ГОСТ ISO 20633-2018
Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение содержания витамина E и витамина A с помощью нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION (ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

СМЕСИ АДАПТИРОВАННЫЕ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА И СМЕСИ ДЛЯ ЭНТЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ ВЗРОСЛЫХ

Определение содержания витамина Е и витамина А с помощью нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

(ISO 20633:2015, ЮТ)

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2018

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи» (ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии») на основе собственного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 5

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2018 г. № 109-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Институт стандартизации Молдовы
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 августа 2018 г. № 514-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 20633-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2019 г.

5    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 20633:2015 «Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение содержания витамина Е и витамина А с помощью нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии» («Infant formula and adult nutritionals — Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography», IDT)

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

© ISO, 2015 — Все права сохраняются © Стандартинформ, оформление, 2018

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ ISO 20633-2018

1 — 13-цис-изомер; 2 — цис-изомер; 3 — транс-изомер; X — время, мин; У — ед. опт. плотности (mAU)

Рисунок А.2 —Хроматограмма ретинола пальмитата в исследуемом образце

1 — 13-цис-изомер; 2 — транс-изомер; X — время, мин; У — ед. опт. плотности (mAU)

Рисунок А.З —Хроматограмма градуировочного раствора ретинола ацетата

9

ГОСТ ISO 20633-2018

1 — 13-цис-изомер; 2 — цис-изомер; 3 — транс-изомер; X — время, мин; У — ед. опт. плотности (mAU)

Рисунок А.4 — Хроматограмма ретинола ацетата в исследуемом образце

1 — а-токоферола ацетат; 2 — а-токоферол; X — время, мин; У — ед. опт. плотности (mAU)

Рисунок А.5 — Хроматограмма градуировочного раствора смеси а-токоферола ацетата и а-токоферола

10

Приложение В (справочное)

Данные по прецизионности

Данные, приведенные в таблицах В. 1, В.2 и В.3, были опубликованы в 2015 г. [2] и получены в результате проведения межлабораторных испытаний в соответствии с ISO 5725-2 [3] и Согласованным протоколом AOAC-IUPAC по проведению межлабораторных испытаний для оценки характеристик прецизионности методов анализа [4]. В основе процедуры проведения испытаний лежали требования, указанные в библиографических ссылках [5] и [6].

Дополнительную информацию по валидации метода анализа можно получить по адресу http://standards.iso.org/iso/20633.

Таблица В.1 — Данные по прецизионности для ретинола ацетата (1^а и 2^Ь) и ретинола пальмитата (3^е—8^h) в пересчете на ретинол

Образцы	1а	2Ь	3CJ	4d	5е	6f	79	8h
Год проведения межлабораторных испытаний	2014	2014	2014	2014	2014	2014	2014	2014
Число лабораторий	15	15	15	15	15	15	15	15
Число лабораторий, не отвечающих требованиям	0	0	0	0	0	0	0	0
Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов	15	12	15	15	15	14	14	15
Число исключенных лабораторий	0	3	0	0	0	1	1	0
Число принятых результатов	30	24	30	30	30	28	28	30
Общее среднее х, мкг/100 г RTF'	46,34	67,39	6,49	47,55	62,56	66,58	57,34	48,35
Стандартное отклонение повторяемости sn мкг/100 г RTF'	7,69	1,55	0,21	7,50	4,28	0,75	0,61	7,31
Стандартное отклонение воспроизводимости SR, мкг/100 г	10,48	8,04	0,52	10,33	6,04	4,33	4,13	7,86
Коэффициент вариации повторяемости cVr %	16,60	2,30	3,26	15,78	6,84	1,13	1,06	15,13
Коэффициент вариации воспроизводимости cVR, %	22,61	11,93	8,02	21,73	9,66	6,51	7,20	16,25
Предел повторяемости г (г = 2,8sr), мкг/100 г RTF	21,54	4,34	0,59	21,01	11,98	2,10	1,70	20,48
Предел воспроизводимости R (R = 2,8sR), мкг/100 г RTF	29,34	22,52	1,46	28,92	16,91	12,13	11,56	21,99
Индекс воспроизводимости Горвица (HorRat R index) [7]	1,25	0,69	0,33	1,20	0,56	0,38	0,41	0,91
а Порошкообразные смеси для питания взрослых на основе молочного белка. ь Порошкообразные адаптированные смеси для питания детей раннего возраста на основе частично гидролизованного белка соевых бобов. с SRM 1849а. d Порошкообразное смеси для питания взрослых с низким содержанием жира. е Порошкообразные адаптированные смеси для питания детей раннего возраста на основе белка соевых бобов. f Порошкообразные адаптированные смеси для питания детей раннего возраста на основе молока. э Адаптированные смеси для питания детей раннего возраста на основе молока RTF. h Порошкообразное элементное питание для детей раннего возраста. ' RTF, смесь, готовая к употреблению. j мг/кг порошка. Примечания 1    Результаты представлены в пересчете на мкг ретинола в 100 г RTF. 2    Результаты анализа SRM 1849а оказались ниже гарантированных значений, возможно, из-за несоответствующих условий хранения входе межпабораторных испытаний. Гарантированные значения [(7,68 ± 0,23) мг/кг] были получены только в одной лаборатории, участвующей в совместных исследованиях образца [10].

