МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

СМЕСИ АДАПТИРОВАННЫЕ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА И СМЕСИ ДЛЯ ЭНТЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ ВЗРОСЛЫХ

Определение витамина В₁₂ методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

(ISO 20634:2015, ЮТ)

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2018

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (АО «ВНИИС») совместно с Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Федеральным исследовательским центром питания, биотехнологии и безопасности пищи (ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии») на основе собственного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 5

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2018 г. № 109-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Киргизия KG Кыргызстандарт Молдова MD Институт стандартизации Молдовы Россия RU Росстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 августа 2018 г. № 478-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20634-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2019 г.

5    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 20634:2015 «Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение витамина В₁₂ методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии» ( «Infant formula and adult nutritionals — Determination of vitamin B₁₂ by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)», IDT)

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

© ISO, 2015 — Все права сохраняются © Стандартинформ, оформление, 2018

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Таблица 2 — Конфигурация системы для ВЭЖХ

Время, мин Конфигурация крана-переключателя потока (см. рисунок 1) 0—10,5 1 10,5—14,5 2 14,5—30,0 (или 35,0) 1

-    параметры работы изократического насоса:

-    подвижная фаза D (см. 4.12.2.4);

-    подбирают такую скорость подачи подвижной фазы, чтобы витамин В₁₂ элюировался с экс-клюзионной колонки между 10,5 мин и 14,5 мин. Типичные значения скорости подачи подвижной фазы составляют от 1,1 до 1,2 см³/мин.

Для определения подходящей скорости подачи подвижной фазы эксклюзионную колонку присоединяют непосредственно к спектрофотометрическому детектору и инжектируют стандартный раствор высокой концентрации. Подбирают такую скорость подачи подвижной фазы, чтобы витамин В₁₂ элюировался с эксклюзионной колонки между 10,5 мин и 14,5 мин;

-    параметры работы градиентного насоса:

-    подвижная фаза А (см. 4.12.2.1), В (см. 4.12.2.2) и С (см. 4.12.2.3);

-    градиентная программа, обеспечивающая элюирование витамина В₁₂ в промежуток между 24 мин и 30 мин, приведена в таблице 3.

Таблица 3 — Градиентная программа для обращенно-фазовой колонки (см. 5.3)

Время, мин Объемная доля подвижной фазы А, % Объемная доля подвижной фазы В, % Объемная доля подвижной фазы С, % 0 90 10 0 14,5 90 10 0 14,6 ГО О CD 1 О ГО О 1 О CD 0 27,0—30,0 ГО О CD 1 О ГО О 1 О CD 0 27,1—30,1 0 10 90 29,9—33,0 0 10 90 а Применительно к каждой колонке следует устанавливать подходящие условия градиентного элюирования так, чтобы обеспечивалось достаточное разделение витамина В12 и рибофлавина в промежуток приблизительно между 24 мин и 30 мин. Для определения подходящих условий градиентного элюирования применительно к новой колонке устанавливают соотношение подвижных фаз в моменты времени 14,6 мин и от 27,0 мин до 30,0 мин на середине диапазона, указанного в таблице. Инжектируют раствор для проверки степени хроматографического разделения (см. 4.12.2.12) и рассчитывают степень хроматографического разделения (R) пиков витамина В12 и рибофлавина. Подбирают состав подвижной фазы в моменты времени 14,6 мин и от 27,0 мин до 30,0 мин для достижения R > 1,5. После элюирования витамина В12 с колонки С18 или фенильной колонки, колонку промывают подвижной фазой, состоящей на 90 % из подвижной фазы С, в течение не менее 2,8 мин.

-    скорость подачи подвижной фазы 1,0 см³/мин;

-    параметры работы детектора: длина волны детектирования 550 нм и ширина полосы свето-пропускания 10 нм.

После уравновешивания системы проводят анализ градуировочных стандартных растворов и серии растворов проб. После анализа последнего раствора пробы анализируют как минимум один градуировочный стандартный раствор для проверки стабильности системы.

Образцы хроматограмм приведены в приложении А.

