ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫМ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, КОРМА, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения содержания бета-ад рености муляторов с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2011

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»), Федеральным государственным учреждением «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» (ФГУ «ЦНМВЛ»)

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3    УТВЕРЖДЕН Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. № 646-ст

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2011

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

6.3.4    При отсутствии дейтерированных производных бета-адреностимуляторов используют метод абсолютной градуировки. Градуировочные растворы бета-адреностимуляторов (не менее трех уровней массовой концентрации от 1 до 100 нг/см³ на пробу) вносят в заведомо чистые матрицы на стадии внесения внутреннего стандарта также, как для метода с дейтерированными производными. Каждый градуировочный уровень анализируют не менее двух раз.

6.3.5    Расчеты коэффициента отклика и площади пика выполняют с помощью системы обработки данных в автоматическом режиме.

6.3.6    Градуировочную характеристику считают приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение квадрата коэффициента корреляции для каждого бета-адреностимулятора >0,98, а значение «Accuracy» для каждой точки градуировочной кривой находится в диапазоне 80%—120%.

6.3.7    Построение новой градуировочной кривой проводят после каждого включения газового хроматографа (остановка работы для сервисного обслуживания или текущей профилактики).

6.4 Условия хроматографических измерений

6.4.1    Газовый хроматограф с масс-спектрометрическим детектором включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры, рекомендуемые изготовителем капиллярных колонок. Например, для кварцевой капиллярной колонки 30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм применяют следующие хроматографические условия:

-    газ-носитель — гелий;

-    скорость потока газа-носителя 0,8 см³/мин;

-    температура инжектора 280 °С;

-    инжектор в режиме без деления потока;

-    температурная программа колонки:

начальная температура 100 °С в течение 0,5 мин;

программируемый нагрев от 100 °С до 200 °С со скоростью 25,0 °С/мин;

программируемый нагрев от 200 °С до 225 °С со скоростью 4,0 °С/мин;

программируемый нагрев от 225 °С до 270 °С со скоростью 20,0 °С/мин;

-    изотерма при температуре 270 °С до 20 мин;

-    время анализа 20 мин;

-    объем пробы от 1 до 5 мм³.

Допускается использование других хроматографических условий, обеспечивающих разделение компонентов пробы.

6.4.2    Градуировку и настройку масс-спектрометрического детектора в режиме электронной ионизации и тандемной масс-спектрометрии проводят согласно инструкции по эксплуатации прибора.

7 Отбор проб

7.1    Отбор проб

7.1.1    Отбор проб мяса и мясных продуктов, включая мясо и продукты из мяса птицы, — по ГОСТ Р 51447.

7.1.2    Объем отбираемых проб мочи должен быть не менее 40 см³.

Объем отбираемых проб желчи должен быть не менее 30 см³.

Масса отбираемых проб пигментированной шерсти, не менее 10 г.

Отобранные пробы мочи и желчи при отсутствии возможности испытания в день отбора замораживают при температуре минус 20 °С.

7.1.3    Отбор проб комбикормов — поГОСТ 13496.0.

7.2 Подготовка проб

7.2.1    Обработка проб органов, тканей, мочи, желчи, шерсти животных и кормов

7.2.1.1    100 г мышечной ткани, предварительно очищенной от грубой соединительной ткани, измельчают на гомогенизаторе и взвешивают на весах по 10,0 г гомогенизированной пробы в двух флаконах вместимостью по 40 см³. Во флаконы добавляют 20 см³трис-буфера (6.1.1), 10 мг протеолитического фермента и пипеточным дозатором вносят по 50 мм³ раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см³.

Флаконы закрывают крышкой с тефлоновой прокладкой и помещают на нагревательный модуль с магнитной мешалкой при температуре 55 °С на 3 ч. Затем флаконы с полученным гидролизатом охлаждают до комнатной температуры, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 5,0 хлор-

ной кислотой. Флаконы с пробами помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 4 °С. Полученный супернатант переносят в стеклянные флаконы вместимостью по 40 см³. Осадок повторно экстрагируют 5 см³ фосфатного буферного раствора (6.1.2). Полученные гидролизаты объединяют, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до

6.0    хлорной кислотой, помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, фильтруют через мембранный фильтр.

7.2.1.2    Пробу печени или почек измельчают на гомогенизаторе и взвешивают на весах по 10,0 г гомогенизированной пробы в двух флаконах вместимостью 40 см³. Во флаконы добавляют по 20 см³ фосфатного буферного раствора (6.1.2), измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до

5.0    раствором гидроокиси калия (6.1.8) молярной концентрации с = 1 моль/дм³ или 25 %-ным водным раствором соляной кислоты (6.1.12). Пипеточным дозатором вносят по 50 мм³ смеси дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см³ и ставят флаконы на ультразвуковую баню на 20 мин при температуре 40 °С. Затем пробы переносят на шейкер, гомогенизируют 30 секи охлаждают до комнатной температуры. Флаконы с пробами помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 4 °С. Затем во флаконы приливают 5 см³ фосфатного буферного раствора (6.1.2), экстрагируют 30 с на шейкере и центрифугируют. Экстракты объединяют, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 5,0 раствором гидроокиси калия молярной концентрации с = 1 моль/дм³ (6.1.8) или 25 %-ным водным раствором соляной кислоты (6.1.12). Пипеточным дозатором в экстракты вносят по 50 мм³ пищеварительного сока Helix pomatia, помещают на нагревательный модуль с магнитной мешалкой при температуре 40 °С на 15 ч. После гидролиза пробу охлаждают до комнатной температуры, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 6,0 25 %-ным водным раствором соляной кислоты (6.1.12). Гидролизат центрифугируют и фильтруют через мембранный фильтр.