Таблица В.2 — Данные по прецизионности для витамина Е (а-токоферола)

Образцы 1а 2Ь 3CJ 4d 5е 6f 79 8h Год проведения испытаний 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 Число лабораторий 15 15 15 15 15 15 15 15 Число лабораторий, не отвечающих требованиям 0 0 0 0 0 0 0 0 Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов 14 11 14 14 14 13 14 14 Число исключенных лабораторий 1 4 1 1 1 0 1 1 Число принятых результатов 28 22 28 28 28 26 28 28 Общее среднее х, мкг/100 г RTF' 0,58 0,48 36,38 0,14 0,46 0,49 0,45 0,41 Стандартное отклонение повторяемости sr мкг/100 г RTF' 0,023 0,008 2,103 0,012 0,036 0,008 0,012 0,064 Стандартное отклонение воспроизводимости SR, мкг/100 г 0,052 0,057 4,539 0,061 0,040 0,279 0,035 0,072 Коэффициент вариации повторяемости CVp % 3,99 1,67 5,78 8,90 7,89 1,57 2,59 15,48 Коэффициент вариации воспроизводимости cVR, % 9,10 11,94 12,47 43,56 8,74 5,68 7,73 17,44 Предел повторяемости г (г = 2,8sr), мкг/100 г RTF 0,064 0,022 5,889 0,035 0,101 0,022 0,033 0,178 Предел воспроизводимости R(R = 2,8sR), мкг/100 г RTF 0,147 0,159 12,71 0,170 0,112 0,078 0,098 0,201 Индекс воспроизводимости Горвица R (HorRat R index) [7] 0,930 0,920 1,870 2,180 0,680 0,440 0,600 1,340 а Порошкообразное питание для взрослых на основе молочного белка. ь Порошкообразное питание для детей раннего возраста на основе частично гидролизованного белка соевых бобов. с SRM 1849а. d Порошкообразное питание для взрослых с низким содержанием жира. е Порошкообразное питание для детей раннего возраста на основе белка соевых бобов. f Порошкообразное питание для детей раннего возраста на основе молока. 9 Питание для детей раннего возраста на основе молока RTF. h Порошкообразное элементное питание для детей раннего возраста. ' RTF, смесь, готовая к употреблению, j мг/кг порошка.

Таблица В.З — Данные по прецизионности для витамина Е (а-токоферола ацетата)

Образцы 1а 2Ь 3CJ 4d 5е 6f 79 8h Год проведения испытаний 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 Число лабораторий 15 15 15 15 15 15 15 15 Число лабораторий, не отвечающих требованиям 0 0 0 0 0 0 0 0 Число лабораторий, оставшихся после исключения выбросов 14 15 14 13 14 13 13 15 Число исключенных лабораторий 1 0 0 0 0 2 2 0