ГОСТ ISO 20634-2018

7 Обработка результатов

7.1    Общие положения

Содержание витамина В₁₂ в пробах рассчитывают путем соотнесения площади пика на хроматограмме раствора пробы известной массы навески с площадями пиков на хроматограммах стандартных растворов известной концентрации.

Просматривают все хроматограммы градуировочных растворов и растворов проб и контролируют, чтобы пик витамина В₁₂ был разделен со всеми остальными пиками на хроматограммах.

Площади пиков измеряются системой обработки данных. Перед расчетом содержания витамина В₁₂ в пробах сопоставляют площади пиков витамина В₁₂ на хроматограммах стандартных растворов с площадями пиков витамина В₁₂ на хроматограммах растворов проб и контролируют, чтобы площади пиков на хроматограммах растворов проб находились в границах диапазона площадей пиков на хроматограммах стандартных растворов.

7.2    Расчет концентрации стандартных растворов

Массовую концентрацию витамина В₁₂ p_ws, мкг/дм³, в градуировочных стандартных растворах (см. 4.12.3.4) вычисляют по формуле

Р ws=S_w-P-—    (2)

где — масса навески стандартного образца витамина В₁₂, мг;

Р— чистота стандартного образца витамина В₁₂ (см. 4.11) в микрограммах цианкобаламина (витамина В₁₂) на миллиграмм стандартного образца;

А— использованная аликвота стандартного раствора витамина В₁₂ промежуточной концентрации (см. 4.12.3.3), см³ (здесь: 0,5 см³, 1,0 см³, 2,0 см³, 3,0 см³, 4,0 см³ или 5,0 см³);

200 —объем приготовленного градуировочного стандартного раствора, см³.

7.3 Построение градуировочного графика

Для каждой концентрации градуировочных растворов определяют среднее арифметическое значение из площадей пиков аналита, полученных при анализе соответствующего градуировочного раствора до и после анализа серии растворов проб. Градуировочный график строят с помощью линейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов в системе координат «концентрация градуировочного раствора — площадь пика аналита».

7.4 Расчет содержания витамина В₁₂ в пробах

По градуировочному графику, построенному по 7.3, определяют массовую концентрацию витамина В₁₂ в каждом анализированном растворе пробы.

Массовую долю витамина В₁₂ в каждой пробе w_p, мг/100 г, вычисляют по формуле

V, V₂ т 1 ^wp = Р/ ■ — ■ — ■    ■    —,    (3)

где р₍— массовая концентрация витамина В₁₂ в растворе пробы для анализа, определенная по градуировочному графику, мкг/дм³;

^ — объем первого разбавления, см³ (здесь I/, = 100 см³); m_s— масса навески пробы, г;

V₂ — объем второго (окончательного) разбавления, см³;

V_f— объем фильтрата, внесенный в патрон для ТФЭ, см³; т_рг— общая масса пробы, полученной после восстановления порошкообразной пробы, г (если применимо для данного случая); т_гр — масса порошкообразной пробы, взятая для восстановления, г (если применимо для данного случая).

Примечание — т_рг и т_гр равны 1 для жидких проб и проб, испытываемых без восстановления.

9

ГОСТ ISO 20634-2018

Приложение В (справочное)

Данные по прецизионности метода

Данные, приведенные в таблице В.1, опубликованы в 2015 г. [1] и получены в результате межлабораторных испытаний, проведенных в соответствии с ISO 5725-2 [2] и Согласованным Протоколом по проведению межпабо-раторных испытаний для оценки характеристик прецизионности методов анализа [3]. В основе процедуры проведения испытаний лежали требования, указанные в библиографической ссылке [4].

Дополнительная информация о валидации метода может быть получена по ссылке http://standards.iso.org/ iso/20634.

11

ГОСТ ISO 20634-2018

Приложение С (справочное)

Типовая методика проверки пригодности патронов для твердофазной экстракции (ТФЭ)

Для установления пригодности патронов для ТФЭ или для подтверждения пригодности новой партии патронов, может использоваться следующая методика.

Готовят водный раствор витамина В₁₂ массовой концентрации 160 мкг/дм³.

Готовят три раствора пробы для анализа из одной представительной лабораторной пробы любого продукта с самым высоким содержанием белка из всех продуктов, которые предполагается анализировать по этой методике, при этом проводят экстракцию по методике, описанной в 6.2.1 и 6.2.2.

