МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

33428-

2015

(ISO 17180:2013)

КОРМА, ПРЕМИКСЫ

Определение содержания лизина, метионина и треонина

(ISO 17180:2013,

Animal feeding stuffs — Determination of lysine, methionine and threonine in commercial amino acid products and premixtures,

MOD)

Издание официальное

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ    1.2—2009    «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты

межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП») основе официального перевода на русский язык английской версии международного стандарта, указанного в пункте 5

2    ВНЕСЕН Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации МТК4 «Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы»

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 августа 2015 г. № 79-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по MK (ИСО 3166) 004—97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Армения AM Минэкономики Республики Армения Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Киргизия KG Кыргызстандарт Россия RU Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 2 октября 2015 г. № 1445-ст межгосударственный стандарт ГОСТ33428—2015 (IS017180:2013) введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 17180:2013 «Корма для животных. Определение содержания лизина, метионина и треонина в коммерческих аминокислотных продуктах и премиксах» («Animal feeding stuffs — Determination of lysine, methionine and threonine in commercial amino acid products and premixtures», MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.5).

Международный стандарт разработан подкомитетом ISO/ТС 34/SC 10 «Корма для животных» технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO).

Уточненные отдельные слова, фразы, абзацы внесены в текст межгосударственного стандарта для приведения в соответствие с отраслевой терминологией и выделены курсивом. Дополнительные примечания, разделы и таблица выделены полужирным курсивом.

В настоящем стандарте заменены единицы измерения объема «литр» на «дециметр кубический», «миллилитр» на «сантиметр кубический» для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (пункт4.14.1).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта в соответствии с требованиями межгосударственной системы стандартизации и общепринятой отраслевой терминологией.

В настоящем стандарте ссылки на международные стандарты, используемые в примененном международном стандарте, заменены на межгосударственные стандарты, гармонизированные с международными.

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

ГОСТ 33428-2015

10.2 Повторяемость

Выполняют два параллельных испытания.

Рассчитывают относительную погрешность D, %, по формуле

Q_\^waa'\ ^waa 21 -|qq    (7)

^waa med

где w_aa1 w_aa2 — значения массовой доли аминокислоты в анализируемой навеске двух параллельных

испытаний, %;

^waa med — среднее арифметическое значение результатов двух параллельных испытаний;

100 — коэффициент пересчета в проценты.

Принимают среднее арифметическое значение результатов двух испытаний, если D меньше 1,5%.

Если относительная погрешность больше, выполняют третье испытание анализируемой пробы и определяют среднее арифметическое значение трех испытаний. Если CV меньше или равен 3 %, записывают среднее арифметическое значение трех испытаний.

Если CV выше 3 %, повторяют испытание, начиная с гомогенизации лабораторных проб.

Если результаты двух новых испытаний снова не удовлетворяют условию D меньше 1,5 %, то ошибка происходит при хроматографировании. Необходимо проверить анализатор и повторить все сомнительные испытания.

10.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных испытаний, полученными одним и тем же методом, на идентичных пробах, в разных лабораториях, разными операторами, на различных экземплярах оборудования, не должно превышать более чем в 5 % случаев предел воспроизводимости R, приведенный в приложении А.

11 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать, по меньшей мере, следующую информацию:

a)    всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b)    использованный метод отбора проб, если он известен;

c)    использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d)    все детали работы, не установленные в настоящем стандарте или считающиеся необязательными, наряду с подробностями всех случаев, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

e)    полученный(е) результат(ы) испытаний;

f)    если повторяемость была проверена, полученный окончательный результат.

7

ПриложениеА (справочное)

Данные совместных исследований

В совместном исследовании по определению лизина, метионина и треонина в концентрированных аминокислотных продуктах и премиксах приняли участие 17 лабораторий. Было проанализировано 13 проб в двух повторное-тях: четыре аминокислоты и девять премиксов.