Окончание таблицы В.З

Образцы 1а 2Ь 3CJ 4d 5е 6f 79 8h Число принятых результатов 28 30 28 26 28 26 26 30 Общее среднее х, мкг/100 г RTF' 12,73 1,80 172,89 1,84 1,30 1,44 1,56 1,79 Стандартное отклонение повторяемости sr мкг/100 г RTF' 0,489 0,066 3,374 0,388 0,022 0,021 0,009 0,061 Стандартное отклонение воспроизводимости SR, мкг/100 г 0,926 0,203 14,991 0,156 0,084 0,067 0,065 0,119 Коэффициент вариации повторяемости CVp % 3,84 3,65 1,95 2,11 1,67 1,43 0,60 3,38 Коэффициент вариации воспроизводимости ^Уо 7,28 11,25 8,67 8,50 6,47 4,62 4,15 6,66 Предел повторяемости г (г = 2,8sr), мкг/100 г RTF 1,369 0,184 9,447 0,109 0,061 0,058 0,026 0,170 Предел воспроизводимости R (R = 2,8sR), мкг/100 г RTF 2,594 0,567 41,976 0,437 0,236 0,187 0,181 0,334 Индекс воспроизводимости Горвица R (HorRat R index) [7] 0,330 1,070 0,580 0,810 0,580 0,42 0,380 0,630 а Сухая смесь для питания взрослых на основе молочного белка. ь Сухая адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе частично гидролизованного белка соевых бобов. с SRM 1849а. d Сухая смесь для питания взрослых с низким содержанием жира. е Сухая смесь для питания детей раннего возраста на основе белка соевых бобов. f Сухая смесь для питания детей раннего возраста на основе молока, э Адаптированная смесь для детей раннего возраста на основе молока RTF. h Сухая адаптированная смесь для питания детей раннего возраста. ' RTF, смесь, готовая к употреблению, j мг/кг порошка.

14

ГОСТ ISO 20633-2018

Приложение С (справочное)

Сравнение методов АОАС 2012.10, EN 12822 и EN 12823-1

Для обеспечения сопоставимости данных, полученных методами EN 12822 [8], EN 12823-1 [9] и АОАС 2012.10 [10], были проанализированы одинаковые образцы. Для сравнения данные представлены в таблицах С.1 и С.2 и показаны на рисунках С.1 и С.2.

Таблица С.1 — Сравнение данных для витамина А

	АОАС 2012.10	АОАС 2012.10	EN 12823-1	EN 12823-1	EN 12823-1
Образцы	п = от 11 до 15 лабораторий	п = от 11 до 15 лабораторий	Лаборатория 1	Лаборатория 2	Лаборатория 3
	мг/100 г RTF3	CV,R’ %	мг/100 г RTF	мг/100 г RTF	мг/100 г RTF
Сухая смесь на основе молочного белка для энтерального питания взрослых	46,34	22,61	48,29	50,84	38,07
Сухая адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе частично гидролизованного белка соевых бобов	67,39	11,93	74,93	76,92	51,28
SRM 1849а	6,49ь	8,02	7,38	6,99	6,14
Сухая смесь с низким содержанием жира для энтерального питания взрослых	47,55	21,73	62,16	61,16	53,61
Сухая адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе белка соевых бобов	62,56	9,66	69,71	72,59	58,16
Сухая адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе молока	66,58	6,51	70,60	69,71	60,27
Адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе молока RTF	57,34	7,20	68,35	67,00	58,00
Элементное питание для детей раннего возраста	48,35	16,25	47,51	47,29	37,30

На рисунке С.1 значения, полученные методом EN 12823-1 тремя участвующими лабораториями, нанесены на график против данных ±2 C_VR, полученных методом АОАС 2012.10 в ходе межлабораторных испытаний (MLT), в которых приняли участие от 11 до 15 лабораторий. Границы 2 C_VR включали 95 % данных, полученных методом АОАС 2012.10.

Примечание — Результаты, полученные методом EN 12823-1 тремя участвующими лабораториями, нанесены на график против данных ± 2 C_VR, полученных методом АОАС 2012.10 в ходе межлабораторных испытаний (MLT), в которых приняли участие от 11 до 15 лабораторий. Данные трех участвующих лабораторий были стандартизованы относительно среднего значения, полученного методом АОАС 2012.10.

