ГОСТ 32201-2013
Корма, комбикорма. Метод определения содержания триптофана

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

32201-

2013

(ISO 13904:2005)

КОРМА, КОМБИКОРМА

Метод определения содержания триптофана

(ISO 13904:2005, MOD)

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-

дарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 ноября 2013 г. №44)

За принятие проголосовали:

Краткоо наименование страны Ксщ страны Сокращенное наименование национального органа по MK (ИСО 3166) 004—97 по МК (ИСО 3166) 004—97 по стандартизации Армении AM Минэкономики Республики Армения Россия RU Росстандарт Узбекистан UZ Узстандарт

4    Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту IS0 13904:2005 Animal feeding stuffs — Determination of tryptophan content (Корма для животных. Определение содержания триптофана).

Международный стандарт разработан подкомитетом ISO/TC 10 «Корма для животных» технического комитета по стандартизации 1ЭОЯС 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (еп).

Уточняющие отдельные слова, фразы, абзацы внесены в текст межгосударственного стандарта для приведения в соответствие с требованиями ГОСТ 1.5-2001. отраслевой терминологией и выделены курсивом. Дополнительные примечания, разделы, таблица и приложения выделены полужирным курсивом.

В настоящем стандарте заменены единицы измерения объема: «литр» на «кубический дециметр», «миллилитр» на «кубический сантиметр», для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (пункт 4.14.1).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта в соответствии с требованиями межгосударственной системы стандартизации и общепринятой отраслевой терминологией.

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.

Сравнение структуры международного стандарта со структурой межгосударственного стандарта приведено в дополнительном приложении ДА

Степень соответствия — модифицированная (MOD)

5    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. №1698-ст межгосударственный стандарт ГОСТ32201—2013 (IS013904:2005) введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ГОСТ 32201-2013

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответслюующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 32201-2013

Содержание

1    Область применения...................................................1

2    Нормативные ссылки..................................................1

3    Сущность метода ...................................................2

4    Лабораторное оборудование и посуда.......................................2

5    Реактивы..........................................................2

6    Приготовление растворов..............................................3

7    Отбор проб........................................................4

8    Подготовка проб ....................................................4

9    Проведение испытания.................................................4

10    Обработка результатов................................................5

11    Прецизионность.....................................................5

12    Протокол испытания.................................................6

Приложение А (справочное) Уточнения по выполнению измерений......................7

Приложение Б (справочное) Результаты межлабораторных испытаний....................8

Приложение ДА (справочное) Сравнение структуры международного стандарта со структурой

межгосударственного стандарта.................................10

Библиография........................................................12

IV

ГОСТ 32201-2013 (ISO 13904:2005)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КОРМА. КОМБИКОРМА Метод определения содержания триптофана

Feeds, compound feeds. Method for determination of tryptophan

Дата введения — 2015—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма, комбикорма, а также на кормовые добавки, концентраты, премиксы, комбикормовое сырье и устанавливает метод определения содержания свободного и общего (свободного и связанного) триптофана.

Данный метод не позволяет различить D- и L-стереоизомеры триптофана.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770— 74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4107-78 Реактивы. Бария гидроокись 8-водная. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия ГОСТ 13496.0—80* Комбикорма, сырье. Методы отбора проб ГОСТ 24104—2001“ Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или ожогодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменой без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссыпку.

’ В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 6497-2011. ** В Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

Иэданио официальное

3    Сущность метода

Для определения общего триптофана анализируемую пробу подвергают щелочному гидролизу в насыщенном растворе гидроксида бария и нагревают до температуры 110 °С в течение 20 ч. После гидролиза добавляют внутренний стандарт.

Для определения свободного триптофана экстракцию проводят в мягких кислых условиях в присутствии внутреннего стандарта.

Триптофан и внутренний стандарт в гидролизате или в экстракте определяют с помощью обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентной детекцией.

4    Лабораторное оборудование и посуда

4.1    Хроматограф жидкостный со спектрофлуоресцентным детектором.

4.2    Колонка хроматографическая размерами 125 х 4 мм, с наполнителем С₁₈с размером частиц 3 мкм или эквивалентным.

4.3    рН-метр.

4.4    Колба полипропиленовая вместимостью 125 см³ с широким горлышком и завинчивающейся крышкой.

4.5    Фильтр мембранный с размером пор 0,45 мкм.

4.6    Автоклав, способный поддерживать температуру (110:2)°С и давление {(140:10) кПа (1,4 ±0,1) бар).

При использовании герметично закрывающихся емкостей (см. 4.9) допускается применение сушильного шкафа, поддерживающего температуру (110:2) °С.

