ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ    ГОСТР

СТАНДАРТ    57130—

российской    2016

ФЕДЕРАЦИИ

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Исследование генотоксичности и интерпретация полученных данных

(ЮН S2:2011, Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use, IDT)

Издание официальное

Предисловие

1    ПОДГОТОВЛЕН Государственным бюджетным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Первый МГМУ имени И М. Сеченова) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 458 «Разработка, производство и контроль качества лекарственных средств»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2016 г. № 1345-ст

4    Настоящий стандарт идентичен международному документу ICH S2:2011 «Руководство по изучению генотоксичности и интерпретации полученных данных для лекарственных препаратов для медицинского применения» («Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use». IDT) Международной конференции no гармонизации технических требований для регистрации лекарственных средств для медицинского применения (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use: ICH).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного документа в связи с особенностями построения межгосударственной системы стандартизации

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет (www.gost.ru)

© Стандартинформ. 2016

Настоящий стандарт не может быть воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

II

ГОСТ P 57130—2016

ровку. Оценка преципитации может осуществляться на глаз или при помощи инструментальных методов, таких как световая микроскопия, отслеживая осадок, который сохраняется либо появляется в процессе культивирования (к концу терапии).

Цитотоксичность

При проведении цитогенетических анализов in vitro хромосомных аберраций в метафазе либо мик-роядерных проб цитотоксичность может приводить к снижению роста клеток не более чем на 50 % (примечания 9 и 10). Для MLA максимальной дозой должна быть доза, вызывающая 80—90 %-ную цитотоксичность, измеряемая по RTG в пределах 20—10 % (примечание 9).

Примечание 9

Несмотря на то. что нокоторыо гонотоксичныо канцерогены но опродопимы в рамках анализов гоноток-сичности in vitro, кромо случаев, когда исследуемые концентрации индуцируют определенную степень цитотоксичности. препараты, повреждающие ДНК. обычно определяют лишь при среднем уровне токсичности (Greenwood ot а!.. 2004). По море роста цитотоксичности другие механизмы, помимо прямого повреждения ДНК веществом или ого метаболитами, могут привести к получению к положительных» результатов, обусловленных цитотоксичностью, в не гвнотоксичностью. Подобная косвенная индукция повреждения ДНК вследствие повреждения не ДНК-структур. вероятнее всего, может возникнуть при концентрации, превышающей определенный порог. Нарушения клеточных процессов но предполагаются при болоо низких фармакологически актуальных концентрациях.

В цитогенетических анализах даже слабые кластогены с канцерогенными свойствами дают положительный результат. не достигая 50 %-ного снижения числа клоток. С другой стороны, вещества, не обладающие повреждающим ДНК аффектом, мутагонным либо канцерогенным потенциалом, могут вызывать поломку хромосом в токсических концентрациях. Для цитогенетических анализов in vitro, анализа хромосомных аберраций и микроядорной пробы in vitro целесообразным является продольное снижение роста на 50 %.

Для цитогонотичоских анализов в клеточных линиях измононио популяции клоток с точониом времени (за счет измерения изменения числа клоток во время культивирования относительно контроля, например, методом удвоения популяции (PD. примечание 10). является полезным параметром оценки цитотоксичности, поскольку известно, что подсчет числа клеток может привести к недооценке токсичности. Для культур лимфоцитов подавлонио пролиферации, но превышающее около 50 %. считается достаточным, что можот быть определено по митотическому индексу (МИ) для анализа аберраций в метафазе и по индексу, основанному на блокировке цитокинеза для микроядерных тестов in vitro. Кроме того, для микроядерного теста in vitro, поскольку микроядра оценивают в интерфазе поело митотического долония. необходимо подтвердить прохождонио клетками клеточного цикла. Этого можно достичь за счет использования цитохалазина В для обеспечения ядерного деления, а не клеточного деления, так что микроядра можно оценить в двухьядерных клетках (предпочтительный мотод в случав анализа в лимфоцитах). Для клеточных линий могут применяться другие методы. показывающие пролифюрацию клеток, включая рост популяции с точониом времени (PD). как описано выше (Kirsch-Volders et at.. 2003).

Для MLA достаточной чувствительности можно достичь за счет ограничения максимальной концентрации. близкой к 20% относительного общего роста (RTG) (10—20 %) для методов с использованием как мягкого агара, так и микролунок (Moore et at.. 2002). Анализ опубликованных данных с использованием текущих критериев определил малое количество веществ с положительным результатом MLA только в концентрациях менее 20 % RTG. представляющих собой канцерогены для крыс, при этом отсутствуют убедитепьныо свидетель-ства гонотоксического канцерогенеза для данной категории. По общему мнению, необходимо с осторожностью подходить к интерпретации результатов при увеличении мутации ниже 20 % RTG. и результат не считался бы положительным при увеличении мутантной фракции при s f 0 % RTG.

Таким образом, следует с осторожностью подходить к интерпретации результатов в виде снижения роста/выживаемости или превышающих 50 % для цитогенетического анализа либо 80% — для MLA Установлено. что оценка клеток, обрабатываемых при данном уровне цитотоксичности/клональной выживаемости, может привести к повышению чувствительности, но и к болев высокому риску нерелевантных положительных результатов. Батарейный подход к анализу гонотоксичности должен обеспечить необходимую чувствительность. не опираясь на индивидуальные анализы в клетках грызунов in vitro при высокой цитотоксичности.

Для достижения соответствующего диапазона токсичности необходимо проведение предварительного исследования по подбору диапазона доз в широком диапазоне концентраций, но при проведении анализа гонотоксичности зачастую важно использовать различные концентрации с достаточно близкими интервалами (менее чем двукратная степень разведения). Дополнительные концентрации возможно исследовать, но не все концентрации следует оценивать на предмет гонотоксичности. Не предполагается проведения множественных экспериментов до достижения четкого 50 %-ного снижения роста либо четкого 80 %-ного снижония RTG.

Примечание 10

Для цитогенетических анализов in vitro целесообразно использовать параметры относительного роста клеток с целью оценки токсичности, поскольку при подсчете клеток токсичность можот быть недооценена (Greenwood eta!.. 2004). При помощи расчетного удвоения популяции (см. Гпоссарий) для оценки 50%-ного уровня

снижения роста было установлено, что частота положительных результатов для веществ без мутагенного или канцерогенного потенциала снижена, в то время как вещества, действующие за счет прямого взаимодействия с ДНК. обеспечивают надожныо положительные результаты.