Рисунок С.1 — Сравнение методов определения витамина А

Таблица С.2 — Сравнение данных для витамина Е (а-токоферола ацетат плюс а-токоферол в пересчете на а-токоферол)

Образцы	АОАС 2012.10	АОАС 2012.10	EN 12822	EN 12822	EN 12822
	п = от 11 до 15 лабораторий	п = от 11 до 15 лабораторий	Лаборатория 1	Лаборатория 2	Лаборатория 3
	мг/100 г RTF3	С\/,№ %	мг/100 г RTF	мг/100 г RTF	мг/100 г RTF
Сухая смесь на основе молочного белка для энтерального питания взрослых	12,18	7,17	11,32		12,32
Сухая адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе частично гидролизованного белка соевых бобов	2,12	10,15	2,09	1,78	2,04
SRM 1849а	193,90ь	3,91	186,50	125,00	191,00
Сухая смесь с низким содержанием жира для энтерального питания взрослых	1,82	10,78	1,71	1,50	1,80
Сухая адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе белка соевых бобов	1,64	4,22	1,58	1,55	1,68

Окончание таблицы С. 2

АОАС 2012.10 АОАС 2012.10 EN 12822 EN 12822 EN 12822 Образцы п = от 11 до 15 лабораторий п = от 11 до 15 лабораторий Лаборатория 1 Лаборатория 2 Лаборатория 3 мг/100 г RTF3 CVR, % мг/100 г RTF мг/100 г RTF мг/100 г RTF Сухая адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе молока 1,80 4,13 1,69 1,54 1,83 Адаптированная смесь для питания детей раннего возраста на основе молока RTF 1,87 3,84 1,86 1,30 1,88 Элементное питание для детей раннего возраста 1,77 5,55 1,81 1,70 2,03

На рисунке С.2 данные испытаний, полученные методом EN 12822 тремя лабораториями, нанесены на график против данных ± 2 C_VR, полученных методом АОАС 2012.10 в ходе межлабораторных испытаний (MLT), в которых приняли участие от 11 до 15 лабораторий. Границы 2 C_VR включали 95 % данных, полученных с помощью метода валидации АОАС 2012.10.

Примечание — На рисунке приведены результаты определения витамина Е (а-токоферола ацетат плюс а-токоферол в пересчете на а-токоферол), полученные методом EN 12822 тремя лабораториями. Данные испытаний нанесены на график против данных 2 C_VR, полученных методом АОАС 2012.10 в ходе межлабораторных испытаний, в которых приняли участие от 11 до 15 лабораторий. Данные трех участвующих лабораторий были стандартизованы относительно среднего значения, полученного методом АОАС 2012.10.

Рисунок С.2 — Сравнение методов определения витамина Е

17

ГОСТ ISO 20633-2018

Содержание

1    Область применения.................................................................1

2    Термины и определения ..............................................................1

3    Сущность метода....................................................................1

4    Реактивы и материалы ...............................................................2

5    Средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы ..........................5

6    Проведение испытаний...............................................................6

7    Оценка пригодности условий хроматографического анализа ................................7

8    Обработка результатов ...............................................................7

Приложение А (справочное) Примеры хроматограмм........................................8

Приложение В (справочное) Данные по прецизионности ....................................12

Приложение С (справочное) Сравнение методов АОАС 2012.10, EN 12822 и EN 12823-1 ......... 15

Библиография .......................................................................18

Библиография

[1]    Eitenmiller R.R., Landen Jr W.O. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences; CRC Press

[2]    OMA 2012.10. Simultaneous Determination of 13-Cis and all-trans Vitamin A Palmitate (retinyl palmitate), Vitamin A Acetate (retinyl acetate), and Total Vitamin E (a-Tocopherol and DL-a-Tocopherol Acetate) in Infant Formula and Adult Nutritionals by Normal Phase HPLC: Collaborative Study

[3]    ISO 5725-2:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2: Basic method

for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method [Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений]*

[4]    АОАС INTERNATIONAL. АОАС Official Methods Program, Associate Referee’s Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IVAOAC Guidelines for Collaborative Studies, 1995, pp. 23—51

[5]    AOAC SMPR 2011.003. Standard Method Performance Requirements for Vitamin A in infant formula and Adult/ Pediatric Nutritional formula

[6]    AOAC SMPR 2011.010. Standard Method Performance Requirements for Vitamin E in infant formula and Adult/ Pediatric Nutritional formula