7.2.1.3    Во флакон вносят 10 см³ мочи, 10 см³ ацетатного буферного раствора (6.1.4), 50 мм³ пищеварительного сока Helix pomatia, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 5,0 раствором гидроокиси калия молярной концентрации с = 1 моль/дм³ (7.2.8) или 25 %-ным водным раствором соляной кислоты (6.1.12). Пипеточным дозатором вносят по 50 мм³ смеси дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см³ и ставят флаконы на нагревательный модуль при температуре 40 °С на 15 ч для ферментативного гидролиза коньюгатов. Гидролизат охлаждают до комнатной температуры, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 6,0 25 %-ным водным раствором соляной кислоты (6.1.12), фильтруют через мембранный фильтр.

7.2.1.4    Во флакон вносят 5 см³ желчи, 15 см³ ацетатного буферного раствора (6.1.4), 100 мм³ пищеварительного сока Helix pomatia. Далее проводят обработку пробы в соответствии с 7.2.3.

7.2.1.5    Сетчатку отделяют от глазного яблока, помещают во флакон вместимостью 40 см³ и взвешивают на весах. На каждые 50 мг сетчатки добавляют 1 см³ фосфатного буферного раствора (6.1.2). Затем гомогенизируют 30 с на гомогенизаторе конфигурации ротор-статор. Во флаконы вместимостью 40 см³ вносят по 1 см³ гомогенизированной пробы и добавляют по 9 см³ ацетатного буферного раствора (6.1.4). Пипеточным дозатором вносят 50 мм³ пищеварительного сока Helix pomatia и по 50 мм³ смеси дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации с= 10 нг/см³. Закрывают флаконы крышкой с тефлоновой прокладкой и помещают на нагревательный модуль с магнитной мешалкой на 15 ч при температуре 40 °С. Полученный гидролизат охлаждают до комнатной температуры, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 6,0 раствором гидроокиси натрия молярной концентрации с = 10 моль/дм³ (6.1.9). Флаконы с пробами помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 4 °С. Г идролизат фильтруют через мембранный фильтр.

7.2.1.6    100 г кормов измельчают на гомогенизаторе и взвешивают на весах по 10,0 г гомогенизированной пробы в двух флаконах вместимостью 40 см³. Во флаконы добавляют 25 см³ соляной кислоты молярной концентрацией с = 0,01 моль/дм³ (6.1.11). Пипеточным дозатором вносят по 50 мм³ смеси дей-терированныхстандартныхобразцов массовой концентрации 10 нг/см³. Флаконы помещают в шейкер на 30 мин, а затем центрифугируют. Надосадочный слой переносят во флакон вместимостью 40 см³, добавляют 5 см³ н-Гексана, экстрагируют два раза по 2 мин, отбрасывая гексановые фракции. Измеряют pH водного остатка и, при необходимости, доводят значение pH до 6,0 раствором гидроокиси натрия молярной концентрации с = 10 моль/дм³ (6.1.9), помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 4 °С. Экстракт фильтруют через мембранный фильтр.

7.2.1.7    10 г пигментированной шерсти промывают 0,2 %-ным водным раствором твин 20 и деионизованной водой, высушивают в сушильном шкафу при температуре 40 °С и измельчают ножницами на отрезки размером от 1 до 2 мм. Измельченную шерсть взвешивают на весах и по 1,0 г помещают в два флакона вместимостью 40 см³. Во флаконы добавляют по 20 см³ раствора гидроокиси натрия молярной

концентрации с = 2 моль/дм³ (6.1.10). Затем во флаконы вносят пипеточным дозатором по 50 мм³ смеси дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации с = 10 нг/см³.

Флаконы ставят на нагревательный модуль с магнитной мешалкой на 1 ч при температуре 85 °С. Затем охлаждают до комнатной температуры, добавляют 10 см³ метил-третбутилового эфира, экстрагируют два раза по 5 мин, собирая эфирную фракцию в выпарительную колбу вместимостью 100 см³. Для полного отделения метил-третбутилового эфира флаконы помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем во флаконы вносят по 5 г натрия хлористого, перемешивают и повторно экстрагируют дважды по 5 мин с 10 см³ смеси этилового эфира уксусной кислоты и изопропилового спирта в соотношении 60:40. Объединенные экстракты упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. К сухому остатку приливают 10 см³ фосфатного буферного раствора (6.1.3) и помещают на 1 мин на ультразвуковую баню. Экстракт фильтруют через мембранный фильтр.

7.3 Очистка подготовленных проб методом твердофазной экстракции (ТФЭ)

Картриджи для твердофазной экстракции вместимостью 6 см³ с 0,5 г сорбента С18 40 мкм кондиционируют на вакуумном устройстве для ТФЭ, пропуская последовательно: 4 см³ метанола, 1 см³ деионизованной воды, 3 см³ фосфатного буферного раствора молярной концентрации с = 0,1 моль/дм³ (6.1.3). Пропускают через картридж пробу, полученную в соответствии с 7.2.1.1—7.2.1.7, в фосфатном буфере (на всех этапах ТФЭ, кроме этапов сушки, вакуум не применяют). Промывают картридж последовательно два раза фосфатным буферным раствором по 2 см³, раствором уксусной кислоты молярной концентрации с = 1 моль/дм³— 1 см³ и затем сушат картридж в вакууме 20 мин. Далее промывают картридж 2 см³ метанола и снова сушат в вакууме 10 мин. Элюируют аналиты раствором аммиака в изопропиловом спирте (6.1.6). Упаривают элюат на ротационном испарителе при температуре не выше 45 °С. Остаток перерастворяют в 1 см³ абсолютного этанола и переносят во флакон вместимостью 4 см³. Упаривают этанол досуха в токе азота на нагревательном модуле при температуре от 35 °С до 40 °С не менее 1 ч.

