ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Метод обнаружения и подсчета бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий). Метод наиболее вероятного числа

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») на основе собственного аутентичного перевода на русский язык стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2010 г. № 556-ст

4    В настоящем стандарте учтены основные положения международного стандарта:

ИСО 4831:2006 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета колиформных бактерий. Методика наиболее вероятного числа (ISO 4831:2006 «Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of conforms — Most probable number technique»)

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ,2011

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

УДК 663/664.777:006.354    ОКС 65.120    С19    ОКСТУ    9209

Ключевые слова: корма для животных, микробиология, метод обнаружения, метод подсчета (НВЧ) ко-лиформных бактерий, питательные среды, лактозный желточный бульон с бриллиантовым зеленым, пробирки Дархама, помутнение, образование газа

9

Редактор М.Е. Никулина Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор Л. С. Черноусова Компьютерная верстка ИЛ. Налейкиной

Сдано в набор 07.10.2011. Подписано в печать 20.10.2011. Формат 60 х 84^. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 1,40. Уч.-изд. л. 1,05. Тираж 131 экз. Зак. 979.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru    info@gostinfo.ru

Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

ГОСТ P 53985—2010

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Метод обнаружения и подсчета бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий).

Метод наиболее вероятного числа

Animal feeding stuffs.

Method for the detection and enumeration of conforms. Most probable number technique

Дата введения — 2012—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма для животных и устанавливает метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа (НВЧ) бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий).

Метод наиболее вероятного числа колиформных бактерий предназначен для кормов, содержащих искомое количество микроорганизмов в диапазоне от 1 до 100 на миллилитр или грамм анализируемой пробы.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 7218-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ Р ИСО 11133-1-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культурных сред в лаборатории

ГОСТ Р ИСО 11133-2-2008 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть2: Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

ГОСТ Р 51426-99 (ИСО 6887—83) Микробиология. Корма, комбикорма, комбинированное сырье. Общее руководство по приготовлению разведений для микробиологических исследований

ГОСТ Р 52816-2007 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 25311-82 Мука кормовая животного происхождения. Методы бактериологического анализа

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Издание официальное

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины и определения по ГОСТ Р 52816.

4    Обнаружение колиформных бактерий и определение количества методом наиболее вероятного числа (НВЧ)

Сущность метода — по ГОСТ Р 52816.

4.1    Метод обнаружения колиформных бактерий

4.1.1    В пробирку с селективно обогащенной питательной средой вносят около 1 г корма, пробирку помещают в термостат для инкубирования при температуре 30 °С или 37 °С (по договоренности) в течение 24ч или 48 ч.

4.1.2    Пробирку, после выращивания по 4.1.1, проверяют на наличие помутнения и/или образования газа. Затем из пробирки, в которой установлено наличие помутнения и/или образования газа, вносят в другую пробирку с селективно обогащенной питательной средой около 1 см³ суспензии и проводят повторное выращивание микроорганизмов при температуре 30 °С или 37 °С (по договоренности) в течение 24ч или 48 ч.

4.1.3    Присутствие колиформных бактерий подтверждают в случае, если помутнение и/или образование газа замечено после осмотра пробирки, полученной по 4.1.2

4.2 Метод НВЧ — определение количества колиформных бактерий

4.2.1    В три пробирки с селективно обогащенной жидкой питательной средой двойной концентрации вводят определенное количество анализируемой пробы, если исходный корм является жидким, или определенное количество исходной суспензии в случае испытания других кормов.

4.2.2    В три пробирки с селективно обогащенной жидкой питательной средой нормальной концентрации вводят определенное количество анализируемой пробы, если исходный корм является жидким, или определенное количество исходной суспензии в случае испытания других кормов.

Затем, в такихже условиях, в дополнительные пробирки с питательной средой нормальной крепости вводят десятичные разбавления анализируемой пробы или исходной суспензии.