[7]    Thompson M. Recent Trends in Inter-Laboratory Precision at ppb and sub-ppb Concentrations in Relation to Fitness for Purpose Criteria in Proficiency Testing. Analyst (Lond.). 2000, 125, pp. 385—386

[8]    EN 12822:2014 Foodstuffs — Determination of vitamin E by high performance liquid chromatography —

Measurement of a-, (5-, y- and S-tocopherols

(Продукты пищевые. Определение витамина Е высокоэффективной жидкостной хроматографией. Измерение альфа-, бетта-, гамма- и дельта-токоферолов)

[9]    EN 12823-1:2014 Foodstuffs — Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography — Part 1:

Measurement of all-E-retinol and 13-Z-retinol

(Продукты питания. Определение содержания витамина А методом жидкостной хроматографии высокого разрешения. Часть 1. Измерение содержания полного транс-ретинола и 13-2-ретинола)

[10]    J АОАС Int 2013, Sept — Oct; 96 (5): 1073 — 1081 — Simultaneous determination of 13-cis and all-trans vitamin A palmitate (retinyl palmitate), vitamin A acetate (retinyl acetate), and total vitamin E (alpha-tocopheryl and alpha-tocopheryl acetate) in infant formula and adult nutritionals by normal phase HPLC: first action 2012.10

Официальный перевод этого стандарта находится в Федеральном информационном фонде стандартов.

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

СМЕСИ АДАПТИРОВАННЫЕ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА И СМЕСИ ДЛЯ ЭНТЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ ВЗРОСЛЫХ

Определение содержания витамина Е и витамина А с помощью нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

Infant formula and adult nutritionals.

Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography

Дата введения — 2019—09—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод одновременного количественного определения витамина Е (а-токоферола и а-токоферола ацетата) и витамина А (13-цис- и полного транс-изомера ретинола пальмитата и ретинола ацетата) в адаптированных смесях для искусственного вскармливания детей раннего возраста и в смесях для энтерального питания взрослых (порошкообразные смеси, готовые к употреблению жидкости и жидкие концентраты).

Ретинол не используется для обогащения пищевых продуктов, и поэтому стандарт не распространяется на его определение. Массовая доля ретинола, естественно присутствующего в продуктах, незначительна.

Настоящий стандарт не распространяется на определение стереоизомеров витамина Е-а-токоферола и а-токоферола ацетата по отдельности.

2    Термины и определения

2.1    смеси для энтерального питания взрослых (adult nutritional): Полноценный в питательном отношении специализированный пищевой продукт, изготовленный из молока, сои, риса, молочной сыворотки, гидролизата белка, крахмала и аминокислот в любом сочетании, содержащий или не содержащий интактный белок, употребляемый в жидком виде; может являться единственным источником питания.

2.2    смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста

(infant formula): Заменитель грудного молока*, специально изготовленный для удовлетворения естественной потребности в питании младенцев в течение первых месяцев жизни до введения прикорма.

Примечание — Определение термина 2.2**.

3 Сущность метода

Для гидролиза гидрофильного внешнего слоя жировых мицелл в воде, присутствующих в анализируемой пробе образца, изготовленного на основе молока или сои, используют протеолитический фермент папаин. Затем гидрофобные компоненты мицелл количественно извлекают однократной экстракцией изооктаном. Экстракт анализируют методом нормально-фазовой ВЭЖХ, используя

* Термин в соответствии с ТР ТС 021/2011.

** Определение термина 2.2 взято из Codex Standard 72—1981.

Издание официальное

аналитическую колонку и градиентное элюирование. Количественное определение cc-токоферола и а-токоферола ацетата проводят с флуоресцентным детектированием при длине волны возбуждения 280 нм и длине волны эмиссии 310 нм. Ретинола пальмитат (цис- и транс-) и ретинола ацетат (цис- и транс-) количественно определяют с использованием УФ-детектирования при 325 нм.

4 Реактивы и материалы

Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную или деминерализованную воду или аналогичную по чистоте воду.

4.1    Метил-тре/п-бутиловый эфир (МТБЭ) для ВЭЖХ.

4.2    л-Гексан для ВЭЖХ.

4.3    Этанол для ВЭЖХ.

4.4    Метанол для ВЭЖХ.