Объединяют все фильтраты растворов проб. Добавляют 1 см³ водного раствора витамина В₁₂ массовой концентрации 160 мкг/дм³ к порции фильтрата раствора пробы объемом 80 см³ или 100 см³ (проба с добавкой аналита) и 1 см³ воды к другой порции фильтрата раствора пробы объемом 80 см³ или 100 см³ (проба без добавки аналита).

Продолжают подготовку растворов проб для анализа с добавкой и без добавки аналита, при этом проводят концентрирование, и конечное разбавление проводят по методике, описанной в 6.2.3.

Проводят хроматографический анализ обоих растворов проб. Рассчитывают содержание витамина В₁₂ в пробах с добавкой и без добавки аналита и полноту обнаружения добавки.

Патроны считаются пригодными для применения, если полнота обнаружения добавки составляет не менее

90 %.

14

ГОСТ ISO 20634-2018

Библиография

[1]    2011.10, Determination of Vitamin B₁₂ in Infant, Adult, and Pediatric Formulas by HPLC-UV and Column Switching: Collaborative Study

[2]    ISO 5725-2:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method¹)

[3]    AOAC International. AOAC Official Methods Program, Associate Referee’s Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, 1995, pp. 23—51

[4]    AOAC SMPR 2011.005, Standard Method Performance Requirements for Vitamin B₁₂ in infant formula and Adult/ Pediatric Nutritional formula

[5]    Thompson M. Recent Trends in Inter-Laboratory Precision at ppb and sub-ppb Concentrations in Relation to Fitness for Purpose Criteria in Proficiency Testing. Analyst (Lond.). 2000, 125 pp. 385—386

^ Официальный перевод этого стандарта находится в Федеральном информационном фонде стандартов.

15

УДК 613.22:664:543.544.5.068.7:006.354

Ключевые слова: смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста, смеси для энтерального питания для взрослых, определение витамина В₁₂, цианкобаламин, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

БЗ 6—2018/78

Редактор Л.В. Коретникова Технический редактор И.Е. Черепкова Корректор Е.Ю. Митрофанова Компьютерная верстка Е.А. Кондрашовой

Сдано в набор 10.08.2018. Подписано в печать 21.08.2018. Формат 60*84%. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 2,32. Уч.-изд. л. 2,10.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Создано в единичном исполнении ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» для комплектования Федерального информационного фонда стандартов,

123001 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru info@gostinfo.ru

ГОСТ ISO 20634-2018

Содержание

1    Область применения.................................................................1

2    Термины и определения...............................................................1

3    Сущность метода....................................................................1

4    Реактивы и материалы................................................................2

5    Лабораторное оборудование...........................................................4

6    Процедура проведения испытания......................................................5

7    Обработка результатов...............................................................9

Приложение А (справочное) Примеры хроматограмм.......................................10

Приложение В (справочное) Данные по прецизионности    метода..............................11

Приложение С (справочное) Типовая методика проверки пригодности патронов

для твердофазной экстракции (ТФЭ)........................................14

Библиография.......................................................................15

III

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

СМЕСИ АДАПТИРОВАННЫЕ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА И СМЕСИ ДЛЯ ЭНТЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ ВЗРОСЛЫХ

Определение витамина В₁₂ методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

Infant formula and adult nutritionals.

Determination of vitamin B₁₂ by reversed phase high performance liquid chromatography

Дата введения —2019—09—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод количественного определения витамина В₁₂ в адаптированных смесях для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смесях для энтерального питания для взрослых (порошках, готовых к употреблению жидких продуктах и жидких концентратах) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2    Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1    витамин В₁₂: Цианкобаламин или другие корриноиды, содержащие кобальт, обладающие биологической активностью витамина В₁₂, такие как аквокобаламин, гидроксикобаламин, метилкоба-ламин и аденозилкобаламин, преобразуемые в цианкобаламин.

2.2    смесь для энтерального питания для взрослых (adult nutritional): Полноценный в питательном отношении специализированный пищевой продукт, изготовленный из молока, сои, риса, молочной сыворотки, гидролизата белка, крахмала и аминокислот в любом сочетании, содержащий или не содержащий интактный белок, употребляемый в жидком виде, который может являться единственным источником питания.