Каждую новую партию сорбента необходимо тестировать поописанной процедуреТФЭ. Притести-ровании используют стандартные растворы бета-адреностимуляторов известной молярной концентрации в фосфатном буферном растворе (6.1.3). Модифицируют только два этапа: объем метанола на стадии промывки сорбента (критично для анилиновых бета-адреностимуляторов) и объем элюирующего раствора на последней стадии (критично для бета-адреностимуляторов фенольного типа).

8 Порядок выполнения измерений

8.1    Дериватизация бета-адреностимуляторов

8.1.1    Для получения триметилсилиловых производных бета-адреностимуляторов к сухому остатку после ТФЭ очистки по 7.3 пипеточным дозатором приливают 50 мм³ смеси МСТФА/ТМИС/ДТЭ (6.1.5). Помещают флаконы в нагревательный модуль на 60 мин при температуре 60 ^ЧС. По истечении указанного времени реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, переносят в стеклянные флаконы вместимостью 2 см³ с вставками на 100 мм³ и используют для ГХ-МС анализа.

8.1.2    Для двухстадийной дериватизации к сухому остатку после ТФЭ очистки, пипеточным дозатором приливают 50 мм³ раствора метилборной кислоты в этиловом эфире уксусной кислоты (6.1.7). Полученную реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 20 мин. По истечении указанного времени от 1 мм³ до 2 мм³ реакционной смеси вводят в хромато-масс-спектрометр. Получают хроматограмму циклических метилборатов.

Затем реакционную смесь упаривают досуха и к сухому остатку добавляют 50 мм³ раствора БСТФА/ТМХС (6.1.5). Полученную реакционную смесь помещают в нагревательный модуль при температуре 60 °С на 30 мин. По истечении указанного времени реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, переносят в стеклянные флаконы вместимостью 2 см³ с вставками на 100 мм³ и используют для ГХ-МС анализа.

8.2    ГХ-МС анализ

8.2.1    В инжектор хроматографа вводят по 1—5 мм³ анализируемой пробы и проводят анализ в условиях, указанных в 6.4. Проводят не менее двух определений для каждой анализируемой пробы.

8.2.2    Время удерживания бета-адреностимуляторов определяют при анализе градуировочных растворов. Время удерживания идентифицированных бета-адреностимуляторов в анализируемой пробе не должно отличаться от времени удерживания бета-адреностимуляторов в градуировочном растворе более чем на 2,5 %.

8.2.3    Данные о диагностических ионах триметилсилиловых производных бета-адреностимуляторов приведены в таблице 2.

Таблица 2 — Диагностические ионы триметилсилиловых производных бета-адреностимуляторов

Наименование бета-адреностимулятора N Мо Md Диагностические ионы Кленбутерол 1 276 348 86/262/243/333 Кленбутерол-Цб 1 282 354 92/262/246/339 Кленбутерол 2 276 420 86/300/335/405 Кленбутерол-Цб 2 282 426 92/300/335/411 Сальбутамол 3 239 455 86/294/369/440 Сальбутамол-Цб 3 245 461 92/295/369/446 Тербуталин 3 225 442 86/356/371/426 Мапентерол 1 324 396 100/277/291/296 Мапентерол 2 324 468 100/364/369/453 Цимбутерол 1 233 305 86/200/219/234 Цимбутерол-ЦЭ 1 242 314 95/206/219/234 Цимбутерол 2 233 377 86/272/291/362 Цимбутерол-ЦЭ 2 242 386 95/278/291/371 Примечание — В таблице использованы следующие условные обозначения: N — число ТМС групп в молекуле производного; М0 — молекулярная масса; Md — молекулярная масса ТМС производного.

8.2.4 Данные о диагностических ионах метилборатов бета-адреностимуляторов приведены в таблице 3.

Таблица 3 — Диагностические ионы метилборатов бета-адреностимуляторов

Наименование бета-адреностимулятора N Мо Md Диагностические ионы Кленбутерол 1 276 300 243/245/285/287 Кпенбутерол-бб 1 282 306 246/248/288/290 Сальбутамол 2 239 287 229/230/271/272 Сальбутамол-бб 2 245 293 232/233/274/275 Мапентерол 1 324 348 277/279/291/319 Цимбутерол 1 233 257 158/200/241/242 Цимбутерол-ЦЭ 1 242 266 159/206/247/248 Примечание — В таблице использованы следующие условные обозначения: N — число МБ-групп в молекуле производного; М0 — молекулярная масса; Md — молекулярная масса производного.

9 Обработка результатов ГХ-МС анализа

9.1 В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, оформляют таблицу пиков с использованием программного обеспечения хромато-масс-спектрометра. Метод обработки хроматограммы — внутренний стандарт.

Содержание /-го бета-адреностимулятора в анализируемой пробе Х₍, мкг/кг, рассчитывают по формуле

X=^S/Hs,    (3)

S_is-k,

где S,- — площадь пика /-го бета-адреностимулятора в анализируемой пробе;

M_js — содержание внутреннего стандарта в анализируемой пробе, мкг/кг;

S_/s — площадь пика внутреннего стандарта в анализируемой пробе;

/г, — коэффициент отклика для /'-го бета-адреностимулятора.