4.5    Изооктан (2,2,4-триметилпентан) для ВЭЖХ.

4.6    Фермент папаин [полученный из папайи (Carica papaya)], > 3 ед./мг¹ или эквивалентный.

4.7    Гидрохинон².

4.8    Ледяная уксусная кислота, аналитически чистая.

4.9    Ацетат натрия, безводный.

4.10    Разбавленный раствор соляной кислоты

Разводят 100 см³ 36%-ного раствора соляной кислоты до 200 см³ водой.

4.11    Раствор папаина массовой концентрации р = 20 г/дм³

Растворяют 100 мг гидрохинона и 4 г безводного ацетата натрия в объеме около 80 см³ воды в мерной колбе вместимостью 100 см³ (см. 5.11). pH раствора доводят до 5,0 добавлением разбавленного раствора соляной кислоты (см. 4.10). Добавляют 2 г папаина и объем доводят до метки водой. Раствор готовят в день использования.

4.12    Подкисленный раствор метанола

20 см³ ледяной уксусной кислоты добавляют к 1 дм³ метанола и перемешивают. Раствор готовят в день использования.

4.13    Подвижная фаза А для ВЭЖХ

н-Гексан фильтруют и дегазируют в течение 15 мин с помощью ультразвуковой бани.

4.14    Подвижная фаза В для ВЭЖХ

Смешивают 750 см³ н-гексана и 250 см³ метил-трет-бутилового эфира. Затем добавляют 3 см³ метанола, фильтруют и дегазируют в течение 15 мин с помощью ультразвуковой бани.

4.15    Стандартные образцы сравнения

4.15.1    Ретинола пальмитат, первичный стандартный образец сравнения, содержащий антиоксидант (CAS 78-81-2).

4.15.2    Ретинола ацетат, первичный стандартный образец сравнения (CAS 127-47-9).

4.15.3    а-Токоферола ацетат, первичный стандартный образец сравнения (CAS 7695-91-2).

4.15.4    а-Токоферол, первичный стандартный образец сравнения (CAS 10191-41-0).

ГОСТ ISO 20633-2018

4.16 Основные растворы

4.16.1    Основной стандартный раствор ретинола пальмитата

Взвешивают около 70 мг ретинола пальмитата (см. 4.15.1) с точностью до 0,01 мг в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11), растворяют в изооктане и доводят до метки изооктаном (см. 4.5).

4.16.2    Основной стандартный раствор ретинола ацетата

Взвешивают около 35 мг ретинола ацетата (см. 4.15.2) с точностью до 0,01 мг в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11), растворяют в этаноле и доводят до метки этанолом (см. 4.3).

4.16.3    Основной стандартный раствор а-токоферола ацетата

Взвешивают около 180 мг а-токоферола ацетата (см. 4.15.3) с точностью до 0,01 мг в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11), растворяют в изооктане и доводят до метки изооктаном (см. 4.5).

4.16.4    Основной стандартный раствор а-токоферола

Взвешивают около 100 мг а-токоферола (см. 4.15.4) с точностью до 0,01 мг в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11), растворяют в изооктане и доводят до метки изооктаном (см. 4.5).

Примечание — Срок хранения приготовленных растворов — семь дней при температуре от 4 до 8 °С.

4.16.5    Стандартный раствор смеси витаминов № 1

4 см³ основного стандартного раствора ретинола пальмитата (см. 4.16.1), 4 см³ основного стандартного раствора ретинола ацетата (см. 4.16.2), 7 см³ основного стандартного раствора а-токоферола ацетата (см. 4.16.3) и 20 см³ основного стандартного раствора а-токоферола (см. 4.16.4) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 см³ (см. 5.11) и доводят до метки изооктаном. Раствор готовят в день использования.

4.16.6    Стандартный раствор смеси витаминов № 2

8 см³ стандартного раствора № 1 (см. 4.16.5) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки изооктаном. Раствор готовят в день использования.

4.16.7    Градуировочные растворы

В мерные колбы вместимостью 50 см³ (см. 5.11) переносят пипеткой 0,5, 2,0; 4,0; 8,0; 16,0 и 32,0 см³ стандартного раствора смеси витаминов № 2 (см. 4.16.6) и доводят до метки изооктаном. Эти растворы используют для построения градуировочного графика по нескольким точкам. Раствор готовят в день использования.