Таблица А.1

Коммерческая аминокислота или премикс Амино кислота8^ Ожидаемое значение, % Количество лабораторий Среднее значение, % Стандартное отклонение повторяемости Sr CV от повторяемости cv, г, % Стандартное отклонение воспроизводимое-ти SR CV от воспроиз-водимос- ти с % Предел повторяе мости Г=2‘83г Предел воспроиз водимос ти R = 2’^sr Значение Хоррата № 1 Биолиз Lys 17 45,89 0,39 0,84 1,06 2,31 1,08 2,96 1,03 №2 премикс Met 27,00 16 26,55 0,41 1,56 0,49 1,85 1,16 1,37 0,76 Thr 15,00 16 14,85 0,19 1,29 0,35 2,33 0,54 0,97 0,88 №3 премикс Lys 20,80 17 20,56 0,27 1,33 0,51 2,49 0,77 1,44 0,98 Met 11,00 17 11,26 0,14 1,24 0,21 1,84 0,39 0,58 0,66 Thr 8,00 17 8,22 0,05 0,65 0,16 1,9 0,15 0,44 0,65 №4 премикс Lys 16,80 17 16,63 0,22 1,29 0,39 2,32 0,6 1,08 0,89 Met 14,00 17 14,21 0,13 0,93 0,27 1,92 0,37 0,76 0,72 Thr 11,00 17 11,19 0,09 0,82 0,25 2,22 0,26 0,7 0,8 №5 премикс Lys 12,80 17 12,58 0,09 0,74 0,23 1,86 0,26 0,65 0,68 Met 32,00 17 32,04 0,16 0,5 0,83 2,59 0,45 2,32 1,09 Thr 22,00 17 22,1 0,18 0,81 0,43 1,94 0,5 1,2 0,77 №6 премикс Lys 12,29 17 12,3 0,21 1,68 0,26 2,13 0,58 0,73 0,78 Met 30,72 17 30,59 0,32 1,06 0,76 2,5 0,9 2,14 1,05 Thr 21,12 17 21,25 0,25 1,18 0,4 1,87 0,7 1,11 0,74 №7 премикс Lys 10,40 17 10,27 0,12 1,21 0,19 1,81 0,35 0,52 0,64 Met 9,00 17 9,1 0,08 0,92 0,13 1,48 0,23 0,38 0,52 Thr 14,00 17 14,03 0,1 0,7 0,29 2,07 0,27 0,81 0,77 №8 премикс Lys 10,24 17 10,12 0,12 1,2 0,15 1,5 0,34 0,42 0,53 Met 8,86 17 8,91 0,08 1,17 0,17 1,89 0,29 0,47 0,66 Thr 13,79 17 13,83 0,19 1,35 0,31 2,25 0,52 0,87 0,84 №9 премикс Lys 24,00 17 23,48 0,26 1,13 0,5 2,15 0,74 1,41 0,86 Met 19,00 17 19,09 0,19 0,99 0,33 1,73 0,53 0,93 0,67 Thr 15,00 17 15,09 0,15 1 0,3 1,99 0,42 0,84 0,75 № 10 премикс Lys 23,28 17 22,85 0,19 0,84 0,41 1,78 0,54 1,14 0,71 Met 18,43 17 18,65 0,13 0,68 0,29 1,53 0,36 0,8 0,59 Thr 14,55 17 14,65 0,14 0,96 0,31 2,15 0,4 0,88 0,81

ГОСТ 33428-2015

Окончание таблицы АЛ

Коммерческая аминокислота или премикс Амино кислота3^ Ожидаемое значение, % Количество лабораторий Среднее значение, % Стандартное отклонение повторяемости Sr СV от повторяемости, Cv, г, % Стандартное отклонение воспроизводимое- ™SR CV от воспроиз-водимос- ти с % Предел повторяемости r= 2>8Sr Предел воспроиз водимос ти ^ = ^’^SR Значение Хоррата № 11 L-лизин HCI Lys 76,04 17 74,11 0,69 0,93 1,32 1,78 1,93 3,7 0,85 № 12 DL-мети-онин Met 93,55 17 93,27 0,79 0,85 1,42 1,52 2,22 3,98 0,75 № 13 L-трео-нин Thr 95,95 17 95,46 1,11 1,17 2,07 2,16 3,12 5,78 1,07 а) Lys — лизин; Met — метионин; Thr — треонин.

9

Приложение ДА (справочное)

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного в нем международного стандарта

