ГОСТ Р 51416-99 (ИСО 5510-84)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Определение массовой доли доступного лизина

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Временным творческим коллективом, образованным в рамках договора N? М98 42 002 Е 4075 между АФНОР и ВНИИЦСМВ с участием членов Технического комитета по стандартизации ТК4 «Комбикорма, БВД, премиксы*

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК4 «Комбикорма, БВД, премиксы*

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. N? 571-ст

3    Настоящий стандарт за исключением 2, 6.6, 6.7, 6.8 и 7 представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 5510—84 «Корма для животных. Определение доступного лизина»

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© ИПК Издательство стандартов, 2000

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Российской Федерации без разрешения Госстандарта России

II

ГОСТ Р 51416-99 (ИСО 5510-84)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ Определение массовой доли доступного лизина

Feeds, mixed feeds and raw material.

Determination of available lysine massfraction

Дата введения 2001—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения доступного лизина в кормах, содержащих белки животного или растительного происхождения.

Лизин кормов считается усвояемым в том случае, если в нем не связана конечная аминогруппа (аминогруппа е). Определяют эту фракцию лизина, используя способность связанных конечных аминогрупп соединяться с 2,4-динитрофторбснзолом.

Однако данный метод по сравнению с биологическим завышает содержание доступного лизина, поэтому следует быть осторожным при интерпретации полученных результатов.

2    Нормативные ссылки

ГОСТ 13496.0-80* Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ Р 51417-99 (ИСО 5983—97) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение массовой доли азота и вычисление массовой доли сырого протеина. Метод Къелниаля

ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498—98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб

3    Определение

В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

доступный лизин: Масса лизина, представляющая разницу между массами общего и недоступного лизина, определяемыми при условиях, установленных настоящим стандартом. Результат выражают в процентах в испытуемом продукте.

4    Сущность метода

Измельченную навеску пробы гидролизуют хлористоводородной кислотой, общий лизин выделяют при помощи хроматографии на колонке и измеряют его содержание на спектрометре при длине волны 570 нм.

Вторую навеску измельченной пробы обрабатывают спиртовым раствором 2,4-динитрофтор-бензола в щелочной среде, очищают, гидролизуют хлористоводородной кислотой, выделяют недоступный лизин при помощи хроматографии на колонке и измеряют его содержание на спектрофотометре при 570 нм.

5    Реактивы

Вес реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а. Вода должна быть дистиллированной.

• Действует до введения ГОСТ Р, разработанного на основе ИСО 6797 (1|.

Издание официальное

5.1    Диэтиловый эфир, свободный от перекисей.

5.2    Кислый углекислый натрий, раствор массовой концентрации 80 г/дм³.

5.3    Спиртовый раствор 2,4-динитрофторбензола (ДНФБ)

В 12 см³ 95 %-ного (по объему) этилового спирта растворяют 0,15 см³ ДНФБ.

Раствор готовят перед использованием.

5.4    Раствор хлористоводородной кислоты молярной концентрации 6 моль/дм³.

Один объем хлористоводородной кислоты плотностью 1,19 г/см³ смешивают с 1 объемом дистиллированной волы.

5.5    Лимоннокислый натрий, буферный раствор pH 2,2

Последовательно растворяют в дистиллированной воде 21 г лимонной кислоты; 8 г гидроокиси натрия; 16 см³ хлористоводородной кислоты плотностью 1,19 г/см³; 0,1 см³ октиловой (каприловой) кислоты; 20 см³ тиодигликоля; 3 см³ 30 %-ного (по объему) водного раствора додецилового эфира полиоксиэтилена с приблизительно 23 молекулами оксиэтилена. Объем раствора доводят до 1000 см³ дистиллированной водой.

5.6    Лимоннокислый натрий, буферный раствор pH 5,28

Последовательно растворяют в дистиллированной воде 24,5 г одноводной лимонной кислоты; 14 г гидроокиси натрия; 6,8 см³ хлористоводородной кислоты плотностью 1,19 г/см³; 0,1 см³ октиловой (каприловой) кислоты; 3 см³ 30 %-ного (по объему) водного раствора додецилового эфира полиэтоксила с приблизительно 23 молекулами оксиэтилена. Объем раствора доводят до 1000 см³ дистиллированной водой. Устанавливают pH 5,28 ± 0,02, используя хлористоводородную кислоту плотностью 1,19 г/см³ или раствор гидроокиси натрия массовой долей 50 %.