3.3.2    Дизайн исследования /Протоколы испытаний

В целях цитогенетической оценки повреждений хромосом в клетках метафазы in vitro, протокол испытания должен включать проведение испытаний с метаболической активацией и без, с использованием соответствующего положительного и отрицательного контроля. Терапия исследуемыми препаратами должна иметь продолжительность от 3 до 6 часов, а время пробоотбора должно приблизительно в

1,5 раза превышать обычный клеточный цикл от начала терапии. Непрерывная терапия без метаболической активации продолжительностью, приблизительно в 1.5 раза превышающей нормальный клеточный цикл, должна проводиться при получении отрицательных или сомнительных результатов обоих циклов краткосрочной терапии с метаболической активацией и без нее. Аналогичные принципы распространяются на микроядерную пробу in vitro, с тем отличием, что время пробоотбора. как правило, составляет 1.5—2 нормальных клеточных цикла от начала терапии, чтобы обеспечить возможность полного прохождения клетками митоза и вхождения в следующую интерфазу. Для обоих цитогенетических анализов in vitro может потребоваться модификация протокола копределенным типам химических веществ, которые проще определить при более длительной терапии, отсрочивании пробоотбора или периода восстановления, например, некоторые нуклеозидные аналоги и некоторые нитрозамины. В метафазном анализе аберраций информацию о плоидическом статусе получают за счет регистрации частот полиплоидных (включая эндоредуплицированные) метафаз в виде процента от числа клеток в метафазе. Для MLA протокол испытания должен включать проведение испытаний с метаболической активацией и без с соответствующим положительным и отрицательным контролем при продолжительности терапии исследуемым препаратом 3—4 часа. Длительная терапия без метаболической активации продолжительностью около 24 часов должна проводиться в случае получения отрицательного или сомнительного результата обоих краткосрочных циклов терапии с метаболической активацией и без нее. Стандартный MLA должен включать (i) положительный контроль, индуцирующий, главным образом, малые колонии, и (ii) изменение размера колоний для положительного контроля, контроль растворителей и минимум одну положительную концентрацию исследуемого компонента (при наличии), включая культуру, характеризующуюся наибольшей частотой выявления мутаций.

Для исследований на клетках млекопитающих in vitro должны использоваться встроенные подтверждающие элементы, подобные перечисленным выше (например, различная продолжительность терапии, тесты с метаболической активацией и без нее). После подобных анализов дальнейшие подтверждающие испытания в случае получения определенно отрицательных или положительных результатов. как правило, не требуются. При получении сомнительных или слабоположительных результатов могут потребоваться повторные тесты, возможно, в рамках модифицированного протокола, например, с установлением иных интервалов исследуемых концентраций.

3.3.3    Положительный контроль

Одновременное проведение тестов на положительных контрольных образцах важно, однако тесты на клетках млекопитающих с целью выявления генетической токсичности в достаточной степени стандартизированы. так что использование положительных контрольных образцов обычно ограничивается использованием их в случае метаболической активации (при одновременном проведении с тестами без активации) с целью продемонстрировать активность системы метаболической активации и восприимчивости тест-системы.

4 Рекомендации по проведению испытаний in vivo

4.1 Тесты, проводимые с целью определения хромосомных повреждений in vivo

Для определения кластогенов подходит либо анализ хромосомных аберраций, либо измерение микроядерных полихроматических эритроцитов в костном мозге in vivo. Для проведения микроядерной пробы в костном мозге в качестве модели подходят и крысы, и мыши. Микроядра также можно исследовать в незрелых (например, полихроматических) эритроцитах в периферической крови мышей либо в новообразованных ретикулоцитах в крови крыс (примечание 3). Аналогичным образом также могут использоваться незрелые эритроциты животных любого другого вида, характеризующиеся аналогичной чувствительностью к определению индукторов кластогенов/анеуплоидии в костном мозге или периферической крови (примечание 3). При условии надлежащей валидации могут использоваться системы автоматизированного анализа (визуальный анализ и проточная цитометрия) (OECD. 1997;Hayashietal.,

ГОСТ P 57130—2016

2000: 2007). Анализ хромосомных аберраций также можно провести в периферических лимфоцитах, полученных от грызунов, получавших терапию (примечание 11).

Примечание 11

В некоторых случаях полезно исследовать хромосомные аберрации в метафазе в лимфоцитах, взятых от испытуомых животных поело одного или нескольких введений исслодуомого вощоства. а такжо могут использоваться клетки костного мозга в метафазе. Поскольку лимфоциты циркулирующей крови не размножаются. предполагается, что вещества, требующие репликации для выявления генопюксического действия (например, некоторые нуклеозидныв аналоги), не должны выявляться в клетках данного типа. Поскольку некоторые лимфоциты имеют достапючно высокую продопжитолыюсть жизни, в принципе, существует потенциал аккумуляции непарного повреждения ДНК in vivo, который может привести к аберрациям при стимуляции деления клеток in vitro. Анализ лимфоцитов in vivo полезен при контроле гюказаний кластогенности. но в целом другие ткани, такие как печень, представляют собой болоо информативную замену тоста микроядер в гомопо-этических клетках, поскольку концентрации препарата и метаболитов в печени зачастую выше.

4.2 Другие испытания генотоксичности in vivo

Аналогичные испытания in vivo, описанные в качестве второго испытания в рамках стандартного набора тестов (вариант 2), могут использоваться в качестве контрольных испытаний для получения необходимого набора данных для оценки результатов анализов in vitro или in vivo (примечания 11 и 12). Несмотря на то. что тип эффектов, наблюдаемых in vitro, и знание механизма может помочь при выборе анализа in vivo, проведение исследований хромосомных аберраций или генных мутаций эндогенных генов в большинстве тканей нецелесообразно проводить стандартными методами. Несмотря на то, что мутации можно определять в трансгенах грызунов, это подразумевает более продолжительную терапию (например, в течение 28 дней) для экспрессии, фиксации и аккумуляции мутаций, особенно в тканях с медленно делящимися клетками (примечание 12). Таким образом, во втором анализе in vivo в качестве суррогатной конечной точки проводят оценку повреждения ДНК. Анализы с наиболее полным опубликованным опытом и рекомендациями в рамках протоколов включают анализы поломки нитей ДНК, в том числе анализ единичной клетки методом гель-электрофорез («Кометный анализ») и анализ разрывов ДНК, анализы трансгенных мутаций на мышах in vivo и анализы ковалентного связывания ДНК (любой из которых может применяться во многих тканях, примечание 12), и анализ репаративного синтеза ДНК в печени (анализ UDS).

Примечание 12

Включение второго анализа in vivo в батарею тестов должно обеспечить отсутствие генотоксичности за счет использования тканей, в которых достигаются высокие концентрации препарата и/ипи его метаболитов. небольшое число канцерогенов, предполагающих генотоксичность. обеспечили достижение положительных результатов тоста в печони. но имели отрицатопы<ый результат цитогенетического анализа in vivo в костном мозге. Эти примеры, вероятно, отражают отсутствие необходимой метаболической активности либо отсутствие поступления реактивных промежуточных продуктов в гемопоэтические клетки костного мозга.