9.1.1    Расчеты количества бета-адреностимулятора и площади пика выполняются системой обработки данных в автоматическом режиме.

9.1.2    Результаты измерений округляют до второго десятичного знака и выражают в мкг/кг.

За результат измерений содержания /'-го бета-адреностимулятора принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

^|Х'"С^Х;2|х 100 < г,    (4)

X,

гдеХ₍₁ \лХ_а — результаты двух параллельных определений содержания /'-го бета-адреностимулятора, _ выполненных в условиях повторяемости, мкг/кг;

Xj — среднеарифметическоезначение результатовдвухпараллельныхопределений, Х_п иХ_/2, мкг/кг;

г— предел повторяемости, значение которого приведено в таблице 7, %.

9.1.3    Для целей количественного и подтверждающего анализа допускается проведение измерений в различных режимах тандемной масс-спектрометрии, позволяющих получить требуемое количество подтверждающих критериев. При количественном анализе допускается проведение измерения по одному, наиболее интенсивному иону в соответствии с требованиями, указанными в 8.2. Подтверждающий анализ проводят при наличии не менее четырех диагностических критериев, полученных для сили-рованных производных или метилборатов, в соответствии с требованиями, указанными в 8.2.

9.2 Идентификацию бета-адреностимуляторов и их количественное определение проводят с соблюдением следующих условий для масс-спектрометрического детектирования:

-    молекулярный ион используют для идентификации, если он присутствует в масс-спектре с относительной интенсивностью не менее 10 %;

-    относительная ионная интенсивность каждого из диагностических ионов должна быть не менее

10%;

-    соотношение сигнал/шум для каждого диагностического иона должно быть не менее 3/1. Относительные интенсивности детектированных ионов, выраженные как процент от интенсивности самого интенсивного иона, должны соответствовать таковым из градуировочного раствора, в сопоставимых массовых концентрациях, измеренным при тех же самых условиях, в пределах максимально допустимых отклонений, указанных в таблице 4.

Таблица 4 — Максимально допустимые отклонения для относительных ионных интенсивностей

Относительная интенсивность (% от основного пика) ЭИ-ГХ-МС (относительная), % ГХ-МС” (относительная),% Св. 50 ± 10 ±20 » 20 до 50 включ. ± 15 ±25 От 10 » 20 » ±20 ±30 Менее 10 ±50 ±50

При проведении подтверждающего анализа число диагностических ионов для каждого из масс-спектрометрических методов определяют с учетом идентифицирующих критериев.

Для подтверждения каждого из бета-адреностимуляторов необходимы минимум четыре идентифицирующих критерия. В таблице 5 приведено количество идентифицирующих критериев в зависимости от используемых масс-спектрометрических методов.

Таблица 5 — Отношение между масс-спектрометрическими методами и количеством полученных идентифицирующих критериев

Масс-спектрометрические методы Количество идентифицирующих критериев, полученных на диагностический ион Масс-спектрометрия низкого разрешения (ИР) 1,0 ИР-МС” ион предшественник 1,0 НР-МС” дочерние ионы 1,5 Масс-спектрометрия высокого разрешения (ВР) 2,0 BP-МС” ион предшественник 2,0 BP-МС" дочерние ионы 2,5

В таблице 6 показаны примеры числа идентифицирующих критериев (п — целое число), получен-н ых для разл ич н ых масс-спектрометрических методов.

Таблица 6 — Примеры расчета идентифицирующих критериев

Методы ПХ-МС анализа Число диагностических ионов Количество идентифицирующих критериев ГХ-МС (ЭИ или ХИ) N п ГХ-МС (ЭИ или ХИ) 2 производных 2 (Производное А) + 2 (Производное Б) 4 ГХ-МС-МС 1 предшественник и 2 дочерних 4 гх-мс-мс 2 предшественника, каждый с 1 дочерним 5

10 Метрологические характеристики

Значения допускаемой относительной расширенной неопределенности U_re!, % (при коэффициенте охвата к = 2) измерений содержания индивидуальных бета-адреностимуляторов по установленному в настоящем стандарте методу приведены в таблице 7.

Таблица 7 — Метрологические характеристики метода

Диапазон измерений содержания Относительная расширенная Предел повторяемости, при Р = 0,95, бета-адреностимуляторов, мкг/кг неопределенность (к = 2), Urel, % " = 2'отн,% От 0,10 до 1,00включ. 25 15 Св. 1,00 » 10,00 » 15 10 » 10,00 10 5

Фактические значения расширенной неопределенности U_c, мкг/кг (при коэффициенте охвата к = 2) результатов, полученных при определении содержания индивидуальных бета-адреностимуляторов и признанных приемлемыми (8.1.2), рассчитываются по формуле (7).

11 Оформление результатов измерений

Результат анализа М_с в документах, предусматривающихего использование, представляют в виде

М_с = X_Lc± U_c,    (5)

где М_с — окончательный результат определения содержания бета-адреностимулятора, мкг/кг;

X, _с — среднеарифметическое значение двух параллельных определений содержания /-го бета-адреностимулятора в анализируемой пробе, выполненных в условиях повторяемости, мкг/кг;

U_c—расширенная неопределенность (при коэффициенте охвата к = 2) определения содержания /'-го бета-адреностимулятора, определяемая по формуле 7, мкг/кг.

13

12 Контроль точности измерений

12.1    Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже одного раза в пять дней. Повторно анализируют образцы для градуировки хроматографа по 6.4 и определяют коэффициенты отклика для каждого бета-адреностимулятора (два параллельныхопределения) в техже условиях, в которых была установлена градуировочная характеристика. Градуировочную характеристику признают стабильной, если коэффициент отклика для каждого из двух параллельных определений отличается от значения, установленного при градуировке, не более чем на 10%. Если градуировочная характеристика нестабильна, градуировку хроматографа проводят повторно.