5.7    Нингидриновый реактив

5.7.1    Пропионовокислый натрий, буферный раствор pH 5,5 ± 0,1

В приблизительно 400 см³ дистиллированной воды растворяют 168 г гидроокиси натрия. Охлаждают, затем при встряхивании добавляют 498 см³ пропионовой кислоты. Объем раствора доводят до 1000 см³ дистиллированной водой.

5.7.2    Приготовление реактива

Нингидриновый реактив готовят в атмосфере азота и в темноте. В колбу вместимостью 2000 см³ помешают 1000 см³ свободного от перекисей монометилового эфира этиленгликоля, 1000 см³ буферного раствора пропионовокислого натрия и 40 г нингидрина. Встряхивают до полного растворения, затем добавляют 1,33 г 2-водного хлористого олова (II) (SnCI₂ 2Н₂0). Перемешивают встряхиванием до полного растворения. (См. примечание).

Реактив устойчив в течение 1 мес при хранении при 4 *С под небольшим давлением в атмосфере азота и в темноте.

Примечание — Если наблюдается выпадение осадка хлористого олова (II), его заменяют 7,5 см³ раствора хлористого титана массовой концентрации 150 г/дм³ или 1,5 г гидриндантина на 1 дм³ реактива.

5.8    Лизин, стандартный раствор молярной концентрации с 1 мкмоль/дм³

В 100 см³ раствора хлористоводородной кислоты молярной концентрации с (HCI) - 0,1 моль/дм³ растворяют 182,5 мг моногидрохлорида лизина. Отбирают точно 10 см³ этого раствора и разбавляют его до 100 см³ буферным раствором лимоннокислого натрия pH 2,2 (5.5). 1 см³ этого раствора содержит 1 мкмоль лизина.

6 Средства контроля

Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1—6.8.

6.1    Колбы плоскодонные вместимостью 250 и 1000 см³, короткогорлые с притертым коническим шлифом и обратные холодильники, подходящие к колбам.

6.2    Тигли с фильтрующей пористой стеклянной пластинкой Р16 (размер пор от 10 до 16 мк).

6.3    Масляная баня температурой, обеспечивающей обратную конденсацию (от 120 до 130 *С).

6.4    Ротационный испаритель.

6.5    Автоанализатор аминокислот или система для хроматографии вручную, включающая:

а)    хроматографическую колонку длиной около 250 мм и внутренним диаметром 6 мм, термо-статируемая при 55 *С при помощи водяной рубашки с циркулирующей водой и заполненная до высоты 200 мм 8 %-ной сильнокислой катионобменной смолой с поперечными связями и функциональными сульфогруппами, размер частиц (13 ± 2) мк;

б)    небольшой поршневой насос, обеспечивающий скорость потока 50 см³/ч;

в)    коллектор фракций;

г)    кипяшую водяную баню;

д)    спектрометр со спектральной областью, включающей 570 нм, с кюветами толщиной 10 мм.

2

ГОСТ Р 51416-99

6.6    Градуировочные пипетки вместимостью 1,5 и 10 cm^j с допускаемой относительной шерстностью ± 1 %.

6.7    Мерные колбы вместимостью 10, 20 и 100 см¹ с допускаемой относительной погрешностью

± 0,2 %.

6.8    Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

7    Отбор проб

7.1    Отбор проб по ГОСТ 13496.0.

8    Проведение испытания

8.1    Подготовка проб по ГОСТ Р 51419.

8.2    Взятие навески

Две навески, взятые на весах 2-го класса точности, массой, содержащей около 100 мг сырого протеина, помешают в две колбы (6.1). Содержание сырого протеина определяют по ГОСТ Р 51417.

8.3    Общий лизин

8.3.1    Гидролиз хлористоводородной кислотой

В колбу вместимостью 1000 см¹ к навеске добавляют 500 см¹ хлористоводородной кислоты молярной концентрации с(НС1) = 6 моль/дм¹. Закрывают колбу обратным холодильником и помешают в масляную баню, предварительно нагретую до 120—130 *С.

После медленного кипячения в течение 24 ч колбу охлаждают и содержимое фильтруют через тигель. Фильтрат выпаривают при температуре не выше 40 *С на ротационном испарителе. К остатку добавляют дистиллированную воду и снова выпаривают. Эту операцию повторяют до тех пор, пока нс будет удалена хлористоводородная кислота; для этого обычно достаточно четыре обработки, используя каждый раз по 30 см¹ дистиллированной воды. Остаток растворяют в буферном растворе pH 2,2 и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см¹. Объем раствора доводят до метки буферным раствором pH 2,2. Фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

8.3.2    Заключительная подготовка колонки и хроматография гидролизата

Насос анализатора присоединяют к емкости, содержащей буферный раствор лимоннокислого натрия с pH 5,28 (5.6). Затем его регулируют, чтобы обеспечить скорость потока жидкости 50 см¹/ч. Насос присоединяют в колонке со смолой, нагретой предварительно до 55 *С, и в течение 20 мин через колонку пропускают буферный раствор, чтобы установилось равновесие. Насос отсоединяют. Удаляют большую часть жидкости над смолой, следя при этом, чтобы поверхность смолы все время была покрыта жидкостью.