Анализ разрывов нитей ДНК. ДНК-аддукты и мутации трансгенов имеют преимуществом возможность использования во многих типах тканей. Протоколы, согласованные на международном уровне, пока не разработаны для всех анализов in vivo, хотя существует достаточный опыт и опубликованные данные, и рекомендации протокола в отношении анализов поломки нитей ДНК (кометный анализ и анализ методом щелочной элюции). аддукт ДНК (ковалентное связывание) и анализа мутации на трансгенных грызунах, помимо анализа UDS. Для вещества с положительным результатом анализа MLA in vitro и индуцирующего преимущественно крупные колонии, а такжо но вызывающего поломку хромосом в мотафазном анализе in vitro, вместо анализа разрыва нитей ДНК следует рассмотреть анализ мутаций in vivo, например, анализ мутаций на трансгенных мышах. Анализ UDS считается полезным, главным образом, для веществ, индуцирующих об ъемные аддукты ДНК либо с положительным результатом тоста Эймса. Поскольку цитотоксичность провоцирует разрыв нитей ДНК. во избежание искажения результатов анализа разрыва нитей ДНК следует провести тщательную оценку цитотоксичности. Это явление хорошо описано в отношении теста методом щелочной элюции in vitro (Storer et а!.. 1996). при этом но полностью валидировано для комотного анализа. В принципе, анализ разрыва нитей ДНК может применяться в рамках токсикологических исследований многократных доз с необходимым уровнем доз и продолжительностью пробоотбора

Поскольку печень зрелых животных не отличается высокой митотической активностью, для второго анализа часто используют не цитогенетическую конечную точку, но при наличии делящихся гепатоцитов, например, после частичной гвпатэктомии, либо у молодых крыс (Hayashi et at., 2007). возможно проведение микроядерного анализа в печени, позволяющего выявить известные генотоксические вещества.

9

4.3 Выбор доз в рамках анализа in vivo

Обычно анализ проводят с использованием трех уровней доз (Hayashi el al.. 2005).

4.3.1    Краткосрочные исследования

Для краткосрочных исследований (1 —3 дозы) максимально рекомендованная доза для исследований генотоксичности представляет собой предельную дозу 2000 мг/кг при условии хорошей переносимости либо максимально переносимую дозу, определяемую (например, для микроядерного анализа (OECD)) как дозу, вызывающую признаки токсичности такой степени выраженности, чтобы более высокие дозы при сохранении аналогичного режима дозирования привели бы к летальному исходу. Аналогичные рекомендации действуют в отношении кометного анализа (Hartmann et al.. 2003) и трансгенного анализа мутаций (Heddle el al.. 2000). Подавление продукции эритроцитов костным мозгом также следует учитывать при выборе дозы. Интервалы между более низкими дозами, как правило, в два-три раза ниже заданного.

4.3.2    Исследования многократного применения

Вариант 1 набора

В случае если анализ генотоксичности in vivo интегрирован в токсикологическое исследование многократного применения, дозы, как правило, считаются подходящими, если токсикологическое исследование отвечает критериям исследования, подкрепляющего клинические исследования с участием человека. что может отличаться от критериев выбора дозы в руководстве OECD при проведении микроя-дерной пробы in vivo. Это относится и к случаям отрицательных результатов анализа на клетках млекопитающих in vitro («несвойственно положительный», см. раздел 5).

Пострегистрационные исследования или набор тестов по варианту 2

При проведении пострегистрационных исследований с целью проверки любого из показаний по генотоксичности или при использовании 2-го варианта без проведения анализа на клетках млекопитающих in vitro следует учитывать несколько факторов для определения целесообразности максимальной дозы для оценки генотоксичности. Любого из нижеприведенных критериев достаточно для того, чтобы подтвердить, что максимальная доза в токсикологическом исследовании (обычно на крысах) подходит для микроядерной пробы и для других оценок генотоксичности:

i.    Максимально допустимая доза (МПД) на основании физико-химических свойств препарата в основе (при условии, что МПД для данной основы аналогична МПД. достигаемой при остром введении; примечание 13).

ii.    Предельная доза 1000 мг/кг для исследований продолжительностью 14 дней и больше, при условии удовлетворительной переносимости.

iii.    Максимально возможная концентрация достигается за счет достижения плато/насыщения концентрации либо за счет накопления вещества. Напротив, при существенном снижении концентрации исходного препарата с течением времени (например, г 50 % снижение от начальной концентрации) исследование может быть дисквалифицировано (за исключением случаев, когда доступен образец крови. взятый в первые несколько дней). Если данный эффект наблюдается у животных одного пола, как правило, у животных с меньшей концентрацией не будет проводиться оценки в конце исследования, за исключением случаев повышения концентрации интересующего метаболита.

iv.    Максимальная доза составляет 50 % от максимальной дозы, используемой в экспериментах по однократному приему, т. е. приближена к минимальной летальной дозе, если подобные острые данные доступны по какой-либо иной причине (максимальная доза для микроядерных проб при однократном приеме, описанных в руководстве OEDC в качестве дозы, выше которой можно ожидать летальности), аналогичные рекомендации предоставляют и для других анализов in vivo (например. Hartmann et al.. 2003).

Выбор максимальной дозы на основании только коэффициента концентрации (многократное и клиническое воздействие) без признаков токсичности не является достаточно обоснованным.

Примечание 13

Это. как правило, актуально для раслространенных основ, таких как водный раствор метилцеллюлозы. но для таких основ, как Твин 80. вводимый объем может быть в 30 раз нижо. чем в острых экспериментах.

4.3.3    Испытуемые препараты, оказывающие токсическое действие на кровь и костный

мозг

Многие вещества, индуцирующие анеуплоидию, такие как мощные веретенные яды. определимы в микроядерных пробах костного мозга или крови in vivo только в узком диапазоне доз. приближенных к токсическим. Это справедливо и для некоторых кластогенов. В случае, если токсикологические данные свидетельствуют о тяжелой токсичности в отношении эритроцитов (например, выраженная супрессия

ГОСТ P 57130—2016

полихроматических эритроцитов (ПХЭ) либо ретикулоцитов). интервал между учитываемыми дозы должен быть не более чем в 2 раза ниже максимальной цитотоксической дозы. Если подходящие дозы не включены в исследование продолжительностью несколько недель, дополнительные данные могут помочь выявить анеугены и некоторые токсичные кластогены любым из следующих способов:

i.    По мере увеличения продолжительности терапии при выраженном нарастании токсичности рекомендовано раннее взятие образцов крови (на 3—4-й день). Например, если в микроядерной пробе в рамках многонедельного анализа используется кровь или костный мозг и ретикулоциты классифицируют. выраженная гематотоксичность может повлиять на способность к выявлению микроядер. т. е. доза, индуцирующая определимый рост микроядер после однократного введения, может быть чрезмерно токсичной в случае анализа при многократном введении (Hamada et al., 2001). Ранние образцы могут использоваться для обеспечения выявления кластогенов и потенциальных анеугенов (см. примечания 14 и 15).

ii.    Микроядерная проба в клетках млекопитающих in vitro.

iii.    Микроядерная проба в костном мозге при однократном введении.