4.2.3    Пробирки с посевами, содержащие селективно обогащенную питательную среду двойной концентрации, выращивают при температуре 30 °С или 37 °С (по договоренности) в течение 24 ч, а пробирки, содержащие селективно обогащенную питательную среду нормальной концентрации, инкубируют 24 ч или 48 ч и после этого пробирки осматривают и отмечают образование пузырьков газа или помутнение, предотвращающее обнаружение формирования газа.

4.2.4    В ряд пробирок с подтверждающей питательной средой вводят суспензию культур из пробирок с селективно обогащенной питательной средой двойной концентрации и суспензию культур из пробирок с селективно обогащенной питательной средой нормальной концентрации, в которых было замечено образование пузырьков газа или помутнение.

4.2.5    Посевы в пробирках по 4.2.4 выращивают при температуре 30 °С или 37 °С в течение 24 ч или 48 ч, и эти пробирки исследуют на формирование газа.

4.2.6    Наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 см³ или 1 г пробы корма (НВЧ) рассчитывают исходя из числа из пробирок по 4.2.5, показывающих формирование газа. В этом случае используют таблицу установления наиболее вероятного числа.

5    Среды выращивания бактерий и разбавители

5.1    Общие положения

Качество подготовки, изготовления и оценки эффективности питательных сред для выращивания бактерий — по ГОСТ Р ИСО 7218, ГОСТ Р ИСО 11133-1 и ГОСТ Р ИСО 11133-2.

5.2    Селективно обогащенная питательная среда: LST (Триптоза лаурилсульфата)

5.2.1 Состав приведен в таблице 1 ¹

Т а л и ц а 1

а) Ь) Наименование компонентов Среда двойной Среда нормальной концентрации концентрации Энзиматический гидролизат молока и животных протеинов, г 40 20 Лактоза (С^Н^Оц ■ Н20), г 10 5 Дикалия гидрофосфат — (К2НР04), г 5,5 2,75 Калия дигидрофосфат (КН2Р04), г 5,5 2,75 Хлорид натрия, г 10 5 Лаурилсульфат натрия,г 0,2 0,1 Вода, см3 1000 1000

5.2.2    Приготовление

Различные компоненты или обезвоженную полную среду растворяют в воде, при необходимости ее нагревая.

При необходимости корректируют pH так, чтобы после стерилизации он был равен 6,8 + 0,2 при температуре 25 °С.

Питательную среду разливают по 10 см² в пробирки Дархама (поплавки) размером приблизительно 16 х 160 мм, когда используют среду нормальной концентрации, и в пробирки с размерами приблизительно 20 х 200 мм (не содержащие поплавки), когда используют среду двойной концентрации.

Стерилизуют среду в автоклаве при температуре (121 + 1) °С в течение 15 мин. Пробирки Дархама не должны содержать воздушные пузырьки после стерилизации.

5.2.3    Тестирование эффективности для обеспечения качества питательной среды

Определение селективности и продуктивности — по ИСО/ТУ 11133-1. Тестирование эффективности питательной среды LST (триптоза лаурилсульфата) приводится по ИСО/ТУ 11133-2 (таблица В.1).

5.3    Подтверждающая среда: лактозный желчный бульон с бриллиантовым зеленым

5.3.1 Состав приведен в таблице 2

Таблица 2

Ферментативный перевар казеина, г 10 Лактоза (С12Н22ОЦ • Н20), г 10 Обезвоженная желчь быка, г 20 Бриллиантовый зеленый (краситель), г 0,0133 Вода, см3 1000

5.3.2    Приготовление

Компоненты или обезвоженную полную среду растворяют в воде, при необходимости производя нагрев.

При необходимости корректируют pH так, чтобы после стерилизации он был равен 7,2 + 0,2 при температуре 25 °С.

Разливают и стерилизуют среду по 5.3.2.

5.3.3    Тестирование эффективности для обеспечения качества питательной среды

Определение селективности и продуктивности лактозного желчного бульона с бриллиантовым зеленым — поГОСТРИСО 11133-2 (таблица В.1).

6 Оборудование и стеклянная посуда

Используют обычное оборудование микробиологической лаборатории по ГОСТ Р ИСО 7218.

6.1    Оборудование для сухой (сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав).