При помощи пипетки 0,5 см¹ гидролизата (или 1 см¹, если ручная система) наносят на колонку и пропускают его через колонку под небольшим давлением азота. Стенки колонки обмывают 0,5 см¹ буферного раствора pH 5,28 и пропускают через колонку. Колонку доверху заполняют буферным раствором и присоединяют к насосу.

8.3.3    Определение

8.3.3.1    Автоматизированная система

Включают анализатор. Прибор градуируют но 8.3.2, используя 0,25 мкмоль лизина (0,25 см¹ стандартного раствора лизина) или массу лизина, установленную в инструкции к анализатору.

8.3.3.2    Ручная система

8.3.3.2.1    Локализация лизина

Фракцию элюата, содержащую лизин, определяют, используя раствор лизина известной концентрации, например, 1 мкмоль/см¹. Для этого отбрасывают первые 25—30 см¹ элюата и затем собирают в пробирки фракции по 1 см¹ до тех пор, пока не получат 50 фракцию, считая с начала элюирования. К каждой фракции между 30 и 50 фракциями добавляют по I см¹ нингидринового реактива. Перемешивают, переносят в кипящую водяную баню и оставляют на 15 мин. Охлаждают и разбавляют путем добавления 10 см¹ буферного раствора pH 5,28

Примечание — Исключительно для информации: при описанных условиях лизин обычно элюируется между 39 и 45 фракциями.

8.3.3.2.2    Определение

Если лизин элюировался между 39 и 45 фракциями, отбрасывают первые 38 см¹ элюата, собирают и смешивают фракции (от 39 до 45), соответствующие пику лизина, и высушивают на ротационном испарителе.

Примечание — После получения фракций, содержащих лизин, через колонку пропускают сшс около 200 см¹ буферного раствора, чтобы удалить нежелательные компоненты, которые могут остаться.

Остаток растворяют в 5 см³ буферного раствора pH 5,28 и добавляют 5 см³ ниигидриноною реактива. Перемешивают, переносят в кипящую водяную баню и оставляют на 15 мин. Охлаждают и разбавляют буферным раствором pH 5,28, чтобы концентрация лизина в измеряемом растворе сосгаатяла приблизительно 0,02 мкмоль/см³. (Пусть Р, — объем полученного таким образом измеряемого раствора).

Измеряют поглощение на спектрометре при 570 нм прошв жидкости, представляющей смесь одного объема буферного раствора и одного объема нингидрииового реактива, которую предварительно помешают на 15 мин в кипящую водяную баню, и после охлаждения разбавляют до объема У,.

8.3.3.2.3 Градуировка спектрометра

Отбирают точно 5 см³ стандартного раствора лизина, прибавляют 5 см³ нингидрииового реактива. Перемешивают, ставят на 15 мин в кипящую водяную баню. Охлаждают и разбавляют до 100 см³ буферным раствором pH 5,28.

Измеряют поглощение на спектрометре при тех же условиях, как в 8.3.3.2.2.

8.4 Недоступный лизин

8.4.1    Реакция динитрофенилирования

В колбу вместимостью 250 см³, где находится вторая навеска испытуемой пробы (см.8.2), при помощи пипетки переносят 8 см³ раствора кислого углекислого натрия. Оставляют приблизительно на 10 мин, помешивая время от времени. Затем добавляют раствор ДНФБ, колбу закрывают, содержимое перемешивают, следя за тем, чтобы не осталось частичек, прилипших к стенкам колбы Смесь оставляют на ночь при комнатной температуре в темном месте.

8.4.2    Очистка

Жидкость выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре ниже 40 *С. Затем в колбу добавляют 75 см³ диэтилового эфира, перемешивают и лают отстояться. Выливают большую часть диэтилового эфира с предосторожностями, чтобы не удалить при этом твердые частички. Эту операцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 см³ диэтилового эфира. Оставшиеся следы диэтилового эфира удаляют путем нагревания на ротационном испарителе.