Примечание — Определение термина 2.2¹).

2.3    адаптированная смесь для искусственного вскармливания детей раннего возраста

(infant formula): Заменитель грудного молока, специально изготовленный для того, чтобы полностью удовлетворять потребности в питании младенцев первых месяцев жизни до введения соответствующего дополнительного питания.

Примечание — Определение термина 2.3¹).

3 Сущность метода

Цианкобаламин и другие корриноиды, содержащие кобальт, экстрагируют из пробы буферным раствором ацетата натрия (pH = 4,5 ед. pH), последние преобразуют в цианкобаламин с помощью цианида калия при 105 °С. Экстракт очищают и концентрируют на патронах для твердофазной экстракции с сорбентом — модифицированным С8 или С18 силикагелем, после чего анализируют методом эксклю-

'О Определения терминов 2.2 и 2.3 взято из Codex Standard 72—1981.

Издание официальное

зионной и обращенно-фазовой хроматографии. Количественное определение витамина В₁₂ проводят методом жидкостной хроматографии с детектированием в видимой области спектра при длине волны 550 нм.

4 Реактивы и материалы

Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду или аналогичную по чистоте воду.

4.1    Кислота уксусная ледяная.

4.2    Ацетонитрил для ВЭЖХ.

4.3    Дриерит (осушающий агент, представляющий собой безводный сульфат кальция размером частиц 8 меш).

4.4    Этанол денатурированный.

4.5    Кислота муравьиная массовой долей основного вещества не менее 88 %.

4.6    Калий цианистый массовой долей основного вещества не менее 97 %.

4.7    Рибофлавин массовой долей основного вещества от 98 % до 102 %.

4.8    Натрий уксуснокислый безводный или трехводный.

4.9    Фермент така-диастаза¹).

4.10    Триэтиламин для ВЭЖХ.

4.11    Витамин В₁₂ (цианкобаламин), первичный стандартный образец сравнения²). Следует хранить в эксикаторе в условиях защиты от дневного света.

4.12    Приготовление растворов реактивов и стандартных растворов

4.12.1    Общие положения

Все растворы допускается готовить в большем или меньшем объеме при условии соблюдения правил надлежащей лабораторной практики. Растворы можно хранить в охлажденном виде или при комнатной температуре в плотно укупоренных емкостях из инертных материалов, если не оговорено другое.

4.12.2    Приготовление растворов реактивов

4.12.2.1    Подвижная фазаАдля ВЭЖХ

Растворяют 4,0 см³ триэтиламина в 1 000 см³ воды. Доводят pH раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности — одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.2    Подвижная фаза В для ВЭЖХ

Смешивают 4,0 см³ триэтиламина и 250 см³ ацетонитрила с 750 см³ воды. Доводят pH раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7 ед. pH, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности — одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.3    Подвижная фаза С для ВЭЖХ

Смешивают 4,0 см³ триэтиламина и 750 см³ ацетонитрила с 250 см³ воды. Доводят pH раствора до значения, лежащего в интервале от 5 до 7, добавлением приблизительно 1,25 см³ концентрированной муравьиной кислоты (см. 4.5). Срок годности — одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.4    Подвижная фаза D для ВЭЖХ

Разбавляют 50 см³ ацетонитрила водой до объема 2 000 см³. Срок годности — одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

ГОСТ ISO 20634-2018

4.12.2.5    Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10 %

Разбавляют 150 см³ ацетонитрила водой до объема 1 500 см³. Срок годности — одна неделя при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.6    Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 30 % (элюент для твердофазной экстракции)

Разбавляют 30 см³ ацетонитрила водой до объема 100 см³. Срок годности — 1 мес при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.7    Смесь ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 50 % (раствор для промывки и хранения колонки)

Разбавляют 500 см³ ацетонитрила водой до объема 1 000 см³. Срок годности — 6 мес при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.8    Смесь этанола с водой объемной долей этанола 25 %

Разбавляют 50 см³ этанола водой до объема 200 см³. Срок годности — один год при хранении в плотно укупоренной емкости.