12.2    Контроль смещения результатов измерений с помощью стандартных образцов проводят не реже одного раза в месяц. С использованием стандартной процедуры подготовки проб проводят анализ стандартных образцов в соответствии с разделом 7 и получают результат измерений содержания /-го бета-адреностимулятора (X,- _с, мкг/кг). Результаты измерений признают удовлетворительными при выполнении неравенства

(6)

гдеХ,- _с — содержание /'-го бета-адреностимулятора в анализируемом стандартном образце, мкг/кг;

X,—аттестованное значение содержания/'-го бета-адреностимулятора в стандартном образце,

мкг/кг;

U, _с — расширенная неопределенность (при коэффициенте охвата к = 2) результата измерений содержания /'-го бета-адреностимулятора, полученного при соблюдении требований настоящего стандарта, мкг/кг, рассчитываемая по формуле:

(7)

где и, _с — расширенная неопределенность (при коэффициенте охвата к =2) аттестованного содержания/'-го бета-адреностимулятора в аттестованном стандартном образце в соответствии с паспортом (сертификатом) на конкретный стандартный образец, мкг/кг.

13 Требования безопасности

13.1    Используемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го класса опасности по ГОСТ 12.1.007, при работе сними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.

13.2    Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

12.3    Операции по приготовлению и дозированию градуировочных растворов следует проводить под тягой в вытяжном шкафу.

13.4    При проведении испытаний следует соблюдать ГОСТ 12.2.085 и [1].

13.5    При выполнении измерений на хромато-масс-спектрометре следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019, пожаровзрывобезопасности — по ГОСТ 12.1.018 и инструкцией по эксплуатации прибора.

13.6    К выполнению измерений методом газовой хроматографии допускаются лица, владеющие техникой ГХ-МС и изучившие инструкции по эксплуатации применяемой аппаратуры.

14

ГОСТ Р 54032-2010

Библиография

[1] ПБ 03-576—2003 Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением (Утверждены Постановлением Госгортехнадзора России от 11.06.2003 № 91)

15

УДК 664.002.3:001.4:006.34    ОКС    65.120,    Н09    ОКСТУ    9101

67.050    Н19    9709

Н11

Ключевые слова: пищевые продукты, корма, продовольственное сырье, бета-адреностимуляторы (содержание), газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектором

Редактор М.Е. Никулина Технический редактор Н.С. Гоишанова Корректор В.Е. Нестерова Компьютерная верстка ИЛ. Налейкиной

Сдано в набор 17.11.2011. Подписано в печать 06.12.2011. Формат 60 х 84у_в.    Гарнитура Ариал.

Уел. печ. л. 2,32. Уч.-изд. л. 1,85. Тираж 171 экз. Зак. 1199.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru    info@gostinfo.ru

Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

ГОСТ Р 54032-2010

Содержание

1    Область применения...................................................1

2    Нормативные ссылки..................................................1

3    Сущность метода.....................................................2

4    Условия выполнения измерений...........................................2

5    Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы.........2

6    Подготовка к проведению измерений........................................4

7    Отбор проб.........................................................8

8    Порядок выполнения измерений..........................................10

9    Обработка результатов ГХ-МС анализа......................................11

10    Метрологические характеристики.........................................13

11    Оформление результатов измерений......................................13

12    Контроль точности измерений...........................................14

13    Требования безопасности..............................................14

Библиография........................................................15

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, КОРМА, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения содержания бета-адреностимуляторов с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Food products, feeds, food raw materials.

Method of determination of p -agonists by gas chromatography with mass spectrometry detector

Дата введения — 2012—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на продукты пищевые в части мяса и мясных продуктов, включая мясо и продукты из мяса птицы, комбикорма и продовольственное сырье, и устанавливает метод газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (далее — ГХ-МС) для идентификации и количественного определения бета-адреностимуляторов.

Диапазон измерений — от 0,1 до 100,0 мкг/кг.

Примечание — Метод может быть использован для определения содержания бета-адреностимуляторов в физиологических жидкостях, шерсти и органах животных.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1—91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.2.085-2002 Сосуды, работающие под давлением. Клапаны предохранительные. Требования безопасности

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435—73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначение чистоты

ГОСТ 22300-76 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия

ГОСТ 24147-80 Аммиак водный особой чистоты. Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Сущность метода

Идентификацию и количественное определение бета-адреностимуляторов методом ГХ-МС проводят с использованием стандартных образцов бета-адреностимуляторов.

Количественное определение бета-адреностимуляторов проводят методом внутреннего стандарта по площади пика идентифицированных соединений относительно градуировочной зависимости, полученной при анализе градуировочных растворов известных соединений в аналогичных условиях.

4    Условия выполнения измерений

При определении содержания бета-адреностимуляторов в лаборатории должны быть соблюдены

следующие условия:

- температура окружающего воздуха........от    10 °С до 30 °С;

- атмосферное давление...............от    84    до    106 кПа;

-    напряжение в электросети.............(220    +    20)    В;

-    частота тока в электросети.............от    49    до    51 Гц;

-    относительная влажность воздуха........от    30%    до 80%.

Хроматографические измерения проводят в условиях, указанных инструкцией по эксплуатации соответствующего прибора.

