Изменение №1 для ГОСТ 20264.4-89
Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности

С. СЕЛЬСКОЕ И ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО

Группа С09

Изменение № 1 ГОСТ 20264.4-89 Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности

Принято Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 12 от 21.11.97)

Зарегистрировано Техническим секретариатом МГС № 2737

За принятие изменения проголосовали:

Наименование государства Наименование национального органа стандартизации Азербайджанская Республика Азгосстандарт Республика Армения Армгосстандарт Республика Белоруссия Госстандарт Белоруссии Грузия Грузстандарт Киргизская Республика Киргизстандарт Республика Молдова Молдовастандарт Российская Федерация Госстандарт России Республика Таджикистан Т аджикгосстандарт Туркменистан Главная государственная инспекция Туркменистана Республика Узбекистан Узгосстандарт Украина Госстандарт Украины (Продолжение см. с. 52)

Ч3г* 51

(Продолжение изменения N9 1 к ГОСТ 20264.4-89)

Пункт 2.2. Второй абзац. Заменить слова: «по ГОСТ 12083» на «по НД»;

седьмой абзац. Заменить слова: «по ГОСТ 215 с пределами измерения 0—55 °С» на «по ГОСТ 28498 диапазоном измерения 0—100 °С»;

четырнадцатый абзац изложить в новой редакции: «Пипетки 1 — 1—2—0,5; 1 — 1—2—1; 1-2-2-5; 1-2-2-10; 1-2-2-25 по ГОСТ 29227»;

шестнадцатый абзац изложить в новой редакции: «Бюретка 1—1—2—25 по ГОСТ 29251»;

восемнадцатый абзац. Заменить слова: ГОСТ 5072 на НД.

Раздел 3. Наименование изложить в новой редакции:

«3. Определение глюкоамилазной активности (ГлС) глюкозооксидазным методом (арбитражный метод)».

Стандарт дополнить разделом — За:

«За. Определение глюкоамилазной активности (ГлСп) поляриметрическим методом

За.1. Метод основан на определении глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы ферментом глюкоамилазой.

Глюкоамилазная активность характеризует способность ферментного препарата катализировать гидролиз мальтозы с образованием глюкозы и выражается числом единиц активности в грамме (или см³) препарата.

(Продолжение см. с. 53)

52

(Продолжение изменения № 1 к ГОСТ 20264.4-89)

За единицу активности глюкоамилазы принимается способность фермента катализировать при определенных значениях температуры и pH гидролиз 1 мкмоль мальтозы до глюкозы за 1 мин.

За.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г, не ниже 2-го класса точности.

Сахариметр универсальный СУ-3, СУ-4, автоматический СП или автоматические поляриметры А1-ЕПО или А1-ЕПЛ.

Прибор для измерения pH среды в диапазоне 0—14 с погрешностью измерения ±0,1 pH.

Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева (50+0,2) ^вС.

Термометры по ГОСТ 28498 диапазоном измерения 0—100 °С и ценой деления шкалы не более 0,1 ^вС.

Баня водяная.

Стаканчики для взвешивания по ГОСТ 25336.

Колбы типа Кн вместимостью от 100 до 1000 см³ по ГОСТ 25336.

Колбы мерные наливные 1-го или 2-го исполнения вместимостью 100, 200, 250 и 1000 см³ по ГОСТ 1770.

Воронки типа В по ГОСТ 25336.

Пипетки типа 2; 1-го и 2-го исполнения вместимостью от 1 до 25 см³ по ГОСТ 29227 или ГОСТ 29169.

Пробирки П1—21—200, или П1—16—150, или П2—19—180, или П2-16-150 по ГОСТ 25336.

Секундомер по НД.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Мальтоза перекристаллизованная для бактериологических целей по НД.

Раствор буферный ацетатный с pH 4,7, приготовленный по ГОСТ 4919.2.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации 5 моль/дм³.

Цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174.

Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания:

1.    Все реактивы должны быть квалификации ч., х. ч. или ч. д. а.

2.    Допускается использование импортной посуды и приборов с метрологическими характеристиками и реактивов с квалификацией не ниже отечественных.