П р и м о ч а н и о14

Необходимо с осторожностью подходить к токсикологическим исследованиям, включающим взятие дополнительных образцов крови, например, для определения концентраций. Кровотечение может привести к искажению результатов микроядерного анализа, поскольку эритропоэз. стимулируемый взятием крови, может спровоцировать рост числа микроядерных эритроцитов.

Примечание 15

Рост числа микроядор может произойти и без введения гонотоксичоского агента вследствие нарушения эритролоэза (например, регенеративная анемия, экстрамедуллярный гемопоэз, стресс и гипо- и гепертермия (анализ Twealsetal.. 2007,1)). В крови изменение функции селезенки, влияющее на клиренс микроядерных клепюк из крови, могло привести к незначительному росту циркулирующих микроядерных эритроцитов.

4.4 Демонстрация концентраций в целевых тканях при отрицательных результатах

анализов in vivo

Исследования in vivo играют важную роль в разработке стратегии исследований генотоксичности. Ценность результатов исследований in vivo напрямую связана с подтверждением достаточной концентрации испытуемого вещества в целевой ткани. Это особенно актуально при получении отрицательных результатов анализа in vivo, если испытания in vitro убедительно доказали наличие генотоксичных свойств или в случае, если не проводится анализ на клетках млекопитающих in vitro. Доказательством достаточной концентрации могут быть признаки токсичности в исследуемой ткани либо токсикокинети-ческие данные, представленные в следующем разделе.

4.4.1 В случае положительного результата испытания генотоксичности in vitro

(или если исследование не проводилось)

Оценка концентраций, достигнутых in vivo, должна проводиться при максимальной дозе или при других релевантных дозах на животных того же вида, линии и при аналогичном пути дозирования, используемого в рамках анализа генотоксичности. В случае, если оценку генотоксичности проводят в рамках токсикологических анализов, информация о концентрациях обычно доступна в рамках токсикологической оценки.

Оценка концентрации in vivo может проводиться по одному из следующих методов:

i.    Цитотоксичность:

a.    Для цитогенетических анализов: За счет достижения существенного изменения пропорции незрелых эритроцитов в числе общего пула эритроцитов в целевой ткани (костный мозг или кровь) в дозах и при времени пробоотбора в рамках микроядерной пробы или за счет измерения значительного снижения митотического индекса в рамках анализа хромосомных аберраций.

b.    Для других анализов генотоксичности in vivo: Токсичность в печени или изучаемых тканях, например, методом гистопатологической оценки или индикаторов токсичности по показателям биохимического анализа крови.

ii.    Воздействие препарата:

a.    Измерение материала препарата в крови и плазме. Ткани костного мозга характеризуются высокой перфузией, а уровень лекарственного материала в крови или плазме в целом аналогичен такому в костном мозге. Предполагается, что системное воздействие препаратов на печень наблюдается независимо от пути введения.

b.    Прямое измерение материала, связанного с препаратом, в целевых тканях, либо ауторадиографическая оценка тканевых концентраций.

11

Если системные концентрации одинаковы или ниже ожидаемой клинической концентрации, могут использоваться альтернативные стратегии, такие как:

i.    Использование иного пути введения:

ii.    Использование разных видов животных с более высокими концентрациями:

iii.    Использование иной ткани или анализа (см. раздел 2.3.4, «Ограничения по использованию стандартных испытаний in vivo»).

При невозможности достижения достаточной концентрации (например, вещества с малой степенью доступности в целевых тканях) традиционные испытания генотоксичности in vivo проводить нецелесообразно.

4.4.2 Отрицательные результаты испытаний генотоксичности in vitro

Если анализы in vitro не показывают генотоксического потенциала, in vivo (системную) концентрацию можно оценить одним из вышеуказанных методов или вычислить по результатам стандартных исследований всасывания, распределения, метаболизма и выведения (ADME) на грызунах, проводившихся в иных целях.

4.5    Пробоотбор/время проведения анализов in vivo

Выбор времени пробоотбора в микроядерных пробах in vivo и испытаниях хромосомных аберраций и испытаний UDS должен осуществляться в соответствии с OECD (1997).

В случае, когда микроядерный анализ интегрируют в исследования продолжительностью несколько недель, отбор образцов крови или костного мозга может производиться на следующий день после последнего введения (см. рекомендации в отношении дополнительного времени пробоотбора выше).

Для других анализов генотоксичности время пробоотбора следует выбирать в соответствии с конечными точками, например, анализ поломок ДНК/нитей ДНК обычно производят через несколько (например, через 2—6) часов после последнего введения дозы препарата несколько раз в сутки. В случае однократного введения два момента пробоотбора следует использовать через несколько часов и через 24 часа после окончания терапии.

В принципе исследования любой продолжительности можно считать приемлемыми, учитывая достаточность максимальной дозы / концентрации.

4.6    Количество анализируемых животных

Количество анализируемых животных определяют в соответствии с текущими рекомендациями в отношении микроядерной пробы (OECD) или иных анализов генотоксичности и, как правило, их общее число не соответствует числу животных, получавших терапию в рамках токсикологического исследования. Животные, используемые для анализа генотоксичности, должны в случайном порядке отбираться из группы животных в токсикологическом исследовании.

4.7    Использование самцов/самок грызунов в исследованиях генотоксичности in vivo

В случае проведения испытаний препаратов, применяемых с учетом пола, анализ может проводиться на животных соответствующего пола. Испытания in vivo с краткосрочным протоколом обычно проводятся на животных одного пола. При проведении краткосрочных испытаний может быть рассмотрена возможность использования животных обоих полов, если существующие данные о токсичности, метаболизме и концентрациях препарата (С^^ или AUC) указывают на токсикологически значимое межполовое различие у биологического вида, используемого при проведении испытаний. В противном случае для испытаний острой генотоксичности предпочтительнее использовать только самцов. В случае если испытание генотоксичности проводится в рамках токсикологического исследования многократных доз на животных обоего пола, образцы могут быть взяты у животных обоих полов, однако при отсутствии существенных межполовых различий в отношении токсичностиУметаболизма оценку следует проводить по животным одного пола. Уровень доз для животных, проходящих оценку, должен соответствовать критериям выбора необходимого уровня доз (см. разделы 4.3.2 и 4.3.3).

Аналогичные принципы применимы к другим анализам генотоксичности in vivo.

4.8    Путь введения

Путем введения обычно является ожидаемый клинический путь, т. е. перорально, внутривенно или подкожно, но он может быть соответствующим образом модифицирован для достижения необходимых системных концентраций, например, для препаратов топикального пути введения (см. раздел 2.3.4).