4.12.2.9    Раствор цианида калия массовой концентрации р = 4 г/дм³

Растворяют 0,02 г цианида калия в ацетатном буферном растворе (см. 4.12.2.11) концентрации 0,25 моль/дм³ и доводят объем раствора этим буферным раствором до 5 см³. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

4.12.2.10    Раствор цианида калия массовой концентрации р = 10 г/дм³

Растворяют 0,25 г цианида калия в воде и доводят объем раствора до 25 см³. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

4.12.2.11    Буферный раствор ацетата натрия концентрации с = 0,25 моль/дм³

Растворяют 41,0 г безводного ацетата натрия или 68,0 г трехводного ацетата натрия приблизительно в 1800 см³ воды. Значение pH раствора доводят до 4,6 ед. pH концентрированной уксусной кислотой (около 40 см³). Разбавляют водой до 2000 см³. Срок годности раствора — 3 мес.

4.12.2.12    Раствор для проверки степени хроматографического разделения

Берут навеску около 0,005 г рибофлавина на бумаге для взвешивания. Навеску переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем содержимого колбы до метки смесью ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10 %. Раствор перемешивают до достижения растворения. Смешивают равные объемы полученного раствора и градуировочного раствора витамина В₁₂ самой высокой концентрации. Срок годности раствора — одна неделя.

4.12.2.13    Раствор така-диастазы массовой концентрации р = 60 г/дм³

Растворяют 0,6 г така-диастазы в 10 см³ воды. Раствор готовят в день использования.

4.12.3 Приготовление стандартных растворов

4.12.3.1    Общие положения

Все стандартные растворы готовят при свете люминесцентной лампы с применением светового экрана, задерживающего ультрафиолетовое излучение, и хранят при температуре от 2 °С до 8 °С в плотно укупоренных мерных колбах.

4.12.3.2    Основной стандартный раствор витамина В₁₂ массовой концентрации р = 10 000 мкг/дм³

Берут точную навеску стандартного образца витамина В₁₂ (см. 4.11) такой массы, чтобы концентрация основного стандартного раствора составила 10 000 мкг/дм³. Растворяют в смеси этанола с водой объемной долей этанола 25 % (см. 4.12.2.8), объем раствора доводят до 100 см³ тем же растворителем. Срок годности раствора — 6 мес.

Необходимую массу навески стандартного образца витамина B₁₂m_w, мг, вычисляют по формуле

1

m_w= 10 000 0,1 —,    (1)

где 10 000 — требуемая концентрация основного стандартного раствора, мкг/дм³;

0,1 — объем разбавления, дм³;

Р— чистота стандартного образца витамина В₁₂ (см. 4.11) в микрограммах цианкобаламина на миллиграмм стандартного образца.

4.12.3.3    Стандартный раствор витамина В₁₂ промежуточной концентрации р = 1 000 мкг/дм³

Разбавляют 10 см³ основного стандартного раствора (см. 4.12.3.2) до 100 см³ водой. Срок годности раствора — одна неделя.

3

4.12.3.4 Градуировочные стандартные растворы витамина В₁₂ массовыми концентрациями от р = 2,5 мкг/дм^{4 5 6} до р = 25 мкг/дм⁶

В отдельных мерных колбах разбавляют 0,5 см⁶, 1 см⁶, 2 см⁶, 3 см⁶, 4 см⁶ и 5 см⁶ стандартного раствора промежуточной концентрации (см. 4.12.3.3) до 200 см⁶ смесью ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 10 % (см. 4.12.2.5). Срок годности растворов — 1 мес.

5 Лабораторное оборудование

5.1    Система для ВЭЖХ, состоящая из градиентного насоса, крана переключения колонок, изокра-тического насоса, спектрофотометрического детектора с вольфрамовой лампой накаливания, пригодного для детектирования при 550 нм и автосамплера, пригодного для ввода проб объемом от 900 мм⁶ до 2 000 мм⁶.

5.2    Колонка для ВЭЖХ аналитическая эксклюзионная со следующими характеристиками:

- размером частиц сорбента 4 мкм, длиной 250 мм, внутренним диаметром 9,4 мм¹).