Примечание — Для текущего контроля градуировочного графика и в зависимости от диапазона концентрации определяемых витаминов в исследуемых образцах можно использовать три или четыре градуировочных раствора, минимальная и максимальная массовая концентрация витаминов которых находятся внутри диапазона концентраций 6 точечного градуировочного графика.

4.17 Определение чистоты стандартных растворов

4.17.1 Спекгрофотометрическое определение чистоты стандартного раствора ретинола пальмитата

1 см³ стандартного раствора ретинола пальмитата (см. 4.16.1) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки этанолом. Измеряют оптическую плотность раствора в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 325 нм относительно этанола. Измерение повторяют два раза, каждый раз заполняя кювету раствором. Рассчитывают среднее величины оптической плотности. Рассчитывают чистоту ретинола пальмитата SP_RP в виде десятичных долей по формуле

где А — среднее величины оптической плотности;

975 — коэффициент поглощения ретинола пальмитата при 325 нм (см. [1]); m_st — масса образца сравнения, мг.

4.17.2 Спекгрофотометрическое определение чистоты стандартного раствора ретинола ацетата

1 см³ стандартного раствора ретинола ацетата (см. 4.16.2) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки этанолом. Измеряют оптическую плотность раствора в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 325 нм относительно

где А — среднее величины оптической плотности;

1560 — коэффициент поглощения ретинола ацетата при 325 нм (см. [1]); m_st — масса образца сравнения, мг.

4.17.3 Спектрофотометрическое определение чистоты стандартного раствора а-токофе-рола ацетата

3 см³ стандартного раствора а-токоферола ацетата (см. 4.16.3) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки этанолом. Измеряют оптическую плотность раствора в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 284 нм относительно этанола. Измерение повторяют два раза, каждый раз заполняя кювету раствором. Рассчитывают среднее величины оптической плотности. Рассчитывают чистоту а-токоферола ацетата SP_TA в виде десятичных долей по формуле

^spta ~

St

где А — среднее величины оптической плотности;

43,6 — коэффициент поглощения а-токоферола ацетата при 284 нм (см. [1]); m_st — масса образца сравнения, мг.

4.17.4 Спектрофотометрическое определение чистоты стандартного раствора а-токо-ферола

3 см³ стандартного раствора а-токоферола (см. 4.16.4) переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см³ (см. 5.11) и доводят до метки этанолом. Измеряют оптическую плотность раствора в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 292 нм относительно этанола. Измерение повторяют два раза, каждый раз заполняя кювету раствором. Рассчитывают среднее величины оптической плотности. Рассчитывают чистоту а-токоферола SP_T в виде десятичных долей по формуле

где А — среднее величины оптической плотности;

75,8 — коэффициент поглощения а-токоферола при 292 нм (см. [1]); m_st — масса образца сравнения, мг.

4.17.5 Хроматографическое определение чистоты стандартных растворов

Готовят ряд стандартных растворов согласно следующей процедуре.

В четыре мерные колбы вместимостью 100 см³ (см. 5.11) переносят пипеткой по 1 см³ стандартного раствора ретинола пальмитата (см. 4.16.1), ретинола ацетата (см. 4.16.2), а-токоферола ацетата (см. 4.16.3) , а-токоферола (см. 4.16.4) и каждый раствор доводят до метки изооктаном. На каждой колбе отмечают наименование стандарта.

В четыре флакона автосамплера вместимостью 2 см³ переносят автоматическим дозатором 60 мм³ раствора ретинола пальмитата, 30 мм³ ретинола ацетата, 100 мм³ а-токоферола ацетата и 400 мм³ а-токоферола. Добавляют в каждый флакон изооктан до 2 см³.

Растворы во флаконах быстро перемешивают и проводят хроматографический анализ в соответствии с параметрами системы для ВЭЖХ (см. 6.2). Детектирование ретинола пальмитата и ретинола ацетата проводят при 325 нм. Детектирование ацетата а-токоферола проводят при 284 нм, а-токоферола — при 292 нм.