4.9    Использование положительного контроля в исследованиях in vivo

В исследованиях in vivo считается достаточным использовать положительный контроль лишь периодически, а не параллельно с каждым анализом после подтверждения компетентности лаборатории в отношении применения данного анализа (примечание 16).

ГОСТ P 57130—2016

Содержание

1    Область применения...................................................1

1.1    Общие принципы..................................................1

2    Набор стандартных тестов для оценки генотоксичности............................1

2.1    Общие подходы...................................................1

2.2    Описание двух вариантов стандартного набора тестов..........................3

2.3    Изменения стандартного набора тестов....................................4

2.4    Определение мутагенов зародышевых клеток................................5

3    Рекомендации в отношении тестов in vitro.....................................5

3.1    Повторение тестов и интерпретация их результатов............................5

3.2    Рекомендованный протокол выявления бактериальных мутаций....................5

3.3    Рекомендованные протоколы для проведения испытаний на клетках млекопитающих......6

4    Рекомендации по проведению испытаний in vivo.................................8

4.1    Тесты, проводимые с целью определения хромосомных повреждений in vivo............8

4.2    Другие испытания генотоксичности in vivo...................................9

4.3    Выбор доз в рамках анализа in vivo......................................10

4 4 Демонстрация концентраций в целевых тканях при отрицательных результатах анализов

in vivo.........................................................11

4.5    Пробоотбор/время проведения анализов in vivo..............................12

4.6    Количество анализируемых животных....................................12

4.7    Использование самцов/самок грызунов в исследованиях генотоксичности in vivo.........12

4.8    Путь введения...................................................12

4.9    Использование положительного контроля в исследованиях in vivo..................12

5    Рекомендации по оценке результатов испытаний и стратегий контрольных испытаний........13

5.1    Оценка биологической актуальности.....................................13

5.2    Оценка результатов, полученных в испытаниях in vitro..........................13

5.3    Оценка результатов, полученных в испытаниях in vivo..........................14

5.4    Стратегии последующей разработки при получении положительных результатов........15

5.5    Последующий анализ генотоксичности применительно к результатам опухолевого роста

в биологическом анализе канцерогенности................................16

6    Термины..........................................................16

Библиография........................................................19

Введение

Данный стандарт направлен на оптимизацию набора стандартных испытаний генотоксичности, обеспечивающих прогноз потенциального риска для человека, и описание общепринятых подходов к интерпретации результатов с конечной целью совершенствования оценки риска канцерогенных эффектов. связанных с изменением генетического материала. Стандарт содержит описание согласованных на международном уровне стандартных испытаний и подходов к интерпретации положительных результатов in vitro и in vivo, полученных при проведении стандартного набора тестов на генотоксичность, включая оценку нерелевантных результатов.

В стандарте учтены актуальные рекомендации последнего руководства Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) и отчеты Международных семинаров по испытаниям генотоксичности (IWGT). Отличия от рекомендаций OECD или IWGT, при их наличии, указанные в тексте стандарта. Стандарт применяется совместно с другими ГОСТ по лекарственным средствам для медицинского применения и (или) руководствами ЮН.

Настоящий стандарт идентичен Руководству ЮН S2 по изучению генотоксичности и интерпретации полученных данных для лекарственных препаратов для медицинского применения (ЮН S2 Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use) Международной конференции по гармонизации технических требований для регистрации лекарственных средств для медицинского применения (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use; ICH).

IV

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ Исследование генотоксичности и интерпретация полученных данных

Medicines for medical application, Genotoxicity testing and data interpretation

Дата введения — 2017—05—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется только на лекарственные средства для медицинского применения химического происхождения, то есть малых молекул, и не распространяется на биологические препараты. Рекомендации относительно времени проведения исследований в рамках клинической разработки представлены в ГОСТ Р 56701-2015.

1.1    Общие принципы

К испытаниям генотоксичности относятся тесты, проводимые in vitro и in vivo в целях выявления компонентов, индуцирующих генетическое повреждение вследствие различных механизмов. Данные испытания позволяют определить риск в отношении повреждения ДНК и фиксации. Фиксация повреждения ДНК в форме генных мутаций, более обширные хромосомные повреждения или рекомбинация, в целом необходимая для наследуемых эффектов и в рамках многоэтапного процесса развития злокачественного новообразования — сложного процесса, в рамках которого генетические изменения, возможно, играют роль лишь частично.

Числовые хромосомные изменения также были обусловлены туморогенезом и могут указывать на возможную анеуплоидию в зародышевых клетках.

Вещества, дающие положительный результат в испытаниях по определению подобных нарушений могут иметь канцерогенный и/или мутагенный потенциал для человека. Поскольку связь между концентрацией определенных препаратов и канцерогенезом установлена для человека, в то время как подобную связь трудно доказать для наследственных болезней, испытания генотоксичности применялись. главным образом, для установления канцерогенности. Несмотря на это. поскольку мутации зародышевой линии имеют четкую связь с заболеванием у человека, подозрение на то. что лекарственное вещество может провоцировать наследственные эффекты, считается не менее серьезным, чем подозрение на канцерогенные эффекты вещества. Кроме того, результаты исследований генотоксичности имеют большое значение для интерпретации исследований канцерогенности.

2    Набор стандартных тестов для оценки генотоксичности

2.1    Общие подходы

Регистрация лекарственных средств требует полноценной оценки генотоксического потенциала. Обширный анализ показал, что многие вещества, показавшие свойства мутагенности при проведении теста Эймса на обратную мутацию бактерий, являются канцерогенами для грызунов. Кроме того, испытания на тканях млекопитающих in vitro повышают чувствительность к детекции канцерогенов у грызунов и расширяют спектр выявляемых генетических нарушений, при этом снижая специфичность определения. т. е. повышают частоту положительных результатов, что не коррелирует с данными о канцероген-

Издание официальное

ности у грызунов. Кроме того, использование батарей тестов целесообразно, поскольку ни один тест отдельно не способен выявить все генотоксические механизмы развития туморогенеза.

Общие характеристики стандартной батареи тестов:

i.    Оценка мутагенности в виде теста обратной мутации бактерий. Данный тест позволяет выявить соответствующие генетические изменения и большинство канцерогенов человека и грызунов с генотоксическим потенциалом.

ii.    Генотоксичность также следует оценивать в клетках млекопитающих in vitro и/или in vivo следующим образом.

Несколько систем анализа клеток млекопитающих in vitro широко используются и могут считаться в достаточной степени валидированными. Анализ хромосомных аберраций в метафазе in vitro, микроя-дерные пробы in vitro (примечание 1) и анализ генных мутаций клеток лимфомы мышей L5178Y 77с (тими-динкиназы) (MLA). Данные три анализа в настоящее время считают в одинаковой степени актуальными, а следовательно, и взаимозаменяемыми при анализе повреждения хромосом при использовании в сочетании с другими испытаниями генотоксичности в рамках стандартной батареи тестов лекарственных средств, в случае если используются протоколы испытаний, представленных в настоящем стандарте.