- размером частиц сорбента 5 мкм, длиной 300 мм, внутренним диаметром 8 мм⁷).

5.3    Колонка для ВЭЖХ аналитическая обращенно-фазовая со следующими характеристиками:

-    заполненная сорбентом типа С18, размером частиц сорбента 3 мкм, длиной 100 мм, внутренним диаметром 4,6 мм⁶) с предколонкой размером частиц сорбента 3 мкм, длиной 10 мм, внутренним диаметром 4,6 мм⁸);

-    заполненная фенилгексильным сорбентом размером частиц 3 мкм и размером пор 120 ангстрем, длиной 100 мм и внутренним диаметром 4,6 мм⁹), с подходящей предколонкой, или аналогичная обращенно-фазовая колонка, совместимая с подвижной фазой, состоящей на 100 % из воды.

5.4    Термостат суховоздушный, пригодный для поддержания температур (95 ± 5) °С и (105 ± 5) °С.

5.5    pH-метр в комплекте с калибровочными буферными растворами.

5.6    Весы аналитические точностью не менее 0,00001 г.

5.7    Стаканы лабораторные стеклянные различной вместимости.

5.8    Дозирующая насадка на бутыль, обеспечивающая объем дозирования 30 см⁶ или аналогичная.

5.9    Цилиндры градуированные стеклянные различной вместимости.

5.10    Эксикатор.

5.11    Колбы конические вместимостью 125 см⁸ или аналогичная стеклянная посуда.

5.12    Бумага фильтровальная¹⁰) или аналогичная.

ГОСТ ISO 20634-2018

5.13    Воронки пластиковые, пригодные для использования с фильтровальной бумагой.

5.14    Перчатки одноразовые.

5.15    Дозатор пипеточный переменного объема дозирования от 100 мм^{11 7 12 13 14} до 1 ООО мм¹².

5.16    Лабораторные световые экраны, желтые или бесцветные экраны с границей пропускания не ниже 385 нм.

5.17    Патроны для твердофазной экстракции (ТФЭ) с сорбентом — силикагелем, модифицированным группами С8, массой сорбента 900 мг¹), или модифицированным группами С18, массой сорбента 900 мг²) или аналогичные. Типовая методика проверки пригодности патронов для ТФЭ приведена в приложении С.

5.18    Шприцы одноразовые различной вместимости.

5.19    Насадка на шприц фильтрующая, с нейлоновым фильтром диаметром пор 0,45 мкм.

5.20    Установка вакуумная для твердофазной экстракции (манифолд) на 24 гнезда с запорными кранами или аналогичная установка.

5.21    Пипетки с одной отметкой различной вместимости.

5.22    Колбы мерные различной вместимости.

6 Процедура проведения испытания

6.1    Общие положения

Подготовку всех проб проводят при свете люминесцентной лампы с применением светового экрана, задерживающего ультрафиолетовое излучение. Анализ приготовленных растворов проб можно провести не позднее чем через 14 дней после их приготовления при хранении растворов проб при температуре от 2 °С до 8 °С в плотно укупоренных мерных колбах. Все пробы продуктов должны быть однородными и представительными, насколько это возможно. Этого достигают путем тщательного перемешивания или взбалтывания продукта перед отбором пробы.

6.2    Приготовление растворов проб для анализа

6.2.1    Общие положения

При испытании продуктов, содержащих крахмал, добавляют 1 см¹² раствора така-диастазы (см. 4.12.2.13). Дожидаются прохождения реакции така-диастазы с пробой в течение 30 мин прежде, чем перейти к этапу экстракции.

6.2.1.1    Жидкие пробы

При испытании жидких продуктов, готовых к употреблению, лабораторную пробу тщательно перемешивают для обеспечения гомогенности и берут точную навеску смеси для энтерального питания для взрослых массой около 20,0 г или адаптированной смеси для искусственного вскармливания детей раннего возраста массой около 25,0 г, которую помещают в мерную колбу вместимостью 100 см¹². Далее переходят к этапу экстракции.

6.2.1.2    Порошкообразные пробы

Если степень гомогенности порошкообразной пробы неизвестна, исходят из предположения, что проба не гомогенна, и все операции с ней проводят, как с пробами сухих порошкообразных смесей (см. 6.2.1.3).

