1 мкл Пипетки 1-1-1-ОЛ 1-1-1-1 1-1-1-2 1-1-1-5

Колба мерная 11-1-5 (25,100,250,500)-2 Цилиндр мерный на 50, 100, 250 см³ Пробирка со шлифом на 5,10 см³

3.2 Вспомогательные устройства и оборудование

Баня песчаная

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М Баня водяная Воронки ВД-1-500

Воронки конические, стеклянные диаметром 30-33 мм

Колба Кн-1-100(250)- 14/23 (29/32) ТС    ГОСТ    25336-82

Колба К_г-50-14/23 ТС    ГОСТ    25336-82

Колба К-1-100(250) - 29/32 ТС    ГОСТ 25336-82

Мясорубка и измельчитель

Фарфоровые чашки для выпаривания (диаметр 55 мм, объем 20 см³)

УФ-лампа ОКН-11    ТУ 84-1-1618-77

Могут быть использованы другие средства измерений и вспомогательные устройства, по точности, не уступающие рекомендованным в методике.

3.3 Реактивы и материалы

Колонка для жидкостной хроматографии металлическая (250x4,6) Eclipse XDB-C18, 5мкм Диметилнитрозамин, р=1,01 г/см³

Диэтилнитрозамин, р=0,95 г/см'*

Дипропилнитрозамин в метаноле 100 мг Метанол 99,9%

Ацетон ос.ч. Ацетонитрил для ВЭЖХ или сорт 1-3 «Криохром»

4

5 Требования безопасности

Помещение, в котором производится определение НА обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с НА следует проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др.).

В лаборатории, где проводится работа с канцерогенными летучими НА необходимо всегда иметь 4% раствор бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте для разрушения НА при попадании их на рабочие места и пол. В целях разрушения летучих НА в воздухе по окончании работы помещение необходимо обработать УФ-светом в течение 30 минут.

Транспортировка и хранение НА осуществляется в стеклянных запаянных ампулах, обернутых в асбестовую ткань и упакованных в металлическую тару, которую также оплавляют парафином.

НА хранят в специальном холодильнике в отсутствие анализируемых проб.

6    Требований к квалификации оператора

К выполнению измерений могут быть допущены лица, имеющие высшее или среднее специальное образование, изучившие требования безопасности и настоящую методику, имеющие опыт работы с ядовитыми веществами и навыки в методах экстракции, концентрирования и получения различных производных.

7    Условия выполнения измерений

Выполнение измерений в лаборатории по настоящей методике осуществляется при следующих условиях:

-    температура воздуха при приготовлении растворов, в том числе градуировочных (20±2)°С;

-    температура воздуха при измерении (20±5) °С;

атмосферное давление 84,0-106,7 кПа (630-800 мм ртутного столба);

-    влажность воздуха (65±15)% при температуре 25 °С; напряжение питающей сети (220±10)В;

частота переменного тока (50±0,5)Гц, что соответствует ГОСТ 15150-69.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводятся в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и настоящей методикой

8    Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб к анализу.

8.1    Подготовка измерительной аппаратуры

Включить жидкостной хроматограф согласно инструкции по эксплуатации. Установить рабочие режимы для колонки и детектора. Для дегазации колбу с элюентом помещают на водяную баню при температуре 40-50 °С, открыв при этом пробку. После охлаждения колбы до комнатной температуры подвижная фаза готова к применению. Элюент должен быть всегда закрыт пробкой и храниться в холодильнике.

8.2    Приготовление растворов

8.2.1    Раствор дансилхлорида с концентрацией 0,5 мг/см³.

Навеску дансилхлорида массой 26,3 мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³ и растворяют в 20 см³ ацетона, доводят до метки ацетоном. Готовый раствор хранят в холодильнике, тщательно предохраняя от попадания влаги. Срок хранения - не более 3 Месяцев.

8.2.2    3%-ный раствор бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте (денитрозирующий раствор).