Примечание 1

Микроядерная проба in vitro широко изучалась в рамках международных совместных исследований (Kirsch-Volders et al.. 2003), is validated by ECVAM (Corvi et at.. 2008), и описана в руководстве OEC 487 (2010).

Испытания in vivo включены в батарею тестов, поскольку некоторые вещества показывают мутагенность in vivo, но не in vitro (примечание 2), а также потому, что желательно включить анализы, учитывающие такие факторы, как всасывание, распределение, метаболизм и выведение. Поданной причине также проведен выбор анализа микрочастиц в эритроцитах (в крови и костном мозге) или хромосомных аберраций в клетках костного мозга в метафазе (примечание 3). Лимфоциты, культивируемые от животных. получавших лечение, также могут использоваться для цитогенетического анализа, несмотря на ограниченный опыт проведения подобного анализа.

Примечание 2

Имеется нобопьшоо. но значитопьноо количество гонотоксичоских канцерогенов, которые возможно надежно выявить в анализах хромосомных поломок, но которые показали отрицательные/слабоположитель-ные/сомнительные результаты в анализах in vitro в стандартной батарее. Канцерогены, такие как прокарбазин. гидрохинон, уротан и бензин, попадают в эту категорию. Некоторые другие примеры, попучонныо по результатам исследования, проведенного компаниями, описаны Twoats eta!.. 2007. II.

Примечание 3

В принципе, микроядра в гемопоэтических клетках можно исследовать на костном мозге любого биологического вида и в крови тех животных, которые не отфильтровывают циркулирующие микроядерные эритроциты в солвзонко. У лабораторных мышой микроядра измеряют в полихроматических эритроцитах крови, а при терапии мышей продолжительностью 4 недоли и более могут использоваться зрелые (нормохроматические) эритроциты. Несмотря на то, что в организме крыс микроядерные эритроциты быстро покидают кровоток, было установлено, что в ротикупоцитах крови крыс обнаруживается микроядерная индукция, обусловленная целым рядом кластогонов (Wakata ot al.. 1998. Hamada ot al.. 2001). Кровь крыс может использоваться для микро-ядерного анализа, учитывая методы, используемые для обеспечения анализа вновь сформированных ретикуло-цитов (Hayashi et al.. 2007. MacGregor et al.. 2006). при достаточно большом размере выборки для обеспечения статистической чувствитолыюсти при более низком уровне микроядер в крови крыс, по сравнению с костным мозгом (Kisslingetal.. 2007). Независимо от выбранного метода, анализа в костном мозге или в крови, автоматизированного или ручного анализа, каждая лаборатория должна устанавливать соответствующий размер выборки для обеспечения уровня ошибки ниже уровня вариативности между животными.

В настоящее время имеется определенный опыт микроядерной индукции в организме собак и макак-резус (Harper ot al.. 2007: Hotchkiss et al.. 2008). Одним из примеров по/юзности данного альтернативного вида может быть оценка метаболита чоловока. в недостаточной степени представленного у грызунов, но сформированного у собак и макак.

Испытания in vitro и in vivo для оценки хромосомных аберраций клеток в метафазе выявляют широкий спектр нарушений хромосомной целостности. Поломка хроматид или хромосом может привести к формированию микроядер в случае образования ацентрического фрагмента, поэтому анализы, позволяющие определить хромосомные аберрации или микроядра, подходят для выявления кластогенов. Микроядра могут образоваться вследствие задержки одной или нескольких цельных хромосом в анафазе, поэтому микроядерные пробы потенциально позволяют определить некоторые индукторы анеуплои-дии. MLA позволяет выявить мутации гена Тк, обусловленные генными мутациями и хромосомными

ГОСТ P 57130—2016

повреждениями. Имеются сведения о том. что при помощи MLA также возможно выявить утрату хромосом.

Существуют некоторые дополнительные анализы in vivo, которые можно использовать в рамках батареи тестов или в качестве дополнительных тестов для получения необходимого объема доказательств при оценке результатов анализов in vitro и in vivo (см. ниже). Отрицательных результатов соответствующих анализов in vivo (обычно двух) с достаточным обоснованием конечных точек и демонстрацией концентраций (см. раздел 4.4) обычно оказывается достаточно для подтверждения отсутствия существенного риска генотоксичности.

2.2 Описание двух вариантов стандартного набора тестов

Следующие два варианта стандартной батареи тестов считаются в равной степени приемлемыми (примечание 4):

Вариант 1

i. Испытание генных мутаций в бактериях.

й. Цитогенетический тест хромосомных повреждений (анализ хромосомных аберраций в метафазе in vitro или микроядерная проба in vitro) либо анализ генных мутаций Тк в лимфоме мышей in vitro.

iii. Тест генотоксичности in vivo, обычно тест на хромосомные поломки на гемопоэтических клетках мышей в виде либо микроядерной пробы, либо анализа на хромосомные аберрации в метафазе.

Вариант 2

i. Испытание генных мутаций в бактериях.

и. Оценка генотоксичности in vivo двух разных тканей, обычно микроядерная проба с использованием гемопоэтических клеток грызунов и второй анализ in vivo. Как правило, используется анализ поломки нитей ДНК в печени, если не указано иного (см. ниже, раздел 2 и примечание 12).

Примечание 4

Несмотря на возможность использования обоих вариантов батареи тостов, конкретные данные об индивидуальном испытуемом веществе могут свидетельствовать о предпочтительности одного из вариантов. Например, если системные концентрации в моделях животных равны либо менее ожидаемой клинической концентрации. могут использоваться анализы in vitro: вариант 1 (см. также разделы 2.3.4 и 4.4.1). С другой стороны. вариант 2. включая испытания в печени, рекомендован в случаях, когда предполагается, что в печени генерируются короткоживущие реактивные метаболиты.

Исторически опыт выбора варианта 1 шире, отчасти потому, что он основан на версии S2A и В Однако аргументами в пользу взаимозаменяемости вариантов 1 и 2 включают: при получении положительного результата анализа на клетках млекопитающих in vitro, четкие отрицательные результаты двух проведенных анализов in vivo в соответствующих тканях при подтвержденной достаточной концентрации считаются достаточными для подтверждения отсутствия генотоксического потенциала in vivo (см. пункт 5.4.1.1). Таким образом, стратегия проведения анализа, при которой проводятся два анализа in vivo, аналогична стратегии контроля положительного результата in vitro (примечание 4).

При проведении испытаний в разных вариантах может использоваться дизайн исследований in vivo острой или хронической токсичности. При многократном введении предпринимались попытки включить конечные точки генотоксичности в исследования токсичности, с учетом научной обоснованности. При оценке in vivo нескольких конечных точек предпочтительнее включать их в одно исследование. Зачастую имеется достаточно информации о вероятной пригодности доз в рамках исследования длительной токсичности до начала исследования, позволяющих определить целесообразность проведения острого теста или комплексного испытания.

