МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

ISO/TS 21872-2— 2013

МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ для животных

Горизонтальный метод обнаружения потенциально энтеропатогенных Vibrio spp.

Часть 2

Обнаружение видов бактерий, отличных от Vibrio parahaemoliticus и Vibrio cholerae

(ISO/TS 21872-2:2007, IDT)

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2014

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 декабря 2013 г. № 63-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	КZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстамдарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстамдарт

4 Настоящий стандарт идентичен международному документу ISO/TS 21872-2:2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. — Pari 2: Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения потенциально энтеропатогенных видов рода Vibrio. Часть 2: Выявление видов, отличных от Vibrio parahaemolyticus и Vibrio cholerae).

Международный документ разработан подкомитетом ISO/ТС 34/SC 9 «Микробиология» Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (ел).

Официальный экземпляр международного документа, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

ГОСТ ISO/TS 21872-2—2013

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия — идентичная (ЮТ)

5    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 марта 2014 г. № 158-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO/TS 21872-2-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе о Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

III

ГОСТ isorrs 21872-2—2013

Содержание

Сведения о стандарте......................................................................................................................................II

1    Область применения.....................................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки....................................................................................................................................1

3    Термины и определения...............................................................................................................................2

4    Сущность метода...........................................................................................................................................2

4.1    Общие положения..................................................................................................................................2

4.2    Первичное обогащение в жидкой селективной среде........................................................................2

4.3    Вторичное обогащение в жидкой селективной среде.........................................................................2

4.4    Выделение и идентификация................................................................................................................3

4.5    Подтверждение.......................................................................................................................................3

5    Реактивы и среды..........................................................................................................................................3

6    Аппаратура и материалы..............................................................................................................................4

7    Отбор проб.....................................................................................................................................................4

8    Приготовление испытуемой пробы..............................................................................................................4

9    Процедура проведения испытания (см. приложение А).............................................................................4

9.1    Проба для испытания и исходная суспензия.......................................................................................4

9.2    Первичное селективное обогащение...................................................................................................4

9.3    Вторичное селективное обогащение....................................................................................................5

9.4    Выделение и идентификация................................................................................................................5

9.5    Подтверждение.......................................................................................................................................5

10    Выражение результатов.............................................................................................................................9

11    Протокол испытаний....................................................................................................................................9

Приложение А (обязательное) Схема проведения испытания.................................................................10

Приложение В (обязательное) Состав и    приготовление питательных сред и реактивов......................11

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии межгосударственных стандартов

ссылочным международным стандартам..........................................................................17

Библиография.................................................................................................................................................18

IV

ГОСТ ISO/TS 21872-2—2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ    СТАНДАРТ

МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ Горизонтальный метод обнаружения потенциально энтеропатогенных vibrio spp.

часть 2

Обнаружение видов бактерий, отличных от Vibrio parahaemoliticus и Vibrio cholerae

Microbiology of food and animal feeding stuffs.

Horizontal method for the detection of potentially entcropathogcnic Vibrio spp.

Part 2. Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae

Дата введения — 2015—07—01

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Для гарантии здоровья лабораторного персонала необходимо, чтобы испытания для выявления Vibrio spp. и особенно токсигенного Vibrio cholerae проводились только в лабораториях, специально оснащенных для этих целей и под руководством опытного микробиолога и чтобы уделялось особое внимание обеззараживанию зараженного материала.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и корма для животных и устанавливает горизонтальный метод для выявления энтеропатогенных видов Vibrio, вызывающих заболевания в или через кишечный тракт, отличных от Vibrio parahaemolyticus и Vibrio cholerae. Виды, выявляемые указанным методом, включают Vibrio fluvialis. Vibrio mimicus и Vibrio vulnificus (см. 9.4.4). Этот метод не подходит для выделения Vibrio hollisae. Виды Vibrio parahaemolyticus и Vibrio cholerae могут быть также выделены в процессе применения данного метода. Данный метод не предназначен для выявления Vibrio metschnikovii, так как он оксидазоотрицателен.

Метод применим также для выявления данных микроорганизмов в объектах окружающей среды в сфере пищевого производства и оборота пищевых продуктов.

