(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение витамина В₆ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

(EN 14164:2008, ЮТ)

Издание официальное

ш

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия. обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Республиканским государственным предприятием «Казахстанский институт стандартизации и сертификации» Комитета технического регулирования и метрологии и Техническим комитетом по стандартизации ТК № 71 «Экологическая безопасность сырья, материалов, веществ и сооружений»*

2    ВНЕСЕН Комитетом технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 августа 2014 г № 69-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Код страны no МК (ИСО 3166)004-97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Армения AM Минэкономики Республики Армения Беларусь ВУ Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Киргизия KG Кыргызстзндарт Молдова MD Молдова-Стандарт Россия RU Росстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 11 мая 2016 г. № 295-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14164—2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5    Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14164:2008 «Продукты пищевые. Определение витамина В₆ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии» («Foodstuffs — Determination of vitamin B6 by HPLC». IDT).

Европейский стандарт EN 14164:2008 подготовлен Техническим комитетом CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN).

Официальный экземпляр европейского стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и европейского стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

Сведения о соответствии ссылочных европейских региональных стандартов межгосударственным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА

Степень соответствия — идентичная (IDT)

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

’ На основе собственного перевода немецкоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5.

Приложение В (справочное)

Данные о прецизионности

Данные были получены главным образом при использовании метода, описанного в приложении С, который не предусматривает гидролиза Кислотный гидролиз не влияет на результаты испытания

Данные о прецизионности для определения витамина В₆ в таблице В 1 были установлены в ходе межлабораторного испытания в соответствии с [7), которое проводилось Главным управлением в области конкуренции, потребления и преследования мошенничества законом (DGCCRF)

При межлабораторном испытании была использована аналитическая колонка LiChrosper®60 RP 8 Select В, размер частиц 5 мкм, диаметр 4.0 мм, длина 250 мм

Данные о прецизионности для определения содержания витамина В₆ в таблице В 2 были установлены в ходе межлабораторного испытания в соответствии с положениями Ассоциации химикое-аналитиков, работающих в государственных организациях (АОАС Guidelines), для проведения совместного изучения для подтверждения характеристик метода анализа (см (8)), (см (9). (10) и основанные на методе (см (3)) Совместное изучение проводилось с использованием Luna ® 5 мкм фенил-гексиловой колонки для ВЭЖХЧ

Таблица 81 — Данные о прецизионности для определения содержания витамина В6

Проба1) 1 2 3 4 5 6 7 8 Год проведения межлабораторного испытания 1993 1993 1993 1993 1993 1993 1993 1993 Количество лабораторий 12 12 12 12 12 12 12 12 Количество лабораторий, оставшихся после удаления выбросов 11 10 11 12 11 11 12 11 Количество оставшихся результатов 32 29 31 36 33 33 35 33 Среднее значение. X. мг/100 г 0.06 0.14 0.22 0.53 0.55 0.67 1.50 3,28 Стандартное отклонение повторяемости Sr мг/100 г 0.01 0.02 0.02 0.04 0.02 0.03 0.10 0.09 Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr % 18 3 10 8 4 4 6 3 Предел повторяемости г [г = 2,8 Sr). мг/100 г 0.03 0,05 0.06 0.12 0.06 0.08 0.27 0,26 Стандартное отклонение воспроизводимости мг/100 г 0.02 0,05 0.07 0.14 0.07 0,08 0.18 0.43 Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr. % 30 35 30 26 1 12 12 13 Предел воспроизводимости R (R * 2,8 SR). мг/100 г 0.05 0.14 0.19 0.39 0.20 0.23 0.51 1,22 Индекс Горвица (11) 1.7 2.3 2.1 2.1 1.1 1.1 1.1 1.4 ’) 1 — детское питание. 2 — печенье; 3 — зерновой продукт В, 4 — дрожжи. 5 — раствор для зондового питания. 6 — шоколадный порошок. 7 — злаковые А. 8 — сухое молоко

¹¹ Luna ® 5 мкм фенил-гексиловая колонка для ВЭЖХ — это пример подходящего продукта, имеющегося в продаже Данная информация приведена только для удобства пользователей и не является рекламированием CEN названного продукта Можно использовать эквивалентные продукты, если они приводят к получению аналогичных результатов 8

Таблица B2 — Данные о прецизионности для определения содержания витамина В_в в восстановленных детских смесях