4.7    Шейкер механический или мешалка магнитная.

4.8    Вортекс-миксер.

4.9    Емкости герметично закрывающиеся, которые могут использоваться при температуре (110:2) ^еС.

4.10    Колбы мерные 1(2)-50(100. 500. 1000) — 2 по ГОСТ 1770.

4.11    Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью - 0.0001 г.

4.12    Пипетки градуированные 1(2,3. 5)-1(1а. 2. 2а)-1-1(2,5. 10) по ГОСТ 29227.

4.13    Колбы конические Кн-2-250-ТХС по ГОСТ25336.

4.14    Стаканы В(Н)-1(2)-50(1000) ТХС по ГОСТ 25336.

4.15    Сито с размером стороны квадратной ячейки 0.5 мм.

Примочен и о — Допускаотся применение средств измороний. вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов, по качеству не ниже указанных

5    Реактивы

5.1    Вода, дважды дистиллированная или вода эквивалентной чистоты (электропроводность менее 10мкс/см).

5.2    Стандартный образец триптофана (с массовой долей основного вещества не менее 99 %). высушенный в вакууме над пятиокисью фосфора.

5.3    Внутренний стандарт: а-метилтриптофан (с массовой долей основного вещества не менее 99 %), высушенный в вакууме над пятиокисью фосфора.

5.4    Гидроокись бария 8-водная по ГОСТ4107. х. ч.

Примечание — Следует избегать контакта Ва(ОН)г 8Н_гО с воздухом, чтобы исключить образование ВаСОз. который может мешать определению (см. приложение АЗ).

5.5    Натрия гидроокись по ГОСТ4328.

5.6    Кислота ортофосфорная с массовой долей 85 %.

5.7    Кислота соляная по ГОСТ3118. концентрированная. р₂₀= 1,19 г/см³.

5.8    Метанол по ГОСТ 6995. степень чистоты для ВЭЖХ.

5.9    Эфир петролейный, с температурой кипения от 40 °С до 60 °С.

5.10    Кислота уксусная по ГОСТ 61.

5.11    Этаноламин с массовой долей основного вещества более 98 %. ¹

ГОСТ 32201-2013

5.12 1.1.1 -Т рихлор-2-мети л-2-пропанол.

Примечание — Допускается использование реактивов аналогичной или более высокой квалификации. изготовленных по другой нормативной или технической документации, в том числе импортных.

6 Приготовление растворов

6.1    Приготовление раствора натрия гидроокиси молярной концентрации 1 моль/бм²

В мерную колбу вместимостью 1000 см² (см. 4.10) помещают 40.0 г гидроокиси натрия (см. 5.5). растворяют в воде (см. 5.1) и доводят объем раствора в колбе водой до метки.

6.2    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 6 мол ъ1дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см² (см. 4.10) вносят 492 см² соляной кислоты (см. 5.7) и доводят объем раствора в колбе до метки водой (см. 5.1).

6.3    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 1 моль 1дм²

В мерную колбу вместимостью 1000 см² (см. 4.10) вносят 82 см² соляной кислоты (см. 5.7) и доводят объем раствора в колбе до метки водой (см. 5.1).

6.4    Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 молъ/дм²

В мерную колбу вместимостью 1000см² (см. 4.10) вносят 8.2 см² соляной кислоты (см. 5.7) и доводят объем раствора до метки в колбе водой (см. 5.1).

6.5    Приготовление раствора ортофосфорной кислоты молярной концентрации

0,5 моль/бм²

В мерную колбу вместимостью 1000 см² (см. 4.10) помещают 34 см² ортофосфорной кислоты (см. 5.6) и доводят объем раствора в колбе до метки водой (см. 5.1).

6.6    Приготовление концентрированного раствора триптофана массовой концентрации

0,5 мг/см²

В мерную колбу вместимостью 500 см² (см. 4.10) помещают (0,2500 г 0,0001) г стандартного образца триптофана (см. 5.2), добавляют раствор соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм² (см. 6.4) и после растворения доводят объем раствора до метки в колбе этим же раствором соляной кислоты.

Раствор хранят при температуре минус 18 X не более четырех недель.

6.7    Приготовление концентрированного раствора внутреннего стандарта массовой

концентрации 0,54 мг/см²

В мерную колбу вместимостью 500 см² (см. 4.10) помещают (0,2700 ± 0,0001) г внутреннего стандарта (а-метилтриптофана) (см. 5.3), добавляют раствор соляной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм² (см. 6.4) и после растворения этим же раствором соляной кислоты доводят объем раствора в колбе до метки.