В случае получения отрицательных результатов использование одного из вариантов стандартной батареи тестов, проводимых и оцениваемых в соответствии с текущими рекомендациями, обеспечит достаточные доказательства отсутствия генотоксической активности и в этом случае дополнительных тестов не требуется. В случае получения положительных результатов стандартной батареи тестов в зависимости от их терапевтической пользы, вещество подлежит более тщательному исследованию (см. раздел 5).

Несколько анализов in vivo могут быть использованы во второй части оценки in vivo в рамках варианта 2 (см. раздел 4.2). некоторые из которых могут быть интегрированы в исследования токсичности многократных доз. Предпочтительной тканью является печень, благодаря характеристикам достигаемых концентраций и метаболизма, но выбор ткани для анализов in vivo и видов анализов должен быть основан на понимании потенциального механизма метаболизма in vivo или тканей, подверженных воздействию.

Информацию о числовых изменениях можно получить в результате анализов на клетках млекопитающих in vitro и микроядерных проб in vitro или in vivo. Элементы стандартных протоколов, способные

3

указывать на подобный потенциал, включают повышение митотического индекса, индукцию полиплоидии и микроядерную оценку. Также имеются экспериментальные доказательства того, что в результате MLA могут быть выявлены веретенные яды. Предпочтительным цитогенетическим тестом in vivo в соответствии с вариантом 2 является микроядерный анализ, а не тест на хромосомные аберрации, поскольку он имеет больше возможностей для выявления утраты хромосом (потенциал анеуплоидии).

Предполагаемый стандартный набор тестов не подразумевает, что другие тесты генотоксичности являются несостоятельными или нецелесообразными. Для дальнейшего исследования результатов анализа генотоксичности, полученных в результате применения стандартной батареи тестов, могут потребоваться дополнительные анализы (см. разделы 4.2 и 5). Также при условии достаточной валидации могут использоваться другие виды животных, включая не относящихся к грызунам.

При условиях, при которых один или несколько тестов в стандартной батарее не могут быть использованы по техническим причинам, альтернативные валидированные тесты могут обеспечить адекватную замену при условии достаточного научного обоснования.

2.3 Изменения стандартного набора тестов

В следующих разделах представлены ситуации, в которых может потребоваться модификация стандартного набора тестов.

2.3.1    Поисковые клинические исследования

В некоторых поисковых клинических исследованиях может использоваться меньше анализов генотоксичности либо различных критериев обоснования максимальной дозы in vivo.

2.3.2    Испытуемые препараты с бактериотоксическим действием

В случае, если вещество имеет бактериотоксические свойства (например, некоторые антибиотики), тем не менее, следует провести тест Эймса на обратную мутацию бактерий, кроме того, должно проводиться испытание цитотоксических веществ в клетках млекопитающих, поскольку мутагенность может возникать при более низких и менее токсичных концентрациях. В подобных случаях также следует провести один из анализов в клетках млекопитающих in vitro, т. е. следует проводить анализы по 1-му варианту.

2.3.3    Вещества, по своей структуре имеющие генотоксический потенциал

Вещества с подозрительной структурой (примечание 5) обычно выявляются в рамках стандартного набора тестов, поскольку большинство структурно подозрительных веществ определяют в контексте бактериальной мутагенности. Известно несколько химических классов веществ, которые лучше поддаются определению в рамках анализа повреждения хромосом в клетках млекопитающих, по сравнению с анализами бактериальной мутации. Таким образом, отрицательные результаты проведения стандартного набора тестов для вещества с подозрительной структурой обычно учитывают достаточное доказательство отсутствия генотоксичности. Однако для веществ с подозрительной структурой может быть целесообразна модификация стандартных протоколов (примечание 5). Выбор дополнительных тестов или модификации протокола зависит от химического состава, химической активности и данных о метаболизме вещества с подозрительной структурой.

Примечание 5

Установпвно. что некоторые структурно настораживающие химические соединения имеют причинную связь с канцерогенным и/или мутагенным потенциалом химических препаратов. Примеры вощоств с опасной структурой включают алкилирующие электрофильные центры, нестабильные эпоксиды, ароматические амины. азо-структуры. N-нитрозогруппы и ароматические нитрогруппы (Ashby and Paton. 1994). Дпя некоторых классов вощоств со специфическими рисками установлено, что специфическая модификация протокола/допол-нитольныо испытания необходимы для оптимального выявления генотоксичности (например, молекулы, содержащие азогруппу, гликозиды. такие компоненты как нитроимидазолы, которым для активации необходима нитрородукция. такие вощоства как фенацетин, требующие для метаболической активации другого вида грызунов S9).

2.3.4    Ограничения по применению тестов in vivo

Существует множество веществ, в отношение которых тесты in vivo (обычно в костном мозге, крови или печени) не дают полезной дополнительной информации. К ним относятся вещества, в отношении которых данные о токсикокинетике и фармакокинетике указывают на отсутствие их системной абсорбции, а следовательно, они не попадают в целевые ткани. Примерами таких веществ являются рентгеноконтрастные вещества, антациды на основе алюминия, некоторые ингаляционные препараты, а также лекарственные средства кожного или иного топикального применения. В случаях, когда модификация пути введения не обеспечивает достижения достаточной концентрации в целевых тканях, и если нет воз-

4

ГОСТ P 57130—2016

можности провести подходящий анализ генотоксичности в наиболее подверженной воздействию ткани, может быть целесообразным в оценке опираться только на исследования in vitro. В некоторых случаях целесообразно проведение оценки генотоксических эффектов в участке контакта, при том что подобные исследования до сих пор не получили широкого распространения (примечание 6).

Примечание 6

Имеется определенный опыт анализов in vivo микроядорной индукции в коже и толстой кишке (Hayashi ot а!.. 2007). и анализы поломки ДНК в этих тканях также могут быть целесообразным заменителем.

2.4 Определение мутагенов зародышевых клеток

Результаты сравнительных исследований показали, что в количественном отношении большинство мутагенов зародышевых клеток могут быть обнаружены по генотоксичности в испытаниях соматических клеток, так что отрицательные результаты испытаний генотоксичности соматических клеток in vivo в целом указывают на отсутствие эффектов со стороны зародышевых клеток.