Проба* >	1	2	3	4	5	6	7	8
Год проведения межлабораторного испытания	2003	2003	2003	2003	2003	2003	2003	2003
Количество лабораторий	11	11	11	11	11	11	11	11
Количество лабораторий, оставшихся после удаления выбросов	9	9	8	9	7	9	9	9
Количество оставшихся результатов	18	18	16	18	14	18	18	18
Среднее значение X. мг/100г	0.013	0,036	0,057	0.101	0,005	0.028	0,056	0,106
Стандартное отклонение повторяемости Sr мг/100 г	0.001	0,001	0.001	0,004	0,001	0,002	0,003	0,004
Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDr %	10	3.3	2.0	4,0	16,4	5.9	4.5	3.5
Предел повторяемости г [г = 2,8 Sr], мг/100 г	0.0028	0.0028	0.0028	0.0112	0,0028	0,0056	0,0084	0,0112
Стандартное отклонение воспроизводимости S*. мг/100 г	0.002	0,003	0.005	0,006	0,002	0,003	0,004	0,007
Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr. %	17.5	8.2	8,4	8.4	52.1	11.2	7.4	6,4
Предел воспроизводимости R [R = 2.8 SR), мг/100 г	0.0056	0,0084	0.014	0.0168	0,0056	0,0084	0,0112	0,0196
Индекс Горвица [11)	0.81	0.44	0.48	0.53	2.06	0,58	0,42	0,43
П 1 _ невитаминизированная молочная детская смесь. (2—4) — витаминизированная молочная детская смесь; 5 — невитаминизированная соевая детская смесь. (6—8) — витаминизированная соевая детская смесь

9

rOCTEN 14164—2014

Приложение С (справочное)

Факультативный способ подготовки пробы без кислотного гидролиза

Пункты 6 21—622 настоящего стандарта могут быть заменены следующей процедурой Взвешивают в конической колбе необходимое количество пробы с точностью до 1 мг, например. 2.5 г (если содержание витамина 8₆ превышает 2 мкг/г) или 5.0 г (если содержание витамина менее 2 мкг/r) Добавляют 25 см³ раствора ацетата натрия массовой концентрации 0,05 моль/дм³ (см 4 2 14), 2.5 см³ раствора глиоксиловой кислоты молярной концентрации 1 моль/дм³ (см 4 2 19). 400 мм³ раствора сульфата железа (см 4 2.15) и 20 мг раствора кислой фосфатазы (см 4 21) Оставляют раствор на ночь при температуре 37 °С при непрерывном перемешивании

После охлаждения до комнатной температуры доводят водой до метки в мерной колбе вместимостью 50 см³ Встряхивают и фильтруют Смешивают 5.0 см³ отфильтрованного раствора и 4.5 см³ раствора борогидрида натрия молярной концентрации 0.1 моль/дм³ (см 4 2 18) Встряхивают в течение 3 мин Добавляют 0.5 см³ ледяной уксусной кислоты (см 4 2 3) Встряхивают в течение 1 мин Фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм Этот отфильтрованный раствор используют для хроматографического анализа

При проведении вычислений в формуле (4) заменяют общий объем исследуемого раствора пробы 100 см³ на 50 см³

10

TOCTEN 14164—2014

Приложение D (справочное)

Примеры молярных коэффициентов поглощения

0 1 Примеры молярных коэффициентов поглощения (г.) производных витамина В_в (6). (12) приведены в таблице D1.

Таблица 01

Соединения Растворитель W нм ДМ3 МОЛЬ"1 СМ-1 Мм. Г МОЛЬ"1 Пиридоксина гидрохлорид 0,1 моль/дм3 HCI. pH = 1 291 8600 205.8 Пиридоксина гидрохлорид 0.1 мол ь/дм3 фосфатный буфер. pH = 7 323.8 7300 205.8 Пиридоксаля гидрохлорид 0,1 моль/дм3 HCI, pH = 1 288 8960(9000) 203.8 Пиридоксаль-5'-фосфат 0.1 моль/дм3 фосфатный буфер, pH = 7 388 5020 247.1 Пиридоксамина дигидрохлорид 0.1 моль/дм3 НО. pH = 1 292 8200 241,1 Пиридоксамина дигидрохлорид 0.1 моль/дм3 фосфатный буфер. pH = 7 253 4600 241.1 Пиридоксамин-5'-фосфат гидрохлорид 0.1 моль/дм3 фосфатный буфер, pH = 7 328 8370 241.1