Примечание 1 — Vibno metschnikovii иногда выявляют из образцов фекалий человека, он может вызывать расстройство желудка

Примечание 2 — Идентификация видов Vibrio, отличных от Vibrio parahaemolyticus и Vibrio cholerae, сложна и требует дальнейшего развития Биохимические тесты, приведенные в настоящем стандарте, дают возможность предположительного подтверждения этих видов

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ISO 6887-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений)

Издание официальное

ISO 6887-2 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 2: Specific rules for the preparation of meat and meat products (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка проб, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологических исследований. Часть 2. Специальные правила подготовки мяса и мясных продуктов)

ISO 6887-3 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 3: Specific rules for the preparation of fish and fishery products (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 3. Специальные правила для приготовления рыбы и рыбных продуктов)

ISO 6887-4 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 4. Специальные правила для приготовления продуктов, кроме молока и молочных продуктов, мяса и мясных продуктов и рыбы и рыбопродуктов)

ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)

ISO 8261 Milk and milk products. General guidance for the preparation of tests samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination (Молоко и молочные продукты — Общие правила приготовления проб для испытаний, исходных суспензий и десятикратных разведений для микробиологических исследований)

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    потенциально энтеролатогенные Vibrio: Микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на плотной селективной среде и обладают описанными биохимическими характеристиками при тестировании, проводимом в соответствии с настоящим стандартом.

3.2    обнаружение потенциально энтеропатогенных Vibrio: Определение присутствия или отсутствия предположительных, энтеропатогенных видов Vibrio в определенном количестве продукта, после проведения испытания в соответствии с настоящим стандартом.

4    Сущность метода

4.1    Общие положения

Метод обнаружения потенциально энтеропатогенных Vibrio spp. состоит из четырех последовательных этапов (см. приложение А).

Примечание — Vibrio могут присутствовать в небольших количествах, часто вместе с гораздо большим количеством других микроорганизмов, относящихся к семейству Vibnonaceae или другим семействам, поэтому необходимы два последовательных обогащения для выявления этих микроорганизмов

4.2    Первичное обогащение в жидкой селективной среде

Среду для обогащения (щелочную солевую пептонную воду, ASPW) (5.1) инокулируют пробой при комнатной температуре. Инкубируют при 37 °С в течение (6 ± 1) ч.

В случае больших количеств высеваемого продукта ASPW следует нагреть до 37 °С перед внесением пробы.

4.3    Вторичное обогащение в жидкой селективной среде

Среду для обогащения (ASPW) инокулируют культурой, полученной по 4.2. Инкубируют при температуре 37 °С в течение (18 ± 1) ч.

ГОСТ ISO/TS 21872-2—2013

4.4    Выделение и идентификация

Культуры, полученные по 4.2 и 4.3. пересевают на следующие две селективные агаризованные среды:

-    Тиосульфат-цитратный агар с сахарозой и желчью (TCBS);

-    другая подходящая агаризованная селективная среда (остается на выбор лаборатории), такая как колистин полимиксин р-целлобиоза агар (СРС), натрия додецил сульфат, полимиксин В. сахароза агар (SDS) или модифицированный колистин полимиксин целлобиоза агар (тСРС).

Две среды для выделения инкубируют при 37 °С в течение (24 ± 3) ч.

4.5    Подтверждение

Характерные колонии Vibrio spp.. выделенные по 4 4. пересевают и затем подтверждают с помощью подходящих биохимических тестов.

5 Реактивы и среды

Информация об общепринятой лабораторной практике приведена в ISO 7218.

Примечание —В связи с большим количеством питательных сред и реагентов и для удобства пользования их состав и приготовление представлены в приложении В

5.1    Среда для обогащения: щелочная солевая пептонная вода (ASPW)

См. В.1.

5.2    Агаризованные среды для выделения

5.2.1    Первая среда: тиосульфат, цитрат, желчная соль и сахароза (TCBS) агар См. В.2.

5.2.2    Вторая среда

Выбирают между:

a)    натрия додецил сульфат полимиксин сахароза агар (SDS), «л. В.З;

b)    целлобиоза полимиксин колистин агар (СРС). см. В 4;

c)    модифицированный целлобиоза полимиксин колистин агар (тСРС), см В 5.

5.3    Солевой питательный агар (SNA)

См В.6.

5.4    Реактив для определения оксидазы См В.7.

5.5    Солевой трехсахарный железистый (TSA) агар См. В.8.

5.6    Солевая среда для определения орнитин декарбоксилазы (ODC)

См. В.9.

5.7    Солевая среда для определения лизин декарбоксилазы (LDC)

См. В.10.

5.8    Солевая среда для определения аргинин дегидролазы (ADH)

См. В.11.

5.9    Реактив для определения р-галактозидазы См. В.12.

5.10    Солевая среда для определения индола См В.13.

5.11    Солевые пептонные воды См В.14.

5.12    Раствор хлорида натрия См. В.15. ¹

6    Аппаратура и материалы

Примечание — Инструменты одноразового применения — приемлемая альтернатива стеклянной посуде многократного пользования, если они имеют подходящие технические характеристики

Используют оборудование обычной микробиологической лаборатории (см. ISO 7218) и. в частности. следующее.

6.1    Термостат, регулируемый до (37 ± 1) °С.

6.2    Термостаты или водяные бани, регулируемые до (41,5 ± 1) ®С.

6.3    Водяная баня, регулируемая от 44 до 47 °С.