Таблица ДА.1

Структура настоящего стандарта Структура международного стандарта ISO 17180:2013 Подраздел Пункт Подпункт Подраздел Пункт Подпункт Раздел 1 Раздел 1 Раздел 2 — Раздел 3 Раздел 2 Раздел 5 Раздел 3 5.1 — — 3.1 — — 5.2 5.2.1 — 3.2 3.2.1 — — 5.2.2 — — 3.2.2 — 5.2.3 — — 3.2.3 5.3 — — 3.3 — — 5.4, 6.1 — — 3.4 — — 5.5 — — 3.5 — — 5.6 — — 3.6 — — 5.7 — — 3.7 — — 5.8 — — 3.8 — — 6.3 — — 3.9 — — 6.2 — — 3.10 — — 6.4 6.4.1 — 3.11 3.11.1 — — 6.4.2 — — 3.11.2 — — 6.4.3 6.4.3.1 — 3.11.3 3.11.3.1 — — 6.4.3.2 — — 3.11.3.2 5.9 — — 3.12 — — 5.10 — — 3.13 — — Раздел 4 Раздел 4 4.1—4.10 4.1—4.10 4.11 — — — — — 4.12 — — — — — 4.13 — — — — — 4.14 — — — — — 4.15 — — — — — Раздел 7, 8 Раздел 5 7.1 — — — — — 7.2 5.1 — — 8.1 — — 5.2 — — 8.2 8.2.1 — 5.3 5.3.1 —

Окончание таблицы ДА. 1

Структура настоящего стандарта Структура международного стандарта ISO 17180:2013 Подраздел Пункт Подпункт Подраздел Пункт Подпункт — 8.2.2 — — 5.3.2 — 8.3 8.3.1 — 5.4 5.4.1 — — 8.3.2 — — 5.4.2 — 8.4 — — 5.5 — — Раздел 9 Раздел 6 9.1 — — 6.1 — — 9.2 — — 6.2 — — 9.3 — — 6.3 — — Раздел 10 Раздел 7 10.1 — — 7.1 — — 10.2 — — 7.2 — — 10.3 — — 7.3 — — Раздел 11 Раздел 8 Приложение А Приложение А Приложение ДА — Примечания 1    В соответствии с ГОСТ 1.5-2001 в настоящий стандарт добавлен раздел 2 «Нормативные ссылки». 2    Раздел 3 международного стандарта «Реактивы и материалы» представлен в настоящем стандарте разделом 5 с добавлением не указанных в международном стандарте реактивов. 3    Из раздела 3 международного стандарта подразделы, описывающие приготовление растворов, перенесены в раздел 6. 4    В раздел 4 настоящего стандарта введены подразделы с указанием используемого оборудования. 5    В соответствии с ГОСТ 1.5-2001 настоящий стандарт дополнен разделом 7 и подразделом 7.1 «Отбор проб». 6    В соответствии с ГОСТ 1.5-2001 и ГОСТ 1.3-2008 настоящий стандарт дополнен приложением ДА «Сравнение структуры межгосударственного стандарта со структурой международного стандарта».

11

УДК 636.085.3:006.354    МКС    65.120    MOD

Ключевые слова: комбикормовая продукция, премиксы, комбикормовое сырье, метод, метионин, лизин, треонин, норлейцин, аминокислотный анализатор, ВЭЖХ, экстракция, дериватизация, нингид-рин, ортофталдиальдегид (ОРА), весовое разведение, объемное разведение

Редактор Н.Н. Мигунова Технический редактор В.Ю. Фотиева Корректор Е.Д. Дульнева Компьютерная верстка А.Н. Золотаревой

Сдано в набор 26.11.2015. Подписано в печать 22.03.2016. Формат 60x84^. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 1,86. Уч.-изд. л. 1,40. Тираж 36 экз. Зак. 818.

Издано и отпечатано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru    info@gostinfo.ru

ГОСТ 33428-2015

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного стандарта приведено в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 33428-2015

Содержание

1    Область применения...................................................1

2    Нормативные ссылки..................................................1

3    Сущность метода...................................................2

4    Оборудование.......................................................2

5    Реактивы и материалы.................................................2

6    Приготовление растворов..............................................3

7    Отбор и подготовка проб................................................4

8    Проведение испытания.................................................4

8.1    Количество испытаний...............................................4

8.2    Приготовление анализируемых растворов с использованием весового разведения.......4

8.3    Приготовление анализируемых растворов с использованием объемного разведения......5

8.4    Хроматография...................................................5

9    Обработка результатов...............................................5

9.1    Гоадуировка и контроль стабильности градуировочной характеристики.............5

9.2    Вычисление результатов при весовом разведении............................5

9.3    Вычисление результатов при объемном разведении...........................6

10    Прецизионность....................................................6

10.1    Межлабораторные испытания.......................................6

10.2    Повторяемость..................................................7

10.3    Воспроизводимость...............................................7

11    Протокол испытаний..................................................7

Приложение А (справочное) Данные совместных исследований........................8

Приложение ДА (справочное) Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой

примененного в нем международного стандарта......................10

IV

ГОСТ 33428-2015 (IS017180:2013)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КОРМА, ПРЕМИКСЫ Определение содержания лизина, метионина и треонина

Feeds, premixtures. Determination of lysine, methionine and threonine

Дата введения — 2017—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод количественного определения свободных (не входящих в состав белков) лизина, метионина и треонина (далее —аминокислот) в комбикормовой продукции и комбикормовом сырье, содержащих более 10 % массовой доли соответствующей аминокислоты.