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

5.1 Для определения содержания бета-адреностимуляторов применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

-    хромато-масс-спектрометр, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 45 до 650 атомных единиц массы (а.е.м.), с разрешением по шкале масс не более 1,0 а.е.м. и чувствительностью в режиме ионизации электронным ударом: при инжекции в колонку 2 пг гексахлорбензола (сканирование в диапазоне от 45 до 350 а.е.м. за 1 с) отношение сигнал/шум на молекулярном ионе с m/z 284 не менее 10/1;

-    колонку кварцевую капиллярную 30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм с индексом полярности неподвижной жидкой фазы от пяти до 30;

-    компьютер с установленным программным обеспечением для управления хромато-масс-спектрометром и обработки результатов измерений;

-    автосамплердля газового хроматографа;

ГОСТ Р 54032-2010

-    пипетки одноканальные переменного объема 10—100 мм¹,40—200 мм¹,200—1000 мм¹,1—5 см¹ с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу не более 2 %(Transferpettor Brand, Германия)*;

-    весы классаточности1икпассаточности11сдискретностьюотсчетас/ = 0,01 мг, поверочнымделе-нием е = 100 d по ГОСТ Р 53228;

-    модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 250 °С;

-    измельчитель-гомогенизатор лабораторный;

-    гомогенизатор лабораторный конфигурации ротор-статор;

-    испаритель ротационный со скоростью вращения от 20 до 280 об/мин и температурным диапазоном нагревательной бани от 30 °С до 100 °С;

-    центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения ротора не менее 3500 об/с и диапазоном рабочих температур от минус 10 °С до плюс 25 °С, с адаптерами для пробирок вместимостью 15,50 см¹ и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см¹;

-    картридж для твердофазной экстракции объемом не менее 6 см¹, заполненный обращенно-фаз-ным сорбентом С18 с размером диаметра частиц не более 50 мкм;

-    устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

-    флаконы стеклянные вместимостью 4 см¹ с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками;

-    флаконы стеклянные вместимостью 40 см¹ с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками;

-    флаконы стеклянные вместимостью 2 см¹ с завинчивающимися крышками, тефлоновыми прокладками и вставками объемом 100 мм¹;

-    колбы мерные стеклянные 2-10-2,2-100-2,2-1000-2 поГОСТ 1770;

-    колбы стеклянные П-2-100-32 ТС по ГОСТ25336;

-    баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 кГц и объемом не менее 1 дм¹;

-    шейкер вортексного типа движения, с амплитудой встряхивания 5 мм;

-    шейкер орбитального типа движения с максимальной скоростью вращения 1000 об/мин;

-    pH-метр с набором электродов с пределами абсолютной погрешности измерений ± 0,01 ед. pH;

-    фильтры мембранные с размером диаметра пор не более 0,45 мкм;

-    шкаф сушильный лабораторный с автоматическим регулированием температуры в рабочем пространстве от 25 °С до 300 °С.

5.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

-    гелий газообразный (сжатый) высокой чистоты, марка 6.0;

-    азот газообразный особой чистоты по ГОСТ 9293;

-    фермент протеолитический Subtilisine A (Sigma, Германия, № Р-5380)*;

-    кислоту уксусную по ГОСТ 61, х. ч.;

-    кислоту соляную по ГОСТ 3118, х. ч.;

-    кислоту хлорную 65 %-ную, х. ч.;

-    кальций хлористый двухводный, х. ч.;

-    аммиак водный по ГОСТ 24147, о.с.ч.;

-    кислоту метилборную, х. ч.;

-    Л/-метил-Л/-триметилсилил-трифторацетамид (МСТФА) (Sigma, Германия, № М-7891)*;

-    триметилйодсилан (ТМИС) (Aldrich, Германия, № 19,552-9)*;

-    дитиоэритритол (ДТЭ), х. ч.;

-    Л/,Л/-бис-триметилсилил-трифторацетамид (БСТФА) (Sigma, Германия, № Т-5634)*;

-    триметилхлорсилан (ТМХС) (Sigma, Германия, № Т-4252)*;

-    эфир метил-третбутиловый для хроматографии;

-    н-Гексанх.ч.;

-    калия гидроокись по ГОСТ 24363, х. ч.;

-    натрия гидроокись по ГОСТ4328, х. ч.;

-    метанол-яд по ГОСТ 6995;

-    этанол абсолютный, х. ч.;

* Указанные материалы являются рекомендуемыми к применению. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

-    сок пищеварительный Helix pomatia (Merck, Германия, № 1.04114)*;

-    воду деионизованную;

-    спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, о.с.ч.;

-    эфир этиловый уксусной кислоты по ГОСТ 22300, х.ч.;

-    сорбент Bondesil С1840 мкм (Varian, США, № 12213012)*;

-    твин 20 (Sigma, Германия, № Р-2287)*;

-    натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.;

-    калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198;

-    натрий уксуснокислый, х. ч.;

-    трис(гидроксиметил)-аминометан, х. ч.

Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2, х. ч. или 3, ч. д. а. по ГОСТ 13867.