6.4    Водяная баня, регулируемая до (37 ± 1) °С.

Рекомендуется использовать водяные бани (6.2, 6.3 и 6.4), содержащие антибактериальный агент.

7    Отбор проб

В лабораторию необходимо доставить представительную пробу, не поврежденную и не измененную в ходе транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Отбор проб — по стандарту на конкретный продукт. В случае отсутствия конкретного стандарта на отбор проб продукта рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по процедуре отбора проб.

8    Приготовление испытуемой пробы

Пробу для испытания готовят в соответствии с определенной частью ISO 6887 и/или ISO 8261 или стандарту на конкретный продукт. В случае отсутствия конкретного стандарта рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия по данному вопросу.

9    Процедура проведения испытания (см приложение А)

9.1    Проба для испытания и исходная суспензия

Для приготовления исходной суспензии используют первую среду для обогащения (ASPW). указанную в 5.1.

Берут пробу для испытания (х г или х см¹) в соответствии с нормативным значением и гомогенизируют ее в 9х см¹ (или 9х г) среды для обогащения.

В случае больших количеств высеваемого продукта перед внесением пробы ASPW должна быть нагрета до 37 °С.

Если разведение и инкубирование не могут быть проведены в тот же день, исходную суспензию хранят до следующего дня при температуре (5 ± 3) °С.

Когда более чем одна проба массой 25 г испытывается от той же партии анализируемого продукта. то для уменьшения обьема проводимой работы эти пробы могут быть обьединены. При этом должна быть уверенность в том. что смесь (собранные вместе пробы) не изменят результаты для испытуемого продукта.

Пример — Если анализируют 10 проб для испытания по 25 г, возможно объединить эти 10 проб, для того, чтобы получить в сумме объединенную пробу массой 250 г и добавить к ней 2,25 дм' сроды для обогащения.

Количество клеток потенциально энтеропатогенных Vibrio spp. значительно снижается за счет хранения при низких температурах. Хранение образцов и в меньшей степени суспензий при таких температурах должно быть устранено или сведено к минимуму.

9.2    Первичное селективное обогащение

Инкубируют исходную суспензию (9.1) при температуре 37 °С в течение (6 ± 1) ч.

4

rOCTISO/TS 21872-2—2013

Необходимо обращать особое внимание на применение метода для продуктов с высоким содержанием соли, так как конечная концентрация соли в среде может изменять ее качественные характеристики (см. ИСО 6887-4).

9.3    Вторичное селективное обогащение

9.3.1    Переносят 1 см³ культуры, полученной по 9.2, взятой с поверхности, в пробирку, содержащую 10 см³ ASPW (5.1).

9.3.2    Посевы на ASPW инкубируют при (37 ± 1) °С в течение (18 ± 1) ч.

9.4    Выделение и идентификация

9.4.1    Из культур, выросших на среде ASPW (9.2 и 9.3.2) засевают петлей поверхность чашек с TCBS агаром (5.2.1) таким образом, чтобы получить развитие хорошо изолированных колоний.

Аналогично поступают со второй селективной средой (5.2), используя новую петлю.

9.4.2    Переворачивают чашки с агаром (9.4.1) и помещают их в термостат (6.1), установленный на 37 °С.

9 4 3 После инкубирования в течение (24 ± 3) ч просматривают чашки (9.4.1 и 9.4.2) на наличие типичных колоний Vibrio spp. Отмечают их расположение на основании чашки.

Существует две основные морфологические характеристики для колоний Vibrio spp. на TCBS агаре (5.2.1):

-    типичные колонии V. mimicus и V. vulnificus гладкие зеленые (сахарозоотрицательные), от 2 до 3 мм в диаметре;

-    типичные колонии V. fluvialis гладкие, желтые (сахарозоположительные), от 2 до 3 мм в диаметре.

Примечание — V parahaemolyticus и V cholerae образуют зеленые и желтые колонии на TCBS агаре соответственно,

Существует две основные морфологические характеристики для колоний Vibrio spp. на SDS среде (5.2.2 а)):

-    типичные колонии V. mimicus и V. vulnificus фиолетовые и достигают 2 мм или более в диаметре, с темным кольцом;

-    типичные колонии V. cholerae 01 желтые. 2 мм или более в диаметре, с темным кольцом;

V. cholerae. не относящиеся к штамму 01. могут не образовывать темное кольцо.

Другие Vibrio spp. либо не будут расти на SDS агаре, либо образовывать колонии без кольца.

Существует две основные морфологические характеристики для колоний Vibrio spp. на CPC и mCPC среде [5.2.2 b) и с)]:

-    типичные колонии V. vulnificus желтые. 2 мм или более в диаметре и окружены желтой зоной;

-    типичные колонии V. cholerae фиолетовые. 2 мм или более в диаметре и окружены голубым кольцом.