За.З. Подготовка к анализу

За.3.1. Приготовление раствора мальтозы массовой долей 2 % (субстрат)

(Продолжение см. с. 54)

(Продолжение изменения № 1 к ГОСТ 20264.4-89)

20,00 г перекристаллизованной мальтозы, взятой с учетом влаги, растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см³ в небольшом количестве воды, добавляют 100 см³ ацетатного буферного раствора, доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют. Раствор мальтозы готовят не менее чем за сутки до его использования, чтобы в нем прошла мутарота-ция.

Хранят раствор при температуре 4—6 °С в течение 30 дней. Если при хранении раствор мальтозы помутнеет, пользоваться им не следует.

3а.3.2. Приготовление раствора железистосинеродистого калия массовой долей 15 %

17,65 г калия железистосинеродистого количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, перемешивают до полного растворения соли (в случае необходимости раствор подогревают) и доводят до метки дистиллированной водой.

За.3.3. Приготовление раствора сернокислого цинка массовой долей 30 %

42,85 г сернокислого цинка количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, перемешивают до полного растворения соли (в случае необходимости раствор подогревают) и доводят до метки дистиллированной водой.

3а.3.4. Приготовление раствора соляной кислоты концентрации 5 моль/дм^г

430 см³ соляной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют и доводят объем до метки дистиллированной водой.

За.3.5. Приготовление растворов ферментных препаратов

За.З.5.1. Приготовление основного и рабочего растворов очищенных фер-ментных препаратов

Основной раствор из очищенных ферментных препаратов готовят в соответствии с 2.3.5.

Рабочий раствор готовят из основного, разбавляя его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности.

За.3.5.2. Приготовление основного и рабочего растворов из воздушно-сухой культуры гриба

Основной раствор из воздушно-сухой культуры гриба готовят в соответствии с 2.3.7.

Рабочий раствор готовят из основного, разбавляя его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности.

За.3.5.3. Приготовление раствора из культуральной жидкости

Культуральную жидкость фильтруют через бумажный фильтр (или двойной полотняный мешок), возвращая первые порции обратно, добиваясь получения прозрачного раствора.

От 5 до 20 см³ прозрачного раствора культуральной жидкости помеща-

(Продолжение см. с. 55)

54

(Продолжение изменения N9 1 к ГОСТ 20264,4—89)

ют в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки дистиллированной водой.

За.3.5.4. Приготовление раствора из ультраконцентрата

5 см³ прозрачного ультраконцентрата (после отбора пипетку снаружи отбирают фильтровальной бумагой) количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 или 500 см³, частично заполненную водой. Объем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Все исследуемые растворы глюкоамилазы, приготовленные по 3а.3.5, должны обеспечивать разность угла вращения плоскости поляризации (rij-Ilj) в пределах от 0,5 ° до 2,5 ° нормальной сахарной шкалы.

Если эта разность ниже 0,5 ^в или выше 2,5 *, то основной раствор разбавляют в ту или другую сторону.

За.4. Проведение анализа

Берут две параллельные навески анализируемого продукта и из каждой делают не менее двух разведений. Каждое разведение исследуемого раствора анализируют не менее двух раз.

В две пробирки наливают по 25 см³ раствора мальтозы и ставят в термостат или ультратермостат, или водяную баню температурой (50±0,2) °С на 5—10 мин. Затем к содержимому пробирок приливают по 5 см³ раствора исследуемого ферментного препарата, быстро перемешивают и инкубируют смесь в течение 15 мин при этой же температуре. По истечении указанного времени в пробирки добавляют по 1 см³ раствора соляной кислоты (для прерывания ферментативной реакции) и охлаждают растворы до 20 °С.

Одновременно готовят контрольную пробу. Для этого к 25 см³ раствора мальтозы приливают сначала 1 см³ раствора соляной кислоты, затем 5 см³ исследуемого раствора ферментного препарата.

Если опытные и контрольные растворы получились мутными, их осветляют. Для этого приливают по 1 см³ осветлителей — раствора сернокислого цинка и железистосинеродистого калия.

Содержимое пробирок перемешивают и фильтруют. На сахариметре или автоматическом поляриметре измеряют угол вращения плоскости поляризации опытного и контрольного растворов, используя поляриметрическую трубку (кювету) длиной 200 мм. При использовании автоматического поляриметра показания прибора умножают на коэффициент перевода круговых градусов в градусы нормальной сахарной шкалы, равный 2,8885