Метод не позволяет различить D- и /.-формы.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ OIML R 76-1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 13496.0—80*Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 25336-82 посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИС0835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 6497-2011 «Корма для животных. Отбор проб».

Издание официальное

3    Сущность метода

Пробы обрабатывают раствором соляной кислоты, разбавляют цитратным буфером и добавляют внутренний стандарт норлейцина. Аминокислоты разделяют на аминокислотном анализаторе или высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием катионообменной смолы и цитратного буфера в качестве элюента, проводят дериватизациюнингидрином илиортофталдиальдегидом (ОРА)и детектируют с помощью фотометрического или флуоресцентного детектора соответственно.

4    Оборудование

4.1    Стаканы В(Н)—1(2)—100(250, 1000) ТХС по ГОСТ25336.

4.2    Колбы мерные 1(2)—50(100, 1000)—2 по ГОСТ 1770.

4.3    Цилиндры мерные 1(2)—100(1000) по ГОСТ 1770.

4.4    Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)—1(1а, 2, 2а)—1—5(10) по ГОСТ29227.

4.5    Мешалка магнитная или блендер механический.

4.6    Фильтры мембранные из ацетата целлюлозы или PVDF с размером пор 0,2 мкм.

4.7    Дилютор для объемного разведения.

Если дериватизацию проводят с нингидрином, то используют разбавление в соотношении 1:20. Для ОРАдериватизации используют более высокий коэффициент разбавления. Необходимо регулярно проверять коэффициент вариации CV при разведении; CV должен быть не менее 1 %.

4.8    рН-метр

pH-метр или иономер с диапазоном измерений активности водородных ионов от 0 до 14 ед. pH и пределом допускаемой абсолютной погрешности измерения не более 0,05 ед. pH.

4.9    Весы неавтоматического действия специального класса точности с пределами допускаемой погрешности не более + 0,0005 г (100,0 ±0,5) мг по ГОСТ R OIML 76-1.

4.10    Анализатор аминокислотный или другое оборудование для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), включающее:

4.10.1    колонку с подготовленой катионнобменной смолой;

4.10.2    предколонку;

4.10.3    инжектор автоматический или ручной с объемом ввода от 10 до 100 мкдм³;

4.10.4    ВЭЖХ насосы для буферов;

4.10.5    систему постколоночной дериватизации с нингидрином или ОРА;

4.10.6    УФ-детектор канальный, установленный на 440 и 570 нм для постколоночной дериватизации с нингидрином, или детектор флуоресцентный с длиной волны возбуждения 330 нм и длиной волны излучения 460 нм для постколоночной дериватизации с ОРА;

4.10.7    систему регистрации и обработки данных.

4.11    Дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема 10—100, 100—1000, 1000—5000 мм³ по ГОСТ28311.

4.12    Пробирки однократного применения (типа Эппендорф) вместимостью 1,5 см³.

4.13    Сито с размером стороны ячейки 0,25 мм.

4.14    Мельница лабораторная или ступка.

4.15    Колбы Кн—1(2)—500—34/35 ТХС по ГОСТ 25336.

5    Реактивы и материалы

5.1    Вода бидистиллированная или эквивалентного качества (проводимость менее 10 мкс/см).

5.2    Стандарты определяемых аминокислот с массовой долей основного вещества не менее 99 %, высушенные под вакуумом в эксикаторе над пятиокисью фосфора Р₂0₅ в течение двух дней перед использованием.

5.2.1    Лизин HCI кристаллический.

5.2.2    Треонин кристаллический.

5.2.3    Метионин кристаллический.

5.3    Норлейцин кристаллический для использования в качестве внутреннего стандарта с массовой долей основного вещества не менее 99 %, высушенный под вакуумом в эксикаторе над пятиокисью фосфора Р₂0₅ в течение двух дней перед использованием.

5.4    Натрия гидроокись по ГОСТ4328.

5.5    Кислота соляная по ГОСТ3118.

ГОСТ 33428-2015

5.6    Натрий лимоннокислый двуводный.