11

rOCTEN 14164—2014

Приложение ДА (справочное)

Сведения о соответствии ссылочных европейских стандартов межгосударственным стандартам

Таблица ДА 1

Обозначение и наименование европейского стандарта Степень соответствия Обозначение и наименование межгосударственного стандарта EN ISO 369 — *

‘ Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного европейского стандарта Перевод данного европейского стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов

12

ГОСТ EN 14164—2014

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаюлкя также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

© Стандартинформ. 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

III

TOCTEN 14164—2014

Содержание

1    Область применения..................................................................1

2    Нормативные ссылки..................................................................1

3    Сущность метода.....................................................................1

4    Реактивы............................................................................1

5    Оборудование.......................................................................4

6    Проведение испытаний................................................................4

7    Обработка результатов................................................................5

8    Протокол испытаний..................................................................6

Приложение А (справочное) Пример хроматограммы........................................7

Приложение В (справочное) Данные о прецизионности.......................................8

Приложение С (справочное) Факультативный способ подготовки пробы

без кислотного гидролиза..................................................10

Приложение D (справочное) Примеры молярных коэффициентов поглощения..................11

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии ссылочных европейских стандартов

межгосударственным стандартам..........................................12

Библиография........................................................................13

IV

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение витамина В₆ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

Foodstuffs

Determination of vitamin B6 by high performance chromatography

Дата введения — 2017—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина В₆ в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ). Витамин В₆ представляет собой сумму массовых долей пиридоксина. пиридоксаля. пиридоксамина. включая их фосфорилиро-ванные продукты замещения, в пересчете на пиридоксин. Они определяются по методу, указанному в (1), при помощи которого могут быть разделены и количественно определены как индивидуальные соединения — различные витамеры витамина В₆ (пиридоксаль, пиридоксамин, пиридоксин). В |2] определяется общее содержание витамина В₆ микробиологическим методом.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный нормативный документ. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного документа, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного документа (включая все его изменения):

EN ISO 3696:1997 VNfater for analytical laboratory use — Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3    Сущность метода

Пиридоксаль. пиридоксамин. пиридоксин извлекают из продуктов питания в ходе гидролиза в кислой среде и дефосфорилируют ферментативным путем, используя кислую фосфатазу. В результате реакции с глиоксиловой кислотой в присутствии Fe²* в качестве катализатора пиридоксамин превращается в пиридоксаль. который далее переходит в пиридоксин под воздействием борогидрида натрия в щелочной среде.

Затем пиридоксин количественно определяют в растворе пробы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектором [3]. (4).

4    Реактивы

4.1 Общие положения

Для испытаний используют реактивы гарантированной чистоты и воду не ниже 1-й степени чистоты в соответствии с EN ISO 3696.

Издание официальное

4.2 Реактивы

4.2.1    Кислая фосфатаза из картофеля, ферментная активность составляет 33 нанокатал/мг^{1 2}) с субстратом нитрофенилфосфатом (при pH = 4.8 и температуре 37 °С), например, производства Boehringer или Sigma. Активность 33 нанокатап/мг соответствует 2 U/мг.

4.2.1.1    Раствор кислой фосфатазы

Готовят раствор кислой фосфатазы в растворе ацетата натрия (см. 4.2.14) массовой концентрации 20 мг/см³.

Необходимо использовать кислую фосфатазу, а не Така-диастазу для достижения полного гидролиза фосфорилированных форм витамина В₆. Там. где требуется 300 мг Така-диастазы для получения хорошего дефосфорилирования, кислой фосфатазы потребуется всего 0.5 мг (см. (5)).

4.2.1.2    Проверка активности кислой фосфатазы

Проверяют активность кахщой новой партии кислой фосфатазы следующим образом. Готовят исходный раствор пиридоксальфосфата массовой концентрации 0.1 мг/см³ (см. 4 2 9) в воде. Отбирают для экстракции 5.0 см³ этого раствора и проводят операции, предусмотренные в 6.2.1.6.2 2.6.2.3.6.2.4 и 7.