Некоторые виды других Vibrio spp. могут расти на СРС или mCPC агарах; выросшие колонии подобны описанным выше.

9 4 4 Для выделения V. vulnifivus следует обращать внимание на качество среды СРС или mCPC.

9.5    Подтверждение

9.5.1 Для идентификации Vibrio до вида могут быть использованы разнообразные коммерчески доступные наборы для биохимической идентификации, обеспеченные базой данных или идентификационными таблицами. Наборы инокулируются суспензией определяемых бактерий. Суспензии для инокуляции готовятся в физиологическом растворе или жидкости для разбавления. Наборы для биохимической идентификации основаны на реакциях, полученных при использовании сред, подобных тем. которые описаны в настоящем стандарте.

Примечание — Распознавание колоний Vibrio — в значительной степени вопрос опыта, их внешний вид может иногда различаться не только от вида, но также от партии питательной среды ²

9.5.2    Отбор колоний для подтверждения и приготовления чистых культур

Для подтверждения пересевают с каждой селективной среды (см. 9.4) пять колоний, которые считаются типичными для каждого потенциально патогенного вида Vibrio spp. Если на чашке менее пяти типичных колоний, то пересевают все эти колонии.

Примечание — Пищевые продукты, особенно морепродукты, могут содержать большое число бактерий. включая непатогенные Vibrio spp , которые могут расти в процессе культивирования на селективных средах Пересев малого количества колоний может привести к потере потенциально патогенных видов

Пересевают отобранные колонии на поверхность чашек с солевым питательным агаром или поверхность скошенного солевого питательного агара (5.3) для получения изолированных колоний. Посевы (9.4.2) инкубируют при 37 °С в течение (24 ± 3) ч.

Для биохимического подтверждения используют чистые культуры.

9.5.3    Тесты для идентификации

9.5.3.1    Тест на оксидазу

Используя платиново-иридиевую петлю или стеклянный стержень, берут часть чистой культуры с солевого питательного агара (9.5.2) и проводят по поверхности фильтровальной бумаги, увлажненной реактивом на оксидазу (5.4), или используют коммерческие доступные тесты, следуя инструкциям производителя. Не следует использовать ни никель-хромовую петлю для отбора, ни металлический провод. Тест считается положительным, если цвет меняется на розовато-лиловый, фиолетовый или насыщенный фиолетовый в течение 10 с.

9.5.3.2    Микроскопирование

Каждую чистую культуру, полученную по 9.4.2. тестируют в соответствии с а) и Ь):

a)    Готовят мазок для окраски по Граму (см. ISO 7218). После окраски, используя микроскоп, отмечают морфологию и отношение к окраске по Граму и записывают результаты.

b)    Инокулируют пробирку с щелочной солевой пептонной водой (ASPW) (5.1). Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С от 1 ч до 6 ч. Наносят каплю культуры на чистую поверхность предметного стекла, накрывают покровным стеклом и проверяют подвижность под микроскопом. Отбирают культуры, показывающие положительный результат на подвижность.

9.5.3.3    Отбор культур для биохимических тестов

Отбирают для биохимического подтверждения оксидазоположительные. грамотрицательные культуры, которые показывают положительный результат в тесте на подвижность.

9.5.4    Биохимическое подтверждение

9.5.4.1 Используя петлю для посевов, инокулируют среды, указанные в 9.5.4.2 — 9.5 4.8. каждой культурой, полученной из колоний, отобранных по 9.5.3.3.

9.5.4    2 Тест с солевым TSI агаром (5.5)

Инокулируют укалыванием основание столбика агара и проводят вдоль по скошенной поверхности. Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч.

Результаты интерпретируют следующим образом:

a)    Основание агаризованной среды

-    желтый: глюкозоположительный (ферментация глюкозы);

-    красный или неизменившийся: глюкозоотрицательный (нет ферментации глюкозы);

-    черный: образование сероводорода;

• пузыри или трещины: образование газа из глюкозы.

b)    Скошенная поверхность агаризованной среды

-    желтый: лактозо и/или сахарозо-положительный (ферментация лактозы и/или сахарозы);

-    красный или неизменившийся: лактозо и сахарозо-отрицательный (нет ферментации лактозы или сахарозы).

Типичные реакции V. vulnificus и V. fluvialis соответствуют кислотной поверхности (желтый) и кислотному основанию (желтый), без образования сероводорода или газа.

Типичные реакции V. mimicus соотвествуют щелочной поверхности (красный) (иногда кислотной: желтый) и кислому основанию (желтый) без образования сероводорода или газа.

9.5.4    3 Выявление орнитин декарбоксилазы

Инокулируют жидкую солевую среду (5.7) чуть ниже поверхности. Добавляют около 1 см стерильного минерального масла на поверхность среды. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение (24 ± 3) ч.

1

2