3    3

В коническую колбу вместительностью 100 см вносят 5 см 30%-ной бромистоводородной кислоты и добавляют 45 см³ ледяной уксусной кислоты. Смесь хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Срок хранения - не более 1 месяца. Признаком непригодности смеси является появление желто-коричневой окраски.

6

8.2.3    Буферный раствор с pH- 10,5.

В мерную колбу вместимостью 500 cm^j помещают 3,2 г NaOH и вливают 200 cm^j дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения щелочи, добавляют 20,0 г NaHCC>3. Тщательно перемешивают раствор до полного растворения соли, доводят объем смеси до метки дистиллированной водой. Хранят раствор в полиэтиленовой посуде. Срок хранения - 3 месяца.

8.2.4    Раствор серной кислоты с концентрацией 1н.

В мерную колбу вместимостью 250 см³ помещают 200 cm^j дистиллированной воды. Добавляют 6,7 см³ концентрированной серной кислоты (плотностью 1,98 г/см³), перемешивают, охлаждают до комнатной температуры. Доводят объем до метки дистиллированной водой. Срок хранения не ограничен.

8.2.5    Рабочий раствор ДМНА с концентрацией 101 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 20 см³ метилового спирта. Добавляют 10 мм³ ДМНА микропипеткой на 0,1 cm^j (концентрацией 1,01 г/см³) и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.

8.2.6    Рабочий раствор ДЭНА с концентрацией 95 мкг/см³.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 20 cm^j метилового спирта. Добавляют 10 mm^j ДЭНА микропипеткой на 0,1 см³ (концентрацией 0,95 г/см³) и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.

8.2.7    Рабочий раствор ДПНА с концентрацией 400 мкг/ см³.

В мерную колбу вместимостью 250 cm^j количественно переносят стандартный образец состава ДПНА с навеской 100 мг, растворяя его в метиловом спирте, и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.

8.2.8    Рабочий раствор ДПНА с концентрацией 4 мкг/ см³ (внутренний стандарт).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ пипеткой емкостью 1 см³ вносят 1 cm^j рабочего раствора ДПНА с концентрацией 400 мкг/см³ добавляют 20 см³ метилового спирта, тщательно перемешивают и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 6 месяцев.

8.2.9    Подвижная фаза для жидкостного хроматографа - смесь ацетонитрил : вода (7:3).

В коническую колбу вместимостью 1000 см³ помещают 700 см³ ацетонитрила. Добавляют 300 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и дегазируют. Для дегазации колбу с элюентом помещают на водяную баню при температуре 40-50 °С, открыв при этом пробку. После охлаждения колбы до комнатной температуры подвижная фаза готова к применению. Элюент должен быть всегда закрыт пробкой и храниться в холодильнике. Срок хранения не ограничен.

7

8.2.10    Хлористый метилен.

Очистку хлористого метилена производят перегонкой с дефлегматором. При этом отбирают не более 80% растворителя от начального объема.

8.2.11    Приготовление градуировочных растворов

8.2.11.1    Приготовление основной смеси ДМНА, ДЭНА и ДПНА с концентрациями компонентов 3,0, 4,5 и 6,0 мкг/ см³ соответственно.

В колбе вместимостью 100 cm^j с притертой пробкой смешивают 2,97 см³ раствора ДМНА (95 мкг/^см³), 4,74 см³ ДЭНА (101 мкг/ см³) и 0,60 см³ ДПНА (400 мкг/ см³) пипеткой на 5cm^j и на 0,1см³. Смесь хранится в посуде из темного стекла в холодильнике (при температуре +4°С) не более 6 месяцев.