3 Рекомендации в отношении тестов in vitro

3.1    Повторение тестов и интерпретация их результатов

Воспроизводимость результатов тестов — важнейший аспект исследований, проводимых с использованием инновационных методов или неожиданных результатов, однако плановый анализ препаратов с использованием стандартных широко применяемых испытаний генотоксичности зачастую не требует повторного проведения. Данные тесты в достаточной степени характеризованы и имеют достаточный внутренний контроль, такчто повторение тестов сопределенно положительным или отрицательным результатом анализа, как правило, не требуется. В идеале должна быть возможность указать, что в результате проведения теста были достигнуты определенно отрицательные или определенно положительные результаты. Однако результаты испытаний иногда не удовлетворяют установленным критериям положительного или отрицательного результата и. таким образом, их считают «сомнительными». Применение статистических методов анализа может улучшить интерпретацию данных, при этом достаточная биологическая интерпретация имеет критически важное значение. При повторном проведении теста, в результате которого был достигнут сомнительный результат, может быть достигнут (i) определенно положительный результат, тогда общий результат будет положительным, (ii) отрицательный результат, в этом случае результат будет признан невоспроизводимым, а следовательно, и общий результат испытания будет отрицательным, или (iii) еще один сомнительный результат, при котором общий результат остается сомнительным.

3.2    Рекомендованный протокол выявления бактериальных мутаций

Рекомендации по протоколу представлены в руководстве OECD (1997) и отчете IWGT (Gatehouse et al., 1994).

3.2.1    Выбор высоких доз

Максимальные дозы

Максимальная рекомендованная доза составляет 5000 мкг/тарелка (для испытуемых веществ в жидкой форме), без ограничений, обусловленных свойствами растворимости или цитотоксичности.

Предел растворимости

Для бактериальных культур проводят оценку преципитирующих доз при условии, что преципитат не влияет на обработку, токсичность не является лимитирующей, а максимальная концентрация не превышает 5000 мкг/тарелка (или 5 мкл/тарелка — для испытуемых веществ в жидкой форме). В отсутствие наблюдаемой цитотоксичности самую низкую преципитирующую дозу следует использовать в качестве максимальной. Если отмечается цитотоксичность или мутагенность, независимо от растворимости, максимальная доза должна быть установлена с учетом цитотоксичности, как описано ниже.

Предел цитотоксичности

В тесте Эймса установленные дозы должны показывать признаки значительной токсичности, при этом не превышая максимальной дозы 5000 мкг/тарелка. Токсичность может быть установлена по снижению числа ревертантов и/или очистка, и/или уменьшение бактериального газона.

3.2.2    Дизайн исследования/протокол тестов

Рекомендованный набор бактериальных штаммов (OECD) включает штаммы, позволяющие определить замещение основания и мутации со сдвигом рамки считывания следующим образом:

- Salmonella typhimurium ТА98;

5

-    Salmonella typhimurium ТА100;

-    Salmonella typhimurium TA1535;

-    Salmonella typhimurium!A1537 илиТА97, илиТА97а;

-    и Salmonella typhimurium TA102 или Escherichia coli WP2 uvrA, или Escherichia coli WP2 uvrA (pKMIOl).

Одним из отличий от рекомендаций, изложенных в OECD и IWGT. является то. что по имеющемуся опыту испытаний лекарственных средств, однократного теста Эймса оценки обратных бактериальных мутаций достаточно при определенно отрицательном или положительном результате, а также при условии проведения испытания в полном соответствии с протоколом, включая все штаммы с метаболической активацией и без нее. соответствующий диапазон доз. удовлетворяющий критериям для выбора максимальной дозы и соответствующий положительный и отрицательный контроль. Кроме того, при испытании лекарственных средств как включение тарелки, так и метод предварительной инкубации может быть целесообразен для данного однократного эксперимента (примечание 7). Спорные или слабоположительные результаты могут указывать на целесообразность повторного проведения испытания. возможно в рамках модифицированного протокола, например, с установлением соответствующих интервалов между уровнями доз.

Примечание 7

Некоторые химические вещества проще выявить при помощи высевания в торопки или мотодом продва-ритопьной инкубации несмотря на то. что различия носят обычно количественный, а но качественный характер (Gatehouse etal.. 1994). Опыт в фармацевтической области, в рамках которого препараты изучали в рамках обоих протоколов, не привели к получению разных результатов для двух методов, и в отчете IWG Т (Gatehouse ot а!.. 1994) примеры химических классов, которые причислены к болоо просто определяемым в рамках протокола преинкубации, обычно не относятся к классу лекарственных средств и показывают положительный результат в исследованиях генотоксичности in vivo. К ним относятся короткоцепочечные алифатические нитрозамины. двухвалонтныо металлы, альдегиды (например, формальдегид, кротональдегид). азокраситоли (например, желтый краситель для масла), пирролизидиновыо алкалоиды, аллилные вещества (аллилизотиоци-анат. аллилхлорид) и нитровещества (ароматические, алифатические).

3.3 Рекомендованные протоколы для проведения испытаний на клетках млекопитающих

Рекомендации по протоколам изложены в руководстве OECD (1997) и в публикациях IWGT (например. Kirsch-Volders et al., 2003; Moore et al.. 2006). Также имеются рекомендации no интерпретации результатов MLA (Moore et al.. 2006). включая применение глобального поправочного коэффициента. Здесь приведены некоторые различия от приведенных здесь рекомендаций при испытании лекарственных средств, в частности, при выборе максимальной концентрации (см. подробности ниже).

3.3.1 Выбор максимальной концентрации

Максимальная концентрация

Максимально рекомендованная концентрация составляет 1 мМ или 0.5 мг/мл. в зависимости от того, что ниже, при отсутствии ограничений, обусловленных растворимостью в растворителе или питательной среде или цитотоксичностью (примечание 8).

Примечание 8

Обоснование максимальной концентрации 1 мМ для анализов в клетках млекопитающих in vitro включает следующие компоненты. Батарея тестов включает тест Эймса и анализ in vivo. Данная батарея позволяет оптимизировать определение генотоксических канцерогенов, не опираясь на результаты отдельных тостов. Существует низкая вероятность того, что соответствующие вещества (канцерогены, повреждающие ДНК), не выявляемые в тесте Эймса или анализе генотоксичности in vivo, определимы в анализе в клетках млекопитающих in vitro в концентрациях болев 1 мМ. Во-вторых, предельный уровень 1 мМ позволяет поддержать идентификацию элемента риска выше клинического воздействия известных лекарственных средств, включая вещества, концентрирующиеся в тканях (Goodman & Gilman, 2001), что также выше уровней, обычно достигаемых в доклинических исследованиях in vivo. Подтверждено, что в случае некоторых препаратов для достижения терапевтического эффекта требуются достаточно высокие клинические концентрации. Хотя спонсорам может быть интересно сравнение активности с зарегистрированными препаратами, возможно, даже свыше 1 мМ. для определения безопасности для человека наибольшую актуальность имеют анализы in vivo. Для лекарственных средств с нестандартно низкой молекулярной массой (например, меноо 200) следует рассмотреть возможность достижения более высоких концентраций исследуемого препарата.

Предел растворимости

В случае ограничивающих характеристик растворимости максимальной концентрацией, при условии ограничения со стороны цитотоксичности, должна быть наиболее низкая концентрация, при которой в культурах присутствует минимальный осадок, при условии отсутствия побочного влияния на расшиф-

6