5.3 Для определения содержания бета-адреностимуляторов применяют следующие стандартные образцы:

-    цимбутерол-69 массовой долей основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT**, Wageningen UR)*;

-    цимбутерол массовой долей основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, Wageningen UR)*;

-    кпенбутерол-бб массовой долей основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, Wageningen UR)*;

-    кпенбутерол массовой долей основного вещества не менее 99,0 % (Boehringer, Ingelheim)*;

-    сальбутамол-бб массовой долей основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, Wageningen UR)*;

-    сальбутамол массовой долей основного вещества не менее 98,0 % (SIGMA, Deisenhofen)*;

-    мапентерол массовой долей основного вещества не менее 99,0 % (RIKILT, Wageningen UR)*;

-    мапентерол-d 11 массовой долей основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, Wageningen UR)*;

-    тербуталин массовой долей основного вещества не менее 99,0 % (SIGMA, Deisenhofen)*;

-    тербуталин-69 массовой долей основного вещества не менее 98,0 % (RIKILT, Wageningen UR)*;

-    стандартные образцы с аттестованной массовой долей кленбутерола и сальбутамола:

1)    лиофилизованная моча (IRMM***, BCR-504)*;

2)    лиофилизованная печень, чистый образец (IRMM, BCR-648)*;

3)    лиофилизованная печень (IRMM, BCR-649)*.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов, по качеству не хуже вышеуказанных.

6 Подготовка к проведению измерений

6.1    Приготовление растворов

6.1.1    Приготовление трис-буфера молярной концентрации с = 0,2 моль/дм³ и pH 8,0

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 24,2 г трис(гидроксиметил)-аминометана и 14,7 г кальция хлористого двухводного, растворяют в 800 см³ деионизованной воды, измеряют pH, доводят значение pH до (8,0 + 0,1) соляной кислотой молярной концентрации с = 1 моль/дм³ (5.2) и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 мес.

6.1.2    Приготовление фосфатного буферного раствора молярной концентрации с = 0,1 моль/дм³ и pH 5,0

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 13,6 г калия фосфорнокислого однозамещенного, растворяют в 900 см³ деионизованной воды, измеряют pH, доводят значение pH до (5,0 + 0,1) соляной кислотой молярной концентрации с = 1 моль/дм³ (5.2) и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 3 мес.

* Указанные материалы являются рекомендуемыми к применению. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

** Институт пищевой безопасности, расположенный в Нидерландах.

*** Институт референтных материалов и измерений, расположенный в Бельгии. ²

ГОСТ Р 54032-2010

6.1.3 Приготовление фосфатного буферного раствора молярной концентрации с = 0,1 моль/дм³ и pH 6,0

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 13,6 г калия фосфорнокислого однозамещенного, растворяют в 900 см³ деионизованной воды, измеряют pH, доводят значение pH до (6,0 + 0,1) соляной кислотой молярной концентрации с = 1 моль/дм³(5.2)идоводятобъемдометкидеионизованной водой.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 3 мес.

6.1.4 Приготовление ацетатного буферного    раствора молярной концентрации с = 0,2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 16,4 г натрия уксуснокислого, растворяют в 900 см³ деионизованной воды, измеряют pH, доводят значение pH до (5,0 + 0,1) концентрированной уксусной кислотой и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 мес.

6.1.5    Приготовление растворов для дериватизации

Для приготовления раствора МСТФА/ТМИС/ДТЭ смешивают 1000 мм³ МСТФА и 5 мм³ ТМИС во флаконе вместимостью 2 см³, добавляют к полученному раствору 2 мгДТЭ.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 недели.

Для приготовления раствора БСТФА/ТМХС смешивают 1000 мм³ БСТФАи 10 мм³ТМХС во флаконе вместимостью 2 см³.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 1 недели.

6.1.6    Приготовление раствора аммиака в изопропиловом спирте

Во флакон вместимостью 40 см³ вносят 15 см³ изопропилового спирта, приливают 0,45 см³ аммиака и помещают раствор на 1 мин на ультразвуковую баню.

Раствор используют свежеприготовленным.

6.1.7    Приготовление раствора этилового эфира уксусной кислоты и метилборной кислоты

Для приготовления раствора смешивают 0,02 см³ метилборной кислоты и 10 см³ этилового эфира уксусной кислоты в мерной колбе вместимостью 10 см³-

Раствор используют свежеприготовленным.

6.1.8    Приготовление раствора гидроокиси калия молярной концентрации с = 1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 56,1 г гидроокиси калия, растворяют в 900 см³ деионизованной воды и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

6.1.9    Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации с = 10 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 400,0 г гидроокиси натрия, растворяют в 600 см³ деионизованной воды и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

6.1.10    Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации с = 2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 84,0 г натрия гидроокиси, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре в сосуде из полимерных материалов — не более 1 мес.

6.1.11    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с = 0,01 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ приливают 50 см³ деионизованной воды, 0,1 см³ концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

6.1.12    Приготовление 25 %-ного раствора соляной кислоты

В мерную колбу вместимостью 100 см³ приливают 44 см³ деионизованной воды, затем осторожно вносят 56 см³ концентрированной соляной кислоты.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

6.1.13    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с = 1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ приливают 500 см³ деионизованной воды, вносят 81 см³ концентрированной соляной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

6.1.14    Приготовление растворов внутреннего стандарта массовой концентрации с = 0,1 мкг/см³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1 мг стандартного образца дейтрированных производных, приливают 80 см³ этанола, перемешивают и помещают раствор на 1 мин на ультразвуковую ³

баню, затем доводят объем до метки этанолом. В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 0,1 см³ приготовленного раствора и доводят объем до метки этанолом.

Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °С — не более 12 мес.

6.1.15    Приготовление стандартного раствора С₀ бета-адреностимуляторов

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 10 мг каждого стандартного образца, приливают 80 см³ этанола, перемешивают и помещают раствор на 1 мин на ультразвуковую баню, затем доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С₀ должна составлять 0,1 мг/см³.

Срок хранения раствора при температуре не выше минус 18 °С — не более 12 мес.

6.1.16    Приготовление стандартного раствора С_л бета-адреностимуляторов

В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 0,1 см³ стандартного раствора С₀ (6.1.15) и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С^ должна составлять 1000 нг/см³.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 4 мес.