6.2    Термостат, способный поддерживать температуру на уровне (30 ± 1)°Сили(37 + 1)°С.

6.3    Петля, изготовленная из платино-иридиевого или хромоникелевого сплава, диаметром приблизительно 3 мм, или петли одноразового пользования.

6.4    Пробирки, имеющие размеры приблизительно 16 х 160 мм и 20 х 200 мм.

6.5    Пробирки Дархама, с размерами, пригодными для использования в пробирках с размерами 16 х 160 мм (6.4).

6.6    Пипетки градуированные, вместимостью 1 см³ и 10 см³ — по ГОСТ 29227-91.

6.7    pH-метр с диапазоном измерений pH от 2 до 18, погрешность измерений + 0,01 ед. pH при температуре 25 °С.

7    Отбор проб

Отбор проб проводят в соответствии с нормативным документом, подходящим для конкретного корма.

8    Приготовление анализируемой пробы

Анализируемую пробу подготовляют по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 25311 или другому нормативному документу, подходящему для конкретного корма.

9    Проведение испытания (см. приложение А)

9.1    Метод обнаружения (см. приложение А, рисунок А.1)

9.1.1    Подготовка анализируемой пробы и исходной суспензии

Подготовка анализируемой пробы — по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 25311 или другому нормативному документу, подходящему для конкретного корма.

9.1.2    Введение живых микроорганизмов в питательную среду (инокуляция) и их выращивание

9.1.2.1    В зависимости от требуемого предела обнаружения х, см³, анализируемой пробы, если она представляет жидкий корм, или х, см³, исходной суспензии, в случае исследования других кормов, переносят в пробирку, содержащую 10 см³ селективно обогащенной питательной среды двойной концентрации [5.3.1 а)], когда 1 см³ < х < 10 см³, или в пробирку, содержащую 10 см³ селективно обогащенной питательной среды нормальной концентрации [5.3.1 Ь)], когда х<1 см³.

9.1.2.2    Пробирку с питательной средой двойной концентрации (9.1.2.1) выдерживают в инкубаторе (6.2), установленном на температуру 30 °С или 37 °С (по договоренности), в течение (24 ± 2)ч.

9.1.2.3    Пробирку с питательной средой нормальной концентрации (9.1.2.1) выдерживают в термостате (6.2), установленном на температуру 30 °С или 37 °С (по договоренности), в течение (24 + 2) ч или, если на данной стадии не наблюдается ни образование пузырьков газа, ни помутнение, предотвращающее обнаружение формирования газа, период инкубации продлевают еще на (24 ± 2) ч.

9.1.3    Подтверждение (см. приложение А, рисунок А.З)

9.1.3.1    Из пробирки, прошедшей инкубацию согласно 9.1.2.2, петлей (6.3) берут суспензию и вводят ее в пробирку с подтверждающей питательной средой (5.4). Выдерживают в термостате (6.2), установленном на температуру 30 °С или 37 °С (по договоренности), в течение (24 ± 2) ч, или, если на этой стадии образование пузырьков газа не наблюдается, в течение (48 ± 2) ч.

9.1.3.2    Аналогичную процедуру (описание которой дано в 9.1.3.1) выполняют для пробирок, прошедших инкубацию согласно 9.1.2.3 и показывающих образование пузырьков газа или помутнение, предотвращающее обнаружение формирования газа, когда один из этих двух признаков наблюдается впервые, то есть через (24 + 2) ч или (48 + 2) ч.

9.1.4    Интерпретация (см. приложение А, рисунокА.1)

Пробирку по 9.1.3.1 или 9.1.3.2, в которой наблюдается образование пузырьков газа через (24 + 2) ч или (48 + 2) ч, рассматривают как положительную.