5.7    2,2'-Тиодитанол (тиодигл икол ь) с содержанием основного вещества не менее 95,0 %

5.8    Фенол кристаллический с массовой долей основного вещества не менее 98,5 %.

5.9    Буферы элюирующие для катионнообменной колонки.

Используют имеющиеся в продаже готовые буферы или готовят их в соответствии с инструкцией к используемому анализатору. Обычно используют от трех до пяти буферных растворов, содержащих карбонат или цитрат натрия и небольшие количества добавок или консервантов.

5.10    Нингидрин или ОРА. Используют имеющиеся в продаже реактивы или готовят их в соответствии с инструкцией к используемому анализатору.

5.11    Оксид фосфора (V) с содержанием основного вещества не менее 98 %.

5.12    Кислота лимонная по ГОСТ 3652.

5.13    Натрий хлористый по ГОСТ4233.

Примечание — Допускается использование реактивов аналогичной квалификации.

6 Приготовление растворов

6.1    Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 7,5 моль/дм³

Гидроокись натрия массой 300,0 г растворяют в воде (см. 5.1) небольшими порциями при перемешивании и после охлаждения доводят объем раствора водой до 1000 см³.

Срок хранения раствора не ограничен.

6.2    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ (см. 4.3) помещают 8,2 см³ соляной кислоты (см. 5.5), добавляют около 900 см³ воды (см. 5.1), тщательно перемешивают и доводят водой (см. 5.1) объем раствора до метки.

Срок хранения раствора не ограничен.

6.3    Приготовление цитратного буфера 2,20 ед. pH

В стакан вместимостью 1000 см³помещают 19,61 г двувод ного лимоннокислого натрия (см. 5.6), 1 г фенола (см. 5.8), 5 см³ тиодигликоля (см. 5.7), 16,5 см³ соляной кислоты (см. 5.5) и растворяют их в 800 с/и³ бидистиллированной воды (фенол используют для сохранения буферного раствора). Доводят pH раствора до2,20 ед. pH несколькими каплями раствора соляной кислоты (см. 5.5) v\nv\ раствора гидроокиси натрия (см. 6.1).

Цитратный буфер может быть приготовлен из лимонной кислоты и хлорида натрия.

Срок хранения раствора при комнатной температуре в местах, защищенных от попадания прямых солнечных лучей, — 2 мес. При наличии в растворе помутнения и хлопьевидного осадка раствор следует заменить свежеприготовленным.

6.4    Приготовление стандартных растворов аминокислот

6.4.1    Приготовление основного раствора норлейцина молярной концентрации

2.5    ммоль 1дм³

В стакане вместимостью 100 (250) см³ растворяют 0,328 г норлейцина (см. 5.3) в растворе соляной кислоты (см. 6.2), количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят объем до метки тем же раствором (см. 6.2).

Срок хранения раствора при температуре ниже 5 °С — не более 6 мес.

6.4.2    Приготовление основных растворов аминокислот молярной концентрации

2.5    ммоль/дм³

Готовят основные растворы для каждой аминокислоты.

Основные растворы должны содержать только анализируемые аминокислоты, т. е. лизин, треонин, метионин. Не рекомендуется использовать имеющиеся в продаже готовые смеси, например содержащие 18 аминокислот, т. к. они дают большую погрешность определения.

В три мерные колбы вместимостью 1000 см³ помещают соответственно 0,456 г лизина гидрохлорида (см. 5.2.1), 0,297 г треонина (см. 5.2.2), 0,373 г метионина (см. 5.2.3), доводят объем в колбах до метки раствором соляной кислоты (см. 6.2).

Срок хранения растворов при температуре ниже 5 °С — не более 6 мес.

6.4.3    Приготовление градуировочных растворов аминокислот

6.4.3.1 Весовое разведение

3

В колбы вместимостью 50 см³ взвешивают (см. 4.9) по 2,5 см³основного раствора каждой аминокислоты т_аа (см. 6.4.2) и 2,5 см³ основного раствора норлейцина (т^_е) (см. 6.4.1). Доводят объем раствора в колбе до метки цитратным буфером (см. 6.3).

Срок хранения раствора при температуре ниже 5 °С — не более 1 нед.

6.4.3.2 объемное разведение

С помощью пипеточного дозатора (см. 4.11) или дилютора (см. 4.7) разбавляют равные объемы основных растворов аминокислот (см. 6.4.2) и основного раствора норлейцина (см. 6.4.1) цитратным буфером (см. 6.3). Например, 50 мм³основного раствора норлейцина и 50 мм³основного раствора аминокислоты разбавляют в пробирке однократного применения (типа Эппендорф) или дилюторе цитратным буфером до 1000 мм³.