Раствор хранят при температуре минус 18 X не более четырех недель.

6.8    Приготовление градуировочного раствора стандарта образца триптофана и

внутреннего стандарта

2,00 см² концентрированного раствора триптофана (см. б.б) и 2,00 см² концентрированного раствора внутреннего стандарта (а-метилтриптофан) (см. 6.7) разбавляют в смеси воды (см. 5.1) с метанолом (см. 5.8) примерно в таком же объеме и концентрации метанола (10 %—30 %)как в готовом гидролизате.

Раствор готовят только перед использованием.

Во время подготовки необходимо защищать раствор от прямых солнечных лучей.

6.9    Приготовление раствора 1,1,1 -трихлор-2-метил-2-пропанол в метаноле

В мерную колбу вместимостью 100 см² (см. 4.10) помещают 1 г 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропа-нол (см. 5.12) и доводят объем раствора в колбе до метки метанолом (см. 5.8).

6.10    Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

В стакан вместимостью 1000 см² (см. 4.14) наливают 900 см² воды (см. 5.1). растворяют в ней

3,00 г уксусной кислоты (см. 5.10) и добавляют 50 см² раствора 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропанола (см. 6.9) Доводят значение pH до 5,00 этаноламином (см. 5.11), переливают раствор в мерную колбу вместимостью 1000 см² (см. 4.10) и доводят объем раствора в колбе до метки водой.

7    Отбор проб

Отбор проб — по ГОСТ 13496.0.

8    Подготовка проб

Пробу тщательно перемешивают и измельчают до прохода через сито (см. 4.15). Перед измельче-нием пробы с высокой влажностью должны быть высушены при температуре не выше 50 °С или лиофи-лизированы. а пробы с высоким содержанием жира — обезжирены петролейным эфиром (см. 5.9).

9    Проведение испытания

9.1    Определение свободного триптофана (экстракция)

На весах (см. 4.11) взвешивают от (1.000 т 0.001) г до (5.000 = 0.001) г пробы, подготовленной в соответствии с разделом 8. и количественно переносят в коническую колбу (см. 4.13).

Добавляют 100 см³соляной кислоты (см. 6.4) и 5.00 см³ концентрированного внутреннего стандарта (см. 6.8). Встряхивают или перемешивают в течение 60 мин с помощью механического шейкера или магнитной мешалки (см. 4.7). Раствору дают отстояться, затем переносят пипеткой (см. 4.12) 10.0 см³ надосадочной жидкости в стакан (см. 4.14). Добавляют 5 см³ ортофосфорной кислоты (см. 5.6) и доводят значение pH до 3.0 ед. pH раствором гидроксида натрия (см. 6.1). Добавляют достаточное количество метанола (см. 5.8). чтобы получить концентрацию от 10 % до 30 % метанола в конечном объеме. Переносят в мерную колбу соответствующей вместимости и разбавляют водой (см. 5. f )д ообъема, необходимого для хроматографии [приблизительно тот же объем, как в градуировочном растворе стандарта (см. 6.8)).

Перед введением в колонку высокоэффективного жидкостного хроматографа несколько кубических сантиметров раствора следует профильтровать через мембранный фильтр (см. 4.5). Хроматографию проводят в соответствии с 9.3.

Стандартные растворы и экстракты необходимо защищать от прямых солнечных лучей. Если полученный экстракт невозможно проанализировать ВЭЖХ в тот же день, его хранят не более трех дней при температуре ниже 5 °С.

9.2    Определение общего триптофана (гидролиз)

В полипропиленовую колбу вместимостью 125 см³ (см. 4.4) помещают от (0.1000 ± 0.0002) г до (1,0000 z 0,0002) г подготовленной пробы. Взятая анализируемая проба должна содержать около 0.0100 г азота.

В колбу добавляют 8,4 г гидроокиси бария (см. 5.4) и 10 см³ воды (см. 5.1). Перемешивают с помощью миксера (см. 4.8) или магнитной мешалки (см. 4.7). магнит которой должен быть покрыт тефлоном. Обмывают стенки сосуда 4 см³ воды (см. 5.1). плотно закрывают крышкой и помещают в автоклав или сушильный шкаф (см. 4.6), прогретый в течение 30—60 мин. Закрывают автоклав или сушильный шкаф и выдерживают пробу при температуре (110 ± 2) °С в течение 20 ч.