6.1.17    Приготовление стандартного раствора С₂ бета-адреностимуляторов

В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 1 см³ стандартного раствора С₁ (6.1.16) и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С₂ должна составлять 100 нг/см³.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 4 мес.

6.1.18    Приготовление стандартного раствора С₃ бета-адреностимуляторов

В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 1 см³ стандартного раствора С₂ (6.1.17) и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С₃ должна составлять 10 нг/см³.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 4 мес.

6.1.19    Приготовление стандартного раствора С₄ бета-адреностимуляторов

В мерную колбу вместимостью 10 см³ пипеточным дозатором вносят 5 см³ стандартного раствора С₃ (6.1.18) и доводят объем до метки этанолом.

Массовая концентрация каждого соединения в растворе С₄ должна составлять 5 нг/см³.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 4 °С — не более 4 мес.

6.1.20    Приготовление градуировочных растворов бета-адреностимуляторов

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрацией 0,1 нг/см³ к сухому остатку после упаривания матрицы вносят 0,02 см³ стандартного раствора С₄ (6.1.19), приливают 0,1 см³ раствора внутреннего стандарта (6.1.14). Затем пипеточным дозатором вносят 0,88 см³ этанола, переносят на шейкер и гомогенизируют. Затем помещают на центрифугу и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при температуре 10 °С.

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрацией 0,5 нг/см³ используют стандартный раствор С₄ (6.1.19).

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрацией 1 нг/см³ используют стандартный раствор С₃ (6.1.18).

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрацией 10 нг/см³ используют стандартный раствор С₂ (6.1.17).

Для приготовления градуировочного раствора массовой концентрацией 100 нг/см³ используют стандартный раствор (6.1.16).

К сухому остатку после упаривания чистой пробы исследуемого типа матриц вносят 0,1 см³ соответствующего стандартного раствора, приливают 0,1 см³ раствора внутреннего стандарта (6.1.14). Затем пипеточным дозатором вносят 0,8 см³ этанола, переносят на шейкер и гомогенизируют. Затем помещают на центрифугу и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при температуре 10 °С.

Приготовленные градуировочные растворы и растворы внутренних стандартов хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °С. Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.2    Подготовка хромато-масс-спектрометра к выполнению измерений

Подготовку хромато-масс-спектрометра к работе осуществляют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора.

6.3    Подготовка газового хроматографа к выполнению измерений

6.3.1 Подготовку газового хроматографа к работе осуществляют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора. Для получения градуировочных характеристик устанавливают параметры газового хроматографа в соответствии с 6.4.1. ⁴

ГОСТ Р 54032-2010

6.3.2 Для получения градуировочных данных используют градуировочные растворы бета-адре-ностимуляторов и растворы их дейтерированных производных в соответствии с таблицей 1, внесенные в заведомо чистые пробы анализируемого типа матриц (растворы бета-адреностимуляторов и их дейте-рированные производные вносят в матрицу перед этапом дериватизации). В качестве внутреннего стандарта используют дейтерированные производные определяемых бета-адреностимуляторов. Для каждого бета-адреностимулятора используется соответствующее дейтерированное производное.

Таблица 1 — Массовая концентрация бета-адреностимуляторов в градуировочных растворах

Наименование бета-адреностимулятора Градуировочный уровень № 1 №2 №3 №4 №5 Массовая концентрация, нг/см3 Нативные бета-адреностимуляторы Кпенбутерол 0,1 0,5 1 10 100 Сальбутамол 0,1 0,5 1 10 100 Мапентерол 0,1 0,5 1 10 100 Цимбутерол 0,1 0,5 1 10 100 Тербуталин 0,1 0,5 1 10 100 Изотопно-меченые бета-адреностимуляторы/внутренний стандарт Кпенбутерол-бб 10 10 10 10 10 Сальбутамол-бб 10 10 10 10 10 Мапентерол-dl 1 10 10 10 10 10 Цимбутерол-бЭ 10 10 10 10 10 Тербуталин-б9 10 10 10 10 10

6.3.3 При установлении градуировочной характеристики используют не менее трех уровней массовой концентрации градуировочных растворов в диапазоне определяемого бета-адреностимулятора массовой концентрации от 1 до 100 нг/см³. В инжектор хроматографа вводят каждый градуировочный раствор не менее двух раз.

С помощью компьютерной системы обработки данных устанавливают градуировочную характеристику для площади пика методом внутреннего стандарта для каждого бета-адреностимулятора.

Коэффициент отклика /с, для /'-го бета-адреностимулятора рассчитывают по формуле

к, = §***,    (1)

S/S м,

где S, — площадь пика /-го бета-адреностимулятора в градуировочном растворе;

M_js — массовая концентрация внутреннего стандарта в градуировочном растворе, нг/см³;

S_/s — площадь пика внутреннего стандарта в градуировочном растворе;

Af₍. — массовая концентрация /-го бета-адреностимулятора в градуировочном растворе, нг/см³. Проверяют приемлемость полученных значений коэффициента отклика /с, для каждого бета-адреностимулятора анализируемых градуировочных уровней, используя неравенство

гдеК™³* — максимальное значение /'-го коэффициента отклика;

К™^т — минимальное значение /-го коэффициента отклика;

Kj —среднее значение /-го коэффициента отклика; с/₍ — относительная разность коэффициентов отклика.

Значения с/, (Р = 0,95) не должны превышать: 5 % (п = 3) или 4 % (л = 2), где п — число параллельных определений /-го коэффициента отклика для каждого градуировочного уровня. ⁵

1

2

3

4

5