Рассчитывают коэффициент извлечения пиридоксина из этого раствора и делят на теоретическое количество пиридоксина. выделенного из пиридоксальфосфата. Вычисляют теоретическую массовую концентрацию пиридоксина |>_PN. мг/см³. выделенного из пиридоксальфосфата по формуле:

где pp_LPUv—массовая концентрация пиридоксальфосфата. определенная спектрофотометрическим методом в УФ-области;

Мры — молярная масса образца сравнения витамина В₆ — пиридоксина (M_PN = 169.1), г/моль;

2    —    коэффициент разбавления при реакции с борогидритом натрия:

5,0    —    объем раствора, взятого для экстракции (см. 4.2.1.2), см³;

100    —    общий объем исследуемого раствора пробы, см³;

/Vfpip — молярная масса пиридоксальфосфата (M_PLP = 265,16), г/моль.

Смешивают 3.0 см³ исходного раствора пиридоксальфосфата и 10 см³ соляной кислоты (см. 2.21) в мерной колбе вместимостью 20 см³ и разбавляют до метки водой. Проверяют концентрацию пиридоксальфосфата путем измерения поглощения при 295 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. используя спектрофотометр для УФ-области спектра (см. 5.2) относительно раствора соляной кислоты (см. 4.2.20). Молярный коэффициент поглощения (к) пиридоксальфосфата в растворе соляной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм³ равен 8353.

Рассчитывают массовую концентрацию исходного раствора пиридоксальфосфата p_PLP, мг/см³, по формуле:

₍₂₎

где А₂₉₅ — оптическая плотность раствора при 295 нм;

Mpip— молярная масса пиридоксальфосфата (/Vf_PLP = 265,16), г/моль;

F — коэффициент разбавления (в данном случае F = 20/3);

е — молярный коэффициент поглощения пиридоксальфосфата в 0.1 моль/дм³ соляной кислоты при 295 нм. дмЗмоль-’см^-1 (е = 8353).

4.2.2    Ацетат натрия трехводный (тригидрат), с массовой долей f.>(CH₃COONa ЗН₂0) £ 99.0 %.

4.2.3    Ледяная уксусная кислота, с массовой долей м(СН₃СООН) 2 99,8 %.

4.2.4    Глиоксиловая кислота, с массовой долей о>(С₂Н₂0₃ Н₂0) £ 97.0 %.

4.2.5    Сульфат железа (II) 7-водный (гептагидрат), с массовой долей 0>(FeSO₄7H₂O) г 99.5 %.

4.2.6    Гидроксид натрия, с массовой долей o(NaOH) & 99.0 %.

4.2.7    Борогидрид натрия, с массовой долей ©(NaBH^ > 97.0 %.

4.2.8    Дигидрофосфат калия, с массовой долей о^КЬ^РОд) г 99.0 %.

4.2.9    Пиридоксальфосфат (PLP), с массовой долей т > 99,0 %.

4.2.10    Ортофосфорная кислота, с массовой долей o^H-jPO^) > 84,0 %.

rOCTEN 14164—2014

4.2.11    1-октансульфонат натрия, с массовой долей w(C₈H₁₇Na0₃S) £ 98,0 % или 1-гелтансульфо-нат натрия, с массовой долей o>(C₇H₁₅Na0₃S) 2 98,0 %.

4.2.12    Ацетонитрил (квалификации «для ВЭЖХ»), с массовой долей m(C₂H₃N) > 99,8 %.

4.2.13    Раствор ацетата натрия, массовой концентрации c(CH₃COONa ЗН₂0) = 2,5 моль/дм³.

Растворяют 170,1 г ацетата натрия трехводного (см. 4.2.2) в 500 см³ воды.

4.2.14    Раствор ацетата натрия. c(CH₃COONa ЗН₂0) = 0.05 моль/дм³ (pH = 4.5).

Растворяют 6.8 г ацетата натрия трехводного (см. 4.2.2) в 1 дм³ воды. Устанавливают pH = 4.5. используя ледяную уксусную кислоту (см. 4 2.3).

4.2.15    Раствор сульфата железа. c(FeS0₄ 7Н₂0) = 0.0132 моль/дм³.

Растворяют 36,6 мг сульфата железа (II) 7-водного (см. 4.2.5) в 10 см³ раствора ацетата натрия (см. 4.2.14). Раствор готовят в день использования.