8.4.3    Гидролиз хлористоводородной кислотой

В колбу вносят 150 см³ хлористоводородной кислоты и выполняют процедуры по 8.3.1, но пиролизат, растворенный в буферном растворе pH 2,2, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 20 см³ (или 10 см³ при использовании ручной системы).

8.4.4    Хроматография гидролизата и определение по 8.3.2 и 8.3.3.

В ручном варианте измерение на спектрофотометре можно проводить после разбавления смеси лизин плюс реактив до 20 см³ буферным раствором pH 5.28. (Пусть У₂ — объем полученного таким образом измеряемого раствора)

8.5 Количество определений

Проводят два параллельных определения, используя две разные пары навесок испытуемой пробы.

9 Обработка результатов

9.1    Метод вычисления общего лизина

9.1.1    Определение на автоанализаторе

Массовую долю общего лизина в испытуемой пробе Х\, %, вычисляют по формуле

ГОСТ Р 51416-99

где А\ — оптическая плотность, определяемая по 8.3.2.2;

Р| — объем измеряемого раствора, см³;

100 — коэффициент пересчета в проценты;

0,73 — масса лизина в 5 см³ стандартного раствора лизина, мг;

Д) — оптическая плотность стандартного раствора лизина, определяемая по 8.3.3.2.3;

К₀ — объем перенесенного на колонку гидролизата (обычно У₀ ** 1 см³), см³; т, — масса навески, помешенной в первую колбу, г;

1000 — коэффициент пересчета мг в г.

9.2 Недоступный лизин

9.2.1 Определение на автоанализаторе

Массовую долю недоступного лизина в испытуемой пробе Х₂, %, вычисляют по формуле

0,073 ^ ^т2 ' *0 ■$> *

где S₂ — площадь пика, соответствующего недоступному лизину, определяемому по 8.4.4, мм²; — площадь пика, соответствующего 0,25 ммоль лизина, мм²; т₂ — масса навески, помешенной во вторую колбу, г;

У₀ — объем перенесенного на колонку гидролизата (обычно У₀ =* 0,5 см³), см³.

9.2.2 Определение вручную

Массовую долю недоступного лизина в испытуемой пробе, Х₂, %, вычисляют по формуле

У_г • 0,0073 А₂

Ч’

где А₂ — оптическая плотность, определяемая по 8.4.4;

У₂ — объем измеряемого раствора (обычно У₂ “ 20 см³), см³;

Aq — оптическая плотность стандартного раствора лизина, определяемая по 8.3.3.2.3;

У₀ — объем перенесенного на колонку гидролизата (обычно У₀ *= 1 см³), см³; т₂ — масса навески, помешенной во вторую колбу, г.

9.3 Доступный лизин

Массовую долю доступного лизина в испытуемой пробе Л'з, %, вычисляют по формуле

ДГ, = АГ, - Х₂,    (5)

где X_t — массовая доля общего лизина (см. 9.1);

Х₂ — массовая доля недоступного лизина (см. 9.2).

Примечание — Массовую долю доступного лизина в общем лизине, %, вычисляют по формуле

(6)

9.4    Сходимость

Расхождение результатов двух параллельных определений не должно превышать 10 % от их среднего арифметического значения.

9.5    Воспроизводимость

Расхождение результатов двух определений, выполненных при различных условиях, не должно превышать 20 % от их среднего арифметического значения.

10 Оформление результатов измерений

В отчете об испытании должны быть указаны;

-    используемый метод;

-    полученные результаты;

-    любые условия проведения испытаний, нс установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могли повлиять на результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.

5

ГОСТ Р 51416-99

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное)

Библиография

(1) ИСО 6497 Корма для животных. Методы отбора проб

УДК 636.085.3 : 006.354    ОКС    65.120    С19    ОКСГГУ 9209

Ключевые слова: корма, сырой протеин, лизин, обший лизин, недоступный лизин, динитрофтор бензол, нингидрин, анализатор аминокислот, спектрометр

Редактор Т П.Шошима Технический редактор ЛЛ.Кузнецова Корректор В И. Камуркина Компьютерная верстка А.Н. Заготаревой

Над лиц. № 021007 от 10.08 95. Сдано в набор 17.02.2000. Подписано в печать 28 03.2000. Усл.печл. 0,93. Уч.-издл. 0,67.

Тираж 267 эю С 4765. Зак 278.

ИПК Издательство стандартов, 107076, Москва. Колодезный пер., 14 Набрано в Издательстве на ПЭВМ Филиал ИПК Издательство стандартов - тип “Московский печатник". 103062, Москва, Лялин пер., 6

Плр N? 080102

1