8.2.11.2    Выделение НА путем отгонки с водяным паром

В колбу для перегонки вместимостью 500 смД соединенную с паровиком и прямым холодильником в соответствии с рисунком приложения А настоящей методики, поместить 250 cm^j дистиллированной воды, добавить 2 см³ стандартной смеси ДМНА, ДЭНА и ДПНА в метаноле пипеткой на 2,0 см³. Содержание НА в водном растворе составляет 6,0, 9,0 и 12,0 мкг соответственно. К смеси добавить 10 г сульфата натрия или сульфата магния, 1 г сульфаминовой кислоты, 10 г хлорида натрия, 10 см³ 3 н раствора серной кислоты. Все перемешивают, подсоединяют колбу к системе и отгоняют НА с водяным паром, собирая 250 cm^j дистиллята в колбу на 300 cm^j.

8.2.11.3    Экстракция НА из дистиллята

250 см^ дистиллята, полученного по п. 8.2.11.2 помещают в делительную воронку на 500 смД колбу ополаскивают 20 cm^j хлористого метилена, который затем сливают в делительную воронку с экстрактом и производят экстракцию в течении 5 мин. Экстракцию хлористым метиленом повторяют еще дважды порциями по 20 см³ в течение 5 мин. Каждую порцию экстракта сливают через воронку с бумажным фильтром, заполненную 5 г безводного сульфата натрия или сульфата магния в колбу для отгонки на 100 cm^j. Фильтр с безводным сульфатом натрия промывают 10 см³ экстрагента.

8.2.11.4    Получение дансилпроизводных НА.

В осушенный экстракт добавляют 2 cm^j 3%-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, приготовленного по п. 8.2.2., перемешивают и оставляют для процесса денитрозирования не менее чем на 30 минут при комнатной температуре. Упаривают хлористый метилен на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 30°С до приблизительно 2 см³. Полученный экстракт количественно переносят в фарфоровую чашку, колбу для упаривания омывают 0,5 см³ уксусной кислоты и присоединяют к содержимому фарфоровой чашки. Экстракт осторожно упаривают на песчаной бане при температуре не более 120°С.

Чашку с сухим остатком охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения в фарфоровую чашку добавляют 0,6 см³ буферного раствора и круговыми движениями растворяют сухой остаток. К полученному экстракту добавляют 0,8 cm^j раствора дансилхлорида, приготовленного по п. 8.2.1., перемешивают и немедленно переносят смесь в пробирку с притертой пробкой вместимостью 5 cm^j. Плотно закрытую пробирку

помещают в водяную баню с температурой 55°С не менее чем на 40 минут для прохождения процесса получения дансил-производных.

Затем пробирки извлекаются из водяной бани и охлаждаются до комнатной температуры. К полученному раствору добавляют 1 cm^j бензола, интенсивно встряхивают в течении 5 минут и оставляют до момента четкого разделения фаз. Из верхнего прозрачного бензольно-ацетонового слоя пипеткой емкостью 2,0 см³ отбирают 1,62 cm^j экстракта и переносят в пробирку емкостью 5 см³ с пришлифованной пробкой. Полученный экстракт выдувают в токе воздуха досуха строго в вытяжном шкафу. К полученному сухому остатку добавляют 1,8 см³ подвижной фазы, плотно закрывают и растворяют сухой остаток путем интенсивного встряхивания. Отстоявшийся раствор является основным раствором для приготовления остальных градуировочных растворов (раствор №6).

В таблице 5 представлена схема разведения для получения калибровочных растворов. Калибровочные растворы готовятся в пробирках вместимостью 5 см³ при помощи пипеток емкостью 1 и 2 cm^j путем последовательного разведения подвижной фазой.

Таблица 5 - Приготовление калибровочных растворов и содержание в них НА.