9.2    Метод подсчета (НВЧ) (см. приложение А, рисунок А.2)

9.2.1 Подготовка анализируемой пробы, исходной суспензии и разбавление

Подготовка анализируемой пробы, исходной суспензии и разбавление — по ГОСТ 13496.0, ГОСТ25311 или нормативному документу, подходящему для анализируемого корма. Приготовляют достаточное число разбавлений, чтобы гарантировать, что все пробирки, соответствующие конечному разбавлению, дадут отрицательный результат (отсутствие помутнения). ³

ГОСТ Р 53985-2010

9.2.2 Инокуляция и инкубация

9.2.2.1    Берут три пробирки для каждой серии разбавлений. Допускается для некоторых кормов и/или всякий раз, когда требуются результаты более высокой точности, инокуляция большего числа пробирок (например, пяти вместо трех). В этих случаях для вычисления методом наиболее вероятного числа следует обратиться к соответствующим таблицам в ГОСТ Р ИСО 7218.

9.2.2.2    Берут три пробирки с селективно обогащенной питательной средой двойной концентрации [5.3.1 а)]. Используя стерильную пипетку переносят в каждую изтрех пробирок по 10 см³ анализируемой пробы, если исследуемый корм жидкий, или по 10 см³ исходной суспензии в случае исследования других кормов.

9.2.2.3    Затем берут три пробирки с селективно обогащенной питательной средой нормальной концентрации [5.3.1 Ь)]. Используя стерильную пипетку, переносят в каждую из трех пробирок по 1 см³ анализируемой пробы, если исследуемый корм жидкий, или по 1 см³ исходной суспензии в случае исследования других кормов.

9.2.2.4    Для каждого из последующих разбавлений продолжают действия согласно описанию в 9.2.2.3. Используют свежую стерильную пипетку для каждого разбавления. Введенную суспензию и питательную среду тщательно перемешивают.

9.2.2.5    Пробирки с питательной средой двойной концентрации (Э.2.2.2) выдерживают в термостате при температуре 30 °С или 37 °С в течение (24 ±2)ч.

9.2.2.6    Пробирки с питательной средой нормальной концентрации (9.2.2.3 и Э.2.2.4) выдерживают в термостате при температуре 30 °С или 37 °С в течение (24 ± 2) ч, или, если на этой стадии не обнаруживается ни образование пузырьков газа, ни помутнение, предотвращающее обнаружение формирования газа, инкубацию продолжают дополнительно в течение (24 ± 2) ч.

9.2.3    Подтверждение (см. приложение А, рисунок А.З)

9.2.3.1    Из каждой пробирки, прошедшей инкубацию согласно 9.2.2.5, петлей берут суспензию и вводят ее в пробирку с подтверждающей питательной средой (5.4). Выдерживают в термостате (6.2), установленном на температуру 30 °С или 37 °С (по договоренности), в течение (24 + 2) ч, или, если на этой стадии образование пузырьков газа не наблюдается, инкубацию продолжают дополнительно в течение (24 + 2)ч.

9.2.3.2    Процедуру, описанную в 9.2.3.1, выполняют с пробирками, прошедшими инкубацию согласно 9.2.2.6 и показывающими образование пузырьков газа или помутнение, предотвращающее обнаружение формирования газа, когда один из этих двух признаков наблюдается впервые, т.е. через (24 + 2)ч или (48 + 2)ч.

9.2.4    Интерпретация (см. приложение А, рисунок А.2)

Для каждого разбавления подсчитывают общее количество пробирок, в которых подтверждается образование пузырьков газа согласно 9.2.3 (положительные пробирки) через (24 + 2) ч или (48 + 2) ч (если инкубация продлевалась еще на сутки).

10    Обработка результатов

В соответствии с результатами интерпретации (см. 9.1.4) указывают присутствие или отсутствие колиформных бактерий в анализируемой пробе корма по ГОСТ Р ИСО 7218.

Вычисляют наиболее вероятное число из количества положительных пробирок на каждой стадии разбавления по ГОСТ Р ИСО 7218.

11    Сходимость результатов исследования

Установлено, что при использовании метода наиболее вероятного числа (НВЧ) может иметь место значительный разброс результатов. Доверительные пределы приведены в ГОСТ Р ИСО 7218.

12    Требования безопасности

Требования к безопасности выполнения работ и квалификации оператора—по ГОСТ Р ИСО 7218. ⁴

1

2

3

4