6.2.1.3    Пробы сухих порошкообразных смесей

При испытании проб негомогенных сухих порошкообразных смесей берут точную навеску массой около 25,0 г. Добавляют 200,0 г воды, предварительно нагретой до 40 °С, и перемешивают до получения гомогенной суспензии. При необходимости используют гомогенизатор. Из полученной суспензии берут точную навеску смеси для энтерального питания для взрослых массой около 20,0 г или адаптирован-

ной смеси для искусственного вскармливания детей раннего возраста массой около 25,0 г, которую помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³.

6.2.1.4    Пробы влажных порошкообразных смесей

При испытании проб влажных порошкообразных смесей точную навеску пробы массой около 3,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³. Добавляют 25 см³ воды и перемешивают до полного растворения порошка.

6.2.1.5    Смеси, предназначенные для элементного питания

При испытании продуктов, содержащих свободные аминокислоты и не содержащих интактный белок, добавляют 0,5 г казеината кальция или обезжиренного сухого молока к навеске пробы гомогенной влажной порошкообразной смеси массой 3,0 г, разбавленной 25 см³ воды, или к навеске негомогенной жидкой пробы или восстановленной сухой порошкообразной смеси массой от 20 до 25 г. Тщательно перемешивают для растворения белка, после чего сразу же добавляют 30 см³ буферного раствора ацетата натрия (см. 4.12.2.11) и 1 см³ раствора цианида калия массовой концентрации 10 г/дм³. Разбавляют до требуемого объема водой, фильтруют, фильтрат подвергают очистке и концентрированию до 60 см³ на предварительно кондиционированном патроне С8 или С18 массой сорбента 900 мг. Нагрев пробы в термостате при 105 °С не проводят.

6.2.2    Экстракция

К каждому раствору пробы для анализа добавляют 30 см³ буферного раствора ацетата натрия (см. 4.12.2.11) и взбалтывают до полного перемешивания. В вытяжном шкафу к раствору каждой пробы добавляют 1 см³ свежеприготовленного раствора цианида калия массовой концентрации 10 г/дм³ (см. 4.12.2.10) и взбалтывают до перемешивания. Растворы проб выдерживают в термостате при 105 °С в течение не менее 60 мин, но не более 120 мин. Следует принимать во внимание, что температура в термостате понизится при открывании дверцы. Отсчет времени начинают с момента повторного достижения температуры в термостате 105 °С.

Вынимают растворы проб из термостата и сразу же охлаждают на бане со льдом. Разбавляют растворы проб до заданного объема водой и тщательно перемешивают. Растворы проб фильтруют через фильтровальную бумагу (см. 5.12) в коническую колбу вместимостью 125 см³ или аналогичную стеклянную емкость. При необходимости допускается заменять фильтр, если он засоряется. Если приготовленные растворы проб непрозрачны и содержат нерастворимые частицы очень малого размера, их центрифугируют и переносят надосадочную жидкость в воронки с уложенной в них фильтровальной бумагой. Растворы проб, в которые был добавлен казеинат кальция, нагревать не допускается (см. 6.2.1.5).

6.2.3    Концентрирование растворов проб

Для очистки и концентрирования раствора пробы поверх запорного крана вакуумного манифолда помещают патрон для ТФЭ массой сорбента 900 мг (см. 5.17) и в верхнее отверстие патрона устанавливают цилиндр одноразового шприца вместимостью 30 см³. Каждый патрон кондиционируют не менее 20 см³ ацетонитрила (пропускание под действием силы тяжести), после чего промывают не менее 20 см³ воды. С помощью пипеток с одной отметкой в патроны вносят фильтраты растворов проб, руководствуясь указаниями в таблице 1. Если концентрация витамина В₁₂ неизвестна, руководствуются указаниями для готовых к употреблению продуктов, содержащих от 1 мкг/дм³ до 10 мкг/дм³ витамина В₁₂. При необходимости применяют вакуум так, чтобы обеспечивалась постоянная скорость протекания растворов проб через патроны. Скорость протекания растворов проб через патроны не должна превышать 120 капель в минуту. Элюат отбрасывают.