№ градуиро вочного раствора Объем смеси, см3 Объем подвижной фазы, см'5 ДМНА, мкг/ 3 см ДЭНА, мкг/ см3 ДПНА,^ мкг/ CMJ 1 1,0 р-ра №2 1,0 0,025 0,0375 0,050 2 0,5 р-ра №3 2,0 0,050 0,075 0,100 3 0,5 р-ра №4 1,5 0,250 0,375 0,500 4 1,0 р-ра №5 1,0 1,000 1,500 2,000 5 1,0 р-ра №6 0,5 2,000 3,000 4,000 6 1,8 0 3,000 4,500 6,000

Таким образом из раствора № 6 получают раствор № 5 путем смешивания 1,0 cm^j основного раствора с 0,5 см³ подвижной фазы, получен раствор общим объемом 1,5 cm^j с концентрацией ДМНА, ДЭНА и ДПНА 2,0; 3,0 и 4,0 мкг/мл соответственно.

8.2.11.5 Приготовление контрольной пробы.

Приготовление контрольной пробы или контроль на реактивы проводится с целью определения наличия НА в применяемых реактивах для их вычитания из результатов анализа.

В колбу для перегонки помещают все используемые реактивы (п 8.2.11.2) в 250 см³ дистиллированной воды, добавляют при помощи пипетки емкостью 1 см³ раствор ДПНА концентрацией 4 мкг/см³ в количестве 0,5 см³.

8.3 Установление градуировочной характеристики

Хроматографирование градуировочных растворов и контрольной пробы проводится при следующих условиях:

-    жидкостной хроматограф с флуоресцентным детектором;

-    колонка из нержавеющей стали (250x4 мм), заполненная сорбентом Eclipse XDB-С18, зернением 5 мкм;

-    температура колонки 30 °С;

9

-    подвижная фаза - смесь ацетоннитрил-вода в объемном соответствии 7:3, скорость элюирования - 1,2 см7мин;

-    длина волны возбуждения - 350 нм;

-    эмиссионный фильтр - 530 нм;

-    объем вводимой пробы - 20 мкл;

-    время удерживания дансилпроизводных устанавливается по калибровочным смесям при подобранных условиях хроматографии.

8.4 Градуировка хроматографа

Приготовленные в соответствии с табл. 3 градуировочные смеси используются для градуировки хроматографа.

При условиях хроматографии, указанных в п. 8.3, записывают не менее трех хроматограмм для каждого из приготовленных растворов и измеряют площади пиков дансилпроизводных диметиламина, диэтиламина и дипропиламина. Определяют среднеарифметическое значение площадей пиков, рассчитанное из площадей хроматограмм.

Численное значение относительных коэффициентов отклика детектора Ко_ХН получают из хроматографических данных градуировочных растворов с известными концентрациями ДМНА, ДЭНА и ДПНА по формуле

_к = ю,-х

где /и, - масса введенных в хроматограф ДМНА и ДЭНА, мкг;

S_i - площади полученных пиков ДМНА и ДЭНА, см²;

8_{вн ст} - площадь внутреннего стандарта - ДПНА, см²;

т_{ен ст} - масса введенного внутреннего стандарта - ДПНА, мкг.

Численное значение К_отн каждый экспериментатор вычисляет в соответствии с применяемыми приборами, реактивами, установками и его необходимо пересчитывать при изменении любой из перечисленных составляющих.

5.5    Контроль градуировочных характеристик

Контроль градуировочных характеристик осуществляется по внутреннему стандарту, вводимому в контрольную и исследуемую пробу. Площадь вносимого внутреннего стандарта в холостую и исследуемую пробу в одинаковой концентрации не должны отличаться более чем на 10 % от площади, по которой были рассчитаны коэффициенты отклика. Если обнаружится, что результаты сильно отличаются, то необходимо пересчитать коэффициент отклика К_0Тн-

8.6    Подготовка анализируемых образцов

Отбирают не менее 1 кг средней пробы пищевого продукта или продовольственного сырья в соответствии с требованиями СТБ 1036-97 «Продукты пищевые и продовольственное сырье. Методы отбора проб для определения показателей безопасности».

Отобранные образцы можно хранить в морозильной камере при -8--18°С 1-3 суток в зависимости от сроков реализации продукции.

10