Рассчитывают хроматографическую чистоту стандартов (СР) в виде десятичных долей после интегрирования всех пиков на хроматограмме каждого стандарта по формуле

При расчете чистоты стандарта ретинола пальмитата (ацетата) учитывают только площадь транс-пиков.

6 Проведение испытаний

6.1    Подготовка пробы

6.1.1    Общие положения

Если технологический процесс производства испытуемого образца неизвестен, пробоподготовку проводят в соответствии с 6.1.2.

6.1.2    Порошкообразные образцы, полученные смешиванием в сухом состоянии

Если образец получен смешиванием в сухом состоянии или является негомогенным, аккуратно взвешивают около 25 г (т.,) пробы в колбе вместимостью 250 см³ (см. 5.13). Пробу разводят теплой водой (от 40 до 45 °С), охлаждают и добавляют 200 г воды. Записывают конечную массу (т₂). Аккуратно из колбы отбирают и взвешивают около 5 г (т₃) восстановленного образца в центрифужной пробирке с завинчивающейся крышкой. Рассчитывают массу (эквивалентную сухому образцу) m_s по формуле

К • т₃)

6.1.3    Порошкообразные образцы, полученные смешиванием с увлажнением

Если образец является гомогенным или получен смешиванием с увлажнением, аккуратно взвешивают около 0,525 г пробы в центрифужной пробирке вместимостью 50 см³ с завинчивающейся крышкой. Добавляют 5 см³ теплой воды с температурой около 40 °С и встряхивают для растворения.

6.1.4    Жидкие образцы

Если образец является жидкой смесью, готовой к употреблению, или жидким концентратом, после тщательного перемешивания аккуратно взвешивают около 5 г пробы в центрифужной пробирке вместимостью 50 см³ с завинчивающейся крышкой.

6.1.5    Экстракция

К взвешенной пробе в центрифужной пробирке добавляют 5 см³ раствора папаина (см. 4.11) и тщательно перемешивают. Пробирку закрывают крышкой и нагревают на водяной бане при температуре (37 ± 2) °С в течение 20—25 мин. По окончании нагревания пробирки снимают с водяной бани и охлаждают. Добавляют 20 см³ подкисленного метанола (см. 4.12) и встряхивают в течение 10 мин, используя механический встряхиватель.

10 см³ изооктана переносят пипеткой в пробирку с анализируемым образцом. Пробирку аккуратно закрывают крышкой, чтобы предотвратить протекание, и встряхивают в течение 10 мин, используя механический встряхиватель. Затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин для получения прозрачного изооктанового слоя. Переносят аликвоту прозрачного изооктанового слоя во флакон из темного стекла, используемый для автоматического ввода в систему для ВЭЖХ-анализа.

6.2 ВЭЖХ-анализ

6.2.1    Общие положения

Для оптимального разделения и количественного определения рекомендуются:

-    колонка аналитическая для ВЭЖХ*;

-    подвижная фаза А: л-гексан;

-    подвижная фаза В: смесь 750 см³ л-гексана, 250 см³ метил-трет-бутилового эфира, 3 см³ метанола;

-    скорость элюирования: 1,5 см³/мин;

-    вводимый объем: 50 мм³;

-    температура термостата колонки: (40 ± 2) °С; время хроматографического анализа: 20 мин.

Примеры хроматограмм — в приложении А.

6.2.2    Условия детектирования

Для спектрофотометрического (УФ) или диодно-матричного (ДАД) детектирования ретинола пальми-тата или ретинола ацетата устанавливают длину волны 325 нм. Для флуоресцентного детектирования ацетата cc-токоферола или а-токоферола устанавливают длину волны возбуждения 280 нм, эмиссии — 310 нм. ^{4 5}

1

Например, фирмы Sigma 76220. Представлен пример доступной в коммерческой сети продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данной продукции. Допускается использование аналогичной продукции, обеспечивающей достоверные результаты.

2

Например, фирмы Sigma Н9003. Представлен пример доступной в коммерческой сети продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данной продукции. Допускается использование аналогичной продукции, обеспечивающей достоверные результаты.

2

3

4

* Например, Agilent Zorbax® NH2 (5 мкм, 150 х 4,6 мм). Представлен пример доступной в коммерческой сети продукции. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данной продукции. Допускается использование аналогичной продукции, обеспечивающей достоверные результаты.

5