7    Отбор и подготовка проб

7.1    Отбор проб — по ГОСТ 13496.0.

7.2    Подготовка проб

Пробу измельчают на лабораторной мельнице или в ступке (см. 4.15) до прохода через сито с размером стороны ячейки 0,25 мм (см. 4.14) и тщательно перемешивают.

8    Проведение испытания

8.1    Количество испытаний

Для каждой пробы проводят два параллельных испытания в условиях повторяемости.

8.2    Приготовление анализируемых растворов с использованием весового разведения

8.2.1    Приготовление анализируемых растворов аминокислот

Взвешивают 0,45—0,47 г лизина гидрохлорида, 0,29—0,31 г треонина и 0,36—0,38 г метионина. Навески переносят во взвешенные конические колбы (см. 4.16) вместимостью 500 см³ и добавляют примерно по 400 см³ раствора соляной кислоты (см. 6.2). Колбы помещают на магнитную мешалку (см. 4.5) и перемешивают содержимое в течение 30 мин. Взвешивают колбы с растворами и вычисляют массу экстракционного раствора т_ех.

С помощью пипеточного дозатора (см. 4.12) берут аликвоту 1 см³ в предварительно взвешенную мерную колбу вместимостью 50 см³ и определяют массу аликвоты т_аИ. В ту же колбу помещают

2.5    см³ раствора норлейцина (см. 6.4.1), взвешивают колбу и вычисляют его массу m_{N!e ts}, затем доводят объем раствора до метки цитратным буфером (см. 6.3) и тщательно перемешивают.

Если приготовленный раствор не был проанализирован в день приготовления, то он должен храниться при температуре ниже 5 °С не более трех дней.

8.2.2    Приготовление анализируемых растворов премиксов и смесей аминокислот

Если в продукте ожидается низкое содержание аминокислот, то примерную массу навески продукта m_tp р_Гегп|_Х г, вычисляют по формуле

_ ^tp pure аа ' Ю0    (1)

^т tp premix    ,77    >

''exp

где m_{tp pureaa} — масса навески анализируемой аминокислоты, г;

100 — коэффициент пересчета из процентов;

1/1/^ — ожидаемое низкое значение массовой доли аминокислоты, %.

Например, для премикса с массовой долей DL-метионина 20 % требуется навеска в размере от 1,8 до 1,9 г.

Рассчитанные навески взвешивают в предварительно взвешенные конические колбы (см. 4.16) вместимостью 500 см³. Добавляют примерно по 400 см³ раствора соляной кислоты (см. 6.2). Колбы помещают на магнитную мешалку (см. 4.5) и перемешивают содержимое в течение 30 мин. Взвешивают колбы с растворами и вычисляют массу экстракционного раствора т_ех.

С помощью пипеточного дозатора (см. 4.12) берут аликвоту 1 см³ в предварительно взвешенную мерную колбу вместимостью 50 см³ и определяют массу аликвоты т_аИ. В ту же колбу помещают

2.5    см³ раствора норлейцина (см. 6.4.1), взвешивают колбу и вычисляют его массу m_{N!e ts}, затем доводят объем раствора до метки цитратным буфером (см. 6.3) и тщательно перемешивают.

4

т_аа — масса 2,5 см³ основного раствора аминокислоты, г;

Лаас — площадь пика аминокислоты в градуировочном растворе; m_N|_e — масса 2,5 см³ основного раствора норлейцина, г.

Вычисляют массовую долю аминокислоты в пробе w_aa, %, используя формулу

_ Aaats /~Raa Yaa ^mNlete ^mex ' ЮО    (3)

³³    ^Nles'^mtp    ^mali' 1000

где A_aa ts — площадь пика аминокислоты в анализируемом растворе;

F_Raa — коэффициент чувствительности аминокислоты; у_аа — концентрация аминокислоты в основном растворе, г/дм³, предполагая, что 1000 см³ раствора весит 1 кг, г/кг\

m_N|e ts — масса 2,5 см³ основного стандартного раствора норлейцина в анализируемом растворе, г; ^тех — масса экстракционного раствора, г;

100 — коэффициент перевода результата в проценты;

A_N!ets — площадь пика норлейцина в анализируемом растворе; m_tp — масса навески, г;

^maii — масса используемой аликвоты экстракционного раствора, г.

1000 — коэффициент согласования единиц массы.