Примечание — В исследовании, описанном в [10]. использовался раствор сульфата железа с массовой концентрацией 10 г/дм³ Эта концентрация была выбрана для осуществления полного превращения пиридокса-мина в пиридоксаль на уровне содержания пиридоксамина в 8 раз большего минимального уровня витамина В_в, установленного законодательством США о детских смесях (см [9]). Такая концентрация не является обязательной для европейских стран

4.2.16    Раствор гидроксида натрия. c(NaOH) = 0,2 моль/дм³.

Растворяют 800 мг гидроксида натрия (см. 4.2.6) в 100 см³ воды.

4.2.17    Раствор гидроксида натрия. c(NaOH) = 6.0 моль/дм³.

Растворяют 24 г гидроксида натрия (см. 4.2.6) в 100 см³ воды.

4.2.18    Раствор борогидрида натрия. c(NaBH₄) = 0.1 моль/дм³.

Растворяют 378 мг борогидрида натрия (см. 4.2.7) в 100 см³ раствора гидроксида натрия (см. 4.2.16). Раствор готовят в день использования.

4.2.19    Раствор глиоксиловой кислоты. с(С₂Н₂0₃ Н₂0) = 1 моль/дм³ (pH = 4,5).

Растворяют 4.7 г моногидрата глиоксиловой кислоты (см. 4.2.4) в 30 см³ раствора ацетата натрия (см. 4.2.13).

Устанавливают значение pH 4.5. используя раствор гидроксида натрия (см. 4.2.17), и доводят водой до метки в мерной колбе вместимостью 50 см³. Раствор готовят в день использования.

4.2.20    Соляная кислота. с(НС1) = 0.1 моль/дм³.

4.2.21    Соляная кислота. с(НС1) = 0.2 моль/дм³.

4.2.22    Подвижная фаза для ВЭЖХ.

В лабораторный стакан добавляют 940 см³ воды. 40 см³ ацетонитрила (см. 4.2.12). 160 мг 1-октан-сульфоната натрия или 1-гептансульфоната натрия (см. 4 2.11) и 6.8 г дигидрофосфата калия (см. 4.2.8).

После растворения 1-октансульфоната натрия или 1-гептансульфоната натрия и дигидрофосфата калия устанавливают значение pH 2.5. используя ортофосфорную кислоту (см. 4.2.10). Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм³. Доводят до метки водой. Фильтруют через фильтр с размером пор 0.45 мкм.

4.3    Пиридоксина гидрохлорид (образец сравнения витамина В₆), <o(C₈H₁₁N0₃'HCI) > 99 %

4.4    Исходный раствор пиридоксина гидрохлорида с массовой концентрацией 0,5 мг/см³

Растворяют 50 мг пиридоксина гидрохлорида в 100 см³ воды. Исходный раствор стабилен в течение четырех недель при хранении при температуре 4 °С в темном месте.

Для определения массовой концентрации разбавляют 0,5 см³ исходного раствора пиридоксина гидрохлорида в 20 см³ раствора соляной кислоты (см. 4.2.20) молярной концентрации 0.1 моль/дм³ и измеряют оптическую плотность при 290 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см, используя спектрофотометр для УФ-области спектра (см. 5.2) относительно раствора соляной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм³. Рассчитывают массовую концентрацию исходного раствора, мкг/см³, по формуле:

где А₂до— оптическая плотность раствора при 290 нм;

М_Ри — молярная масса стандартного вещества витамина В₆. в г/моль (M_PN = 205.64);

F — коэффициент разбавления (F = 40);

с — молярный коэффициент поглощения пиридоксина гидрохлорида в растворе соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³ при 291 нм, в дм³/моль~¹см~¹(е = 8600 по [6]).

Дополнительная информация о молярных коэффициентах поглощения в других растворах, кроме раствора соляной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм³ HCI (pH = 1). приведена в приложении D.

4.5 Стандартные растворы

4.5.1    Стандартный раствор пиридоксина гидрохлорида, c(C₈H₁₁N0₃ HCI) = 10 мкг/см³

При помощи пипетки переносят 1 см³ исходного раствора витамина В₆ (см. 4.4) в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводят водой до метки. Раствор готовят в день использования.