Перед открытием автоклава температуру необходимо снизить до 100 °С. Для того чтобы избежать кристаллизации гидроокиси бария, добавляют в теплую смесь 30 см³ воды (см. 5.1) комнатной температуры. встряхивают или осторожно перемешивают. В полученный раствор добавляют 2,00 см³ концентрированного внутреннего стандартного раствора («-метилтриптофан) (см. 6.7). Охлаждают сосуд в воде или на ледяной бане в течение 15 мин.

В охлажденный гидролизат добавляют 5 см³ ортофосфорной кислоты (см. 5.6). На охлаждающей бане нейтрализуют раствор с помощью раствора соляной кислоты молярной концентрации 6 моль/дм³ (см. 6.2) при перемешивании и доводят значение pH до 3.0 ед. pH с помощью раствора соляной кислоты молярной концентрации 1 моль1дм³(см. 6.3). Добавляют метанолдо получения концентрации от 10%до 30 % метанола в конечном объеме. Переносят в мерную колбу соответствующей вместимости и разбавляют водой (см. 5.1) до объема, необходимого для хроматографии (например, 100 см³). При добавлении метанола не должен образовываться осадок.

Перед введением в колонку высокоэффективного жидкостного хроматографа несколько кубических сантиметров раствора следует профильтровать через мембранный фильтр (см. 4.5).

Стандартные растворы и экстракты необходимо защищать от прямых солнечных лучей. Если полученный экстракт невозможно проанализировать ВЭЖХ в тот же день, его следует хранить не более трех дней при температуре ниже 5 °С. ³

ГОСТ 32201-2013

Хроматографию проводят в соответствии с 9.3.

9.3 Хроматография

Рекомендуемые условия для изократического элюирования приведены в таблице 1 .Допускается применение других параметров, приведенных в приложении А (А. 1. А.2), при условии, что поручаемые результаты будут не хуже.

Таблица 1

Наименование параметра Значение и характеристика параметра Хроматографическая колонка См. 4.2 Температура колонки Комнатная температура Подвижная фаза См. 6. 10 Скорость потока 1 си1/мин Общее время работы Около 34 мин Длина волны Возбуждения: 280 нм. эмиссии: 356 нм Объем инжекции 20 мм1

10    Обработка результатов

Содержание триптофана w, %, вычисляют по формуле

А*. sam Ay.eaf 4i.cei ^т

где A._{s cal} — площадь пика внутреннего стандарта в градуировочном стандартном растворе;

А,._у ^ — площадь пика триптофана в экстракте или гидролизате;

V_lry—объем концентрированного раствора триптофана, добавленный в градуировочный стандартный раствор, см³ (2.00 см³);

Сьу — молярная концентрация концентрированного раствора триптофана, добавленного в градуировочный стандартный раствор, г/см³ (2,50 г/см³);

V,<, *am — объем концентрированного раствора внутреннего стандарта, добавленный в экстракт или гидролизат, см³ (5.00 или 2.00 см³ соответственно);

100 — коэффициент пересчета в проценты;

A_{a sam} — площадь пика внутреннего стандарта в экстракте или гидролизате:

А^ са) — площадь пика триптофана в стандартном растворе;

V_ISC4tl — объем концентрированного раствора внутреннего стандарта, добавленный в градуировочный стандартный раствор, см³ (2,00 см³); т — масса анализируемой пробы (с поправкой на первоначальную массу, для сухих и/или обезжиренных образцов), г.

11    Прецизионность

11.1    Межлабораторные испытания

Результаты межлабораторных испытаний прецизионности метода приведены в приложении Б. Значения, полученные в этих межлабораторных испытаниях, не могут быть применимы к диапазонам концентраций и пробам, отличающимся от описанных в настоящем стандарте.

11.2    Повторяемость

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных независимых испытаний, полученными одним и тем же методом на одной испытуемой пробе в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором на одном и том же экземпляре оборудования в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости (г), указанный в таблицах 6.1—6.3. более чем в 5 % случаев. ⁴

ГОСТ 32201-2013

11.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных испытаний, полученными одним и тем же методом на одной испытуемой пробе в разных лабораториях разными операторами на различных экземплярах оборудования, не должно превышать предела воспроизводимости (RJ, указанного в таблицах 6.1— 6.3. более чем в 5 % случаев.

12 Протокол испытания

Протокол испытания должен содержать следующую информацию:

-    всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы:

-    используемый метод отбора проб, если известен;

-    используемый метод определения со ссылкой на настоящий стандарт;

-    все детали испытаний, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как несущественные, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

-    полученный результат испытания или среднеарифметическое значение результатов двух испытаний, если проверена повторяемость. ⁵

1

2

3

4

5