Таблица 1 —Указания по внесению фильтратов растворов проб в патроны для ТФЭ

Витамин В12 в продуктах, готовых к употреблению, мкг/дм3 Объем фильтрата, внесенный в патрон для ТФЭ, см3 Конечный объем разбавления, см3 < 1 80 5 1—10 70—80 10 11—20 50—60 10 21—50 20—40 10 Примечание — Не следует вносить более 60 см3 растворов проб смесей для энтерального питания для взрослых на патроны Alltech С8 или С18.

ГОСТ ISO 20634-2018

После протекания через патрон всего фильтрата раствора пробы каждый патрон промывают 5 см³ воды, элюат отбрасывают. Высушивают каждый патрон потоком воздуха путем приложения вакуума до полного прекращения вытекания элюата. Закрывают все запорные краны.

Руководствуясь указаниями в таблице 1, под каждый патрон помещают мерную колбу вместимостью 5 см³ или 10 см³. В каждый патрон вносят 4,4 см³ смеси ацетонитрила с водой объемной долей ацетонитрила 30 % (см. 4.12.2.6). Открывают все запорные краны и элюируют витамин В₁₂ с применением вакуума в мерные колбы. Элюент должен протекать через патроны со скоростью не более 120 капель в минуту.

При разбавлении на конечной стадии растворы проб, собранные в мерные колбы вместимостью 10 см³, разбавляют до метки водой.

В случае растворов проб, собранных в мерные колбы вместимостью 5 см³, в вытяжном шкафу в каждую колбу добавляют по 0,1 см³ свежеприготовленного раствора цианида калия концентрации 4 г/дм³ (см. 4.12.2.9). Подготовленные таким образом растворы проб помещают в термостат, нагретый до температуры 95 °С, не менее чем на 1,5 ч, но не более чем на 4 ч. Далее вынимают растворы проб из термостата и охлаждают до комнатной температуры. Объем содержимого в колбах доводят водой до метки.

Фильтруют аликвоты каждого стандартного раствора и приготовленного раствора пробы через фильтрующую насадку на шприц (см. 5.19) в виалу автосамплера.

6.3 Хроматографический анализ

6.3.1 Устройство и конфигурация хроматографической системы

Устройство и конфигурация системы для ВЭЖХ приведены на рисунке 1.

Конфигурация 1    Конфигурация    2

1 — изократический насос; 2 — автосамплер; 3 — аналитическая эксклюзионная колонка; 4 — аналитическая колонка С18; 5 — градиентный насос; 6 — спектрофотометрический детектор; 7 — емкость для сбора элюата

Рисунок 1 —Устройство и конфигурация системы для ВЭЖХ

6.3.2 Параметры работы хроматографической системы:

-    продолжительность одного анализа: от 30 до 35 мин;

-    объем инжекции: от 0,9 до 2,0 см³;

-    конфигурация системы: см. таблицу 2.

7

1

)    Например, производства Accurate Chemical Со или аналогичная. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

2

)    Например, USP Reference 1152009 массовой долей (приблизительно 10 мкг/мг). Это пример подходящего

3

изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

4

)    Например, Zorbax GF-250, каталожный номер 884973-901. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

5

)    Например, Shodex Protein® KW-802.5, каталожный номер F6989000 или аналогичная. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

6

)    Например, Thermo Scientific Aquasil™, каталожный номер 77503-104630. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

7

) Например, Alltech/Grace Davidson, каталожный номер 20942. Это пример подходящего изделия, доступ

8

)    Например, Thermo Scientific Aquasil™, каталожный номер 77503-014001. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

9

)    Например, Epic Phenyl Hexyl, ES Industries 125191-EPHX. Это пример подходящего продукта, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

10

6)    Например, Whatman 2V. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

4

11

”0 Например, Alltech/Grace Davidson, каталожный номер 20966. Это пример подходящего изделия, доступного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

12

ного в коммерческой сети. Информация приведена для удобства пользователей этого стандарта и не является

13

рекламной поддержкой указанного изделия. Допускается использовать аналогичные изделия, если может быть показано, что они приводят к таким же результатам.

14