4.5.2    Стандартные рабочие растворы пиридоксина гидрохлорида для ВЭЖХ, cfCgH^NOj* HCI) от 0,1 до 1 мкг/см³

Готовят ряд соответствующих стандартных рабочих растворов пиридоксина гидрохлорида, массовая концентрация которых варьируется от 0.1 до 1 мкг/см³. используя стандартный раствор пиридоксина (см. 4.5.1). Эти растворы готовят в день использования.

Проводят проверку пригодности хроматографической системы путем инжектирования смешанного стандартного рабочего раствора пиридоксина (PN) и пиридоксаля (PL). Пиридоксин (PN) и пиридок-саль (PL) должны иметь известную концентрацию в стандартном рабочем растворе для ВЭЖХ. Пири-доксаль (PL) элюируется перед пиридоксином (PN). Пара PN/PL должна иметь разделение до базовой линии. К отдельной пробе добавляют пиридоксамин (РМ). чтобы удостовериться в полноте дезаминирования и окисления.

5    Оборудование

Используется следующее лабораторное оборудование:

5.1    Стеклянная посуда.

5.2    Спектрофотометр для УФ-области спектра, предназначенный для измерений оптической плотности при заданных длинах волн.

5.3    Нагревательный прибор.

Печь или водяная баня с приспособлениями для встряхивания

5.4    Система для высокоэффективной жидкостной хроматографии, состоящая из насоса, устройства для ввода пробы, флуоресцентного детектора с длинами волн возбуждения и регистрации, установленными на 290 и 395 нм соответственно, и системы обработки данных, например, интегратора.

5.5    ВЭЖХ-колонка. например, колонка для обращенно-фазовой хроматографии, такая как LiChrosper^eO RP С8 Select В, размер частиц 5 мкм. диаметр 4.0 мм. длина 250 мм.

Помимо указанных в настоящем стандарте, могут использоваться колонки других типоразмеров и с частицами другого размера. Параметры разделения должны быть адаптированы для таких материалов. чтобы гарантировать получение объективных результатов. Критерий эффективности для аналитических колонок — это полное разделение пиков рассматриваемых анализируемых веществ.

5.6    Фильтровальный прибор.

Фильтрование подвижной фазы, а также исследуемого раствора пробы через мембранный фильтр, например с размером пор фильтра 0.45 мкм, перед использованием или впрыскиванием продлит срок службы колонок.

6    Проведение испытаний

6.1    Подготовка проб для испытаний

Пробу гомогенизируют. Измельчают крупнозернистый материал, используя подходящий измельчитель. и снова перемешивают. Необходимо проводить предварительное охлаждение для избежания длительного воздействия высоких температур.

6.2    Подготовка раствора пробы

6.2.1 Извлечение

Взвешивают соответствующее количество пробы с точностью до 1 мг. например 2.5 г (если содержание витамина В_б превышает 2 мкг/г) или 5 г (если содержание витамина менее 2 мкг/г), в конической колбе. Добавляют 50 см³ раствора соляной кислоты (см. 4 2.20). Нагревают в течение 30 мин. в кипящей водяной бане.

4

rOCTEN 14164—2014

m — масса пробы, г;

100 — общий объем исследуемого раствора пробы, см³;

2    —    коэффициент    разбавления реакции с борогидридом натрия при добавлении уксусной кис

лоты. в противном случае коэффициент разбавления равен 1.9;

1000 — коэффициент для перевода микрограммов в миллиграммы;

100 — коэффициент для приведения массовой доли к 100 г пробы;

0,822 — коэффициент для пересчета содержания лиридоксина гидрохлорида на пиридоксин.

В протоколе испытаний результат для витамина В₆ представляют в пересчете на пиридоксин и выражают в мг/100 г.

8 Протокол испытаний

В протоколе испытания должны содержаться следующие данные:

a)    информация об идентификации пробы;

b)    ссылка на настоящий стандарт;

c)    дата отбора проб и процедура (если известны);

d)    дата поступления пробы;

e)    дата проведения испытания;

О результаты и единицы измерений, в которых выражены результаты; д) любые особенности, которые наблюдались в ходе испытания;

h) любые операции, не указанные в методе, или относящиеся к факультативным, которые могли повлиять на результаты.

6

1

’) Катал (обозначается «кат») — единица измерения активности катализатора в системе СИ Активность катализатора в один катал увеличивает скорость реакции на один моль/с в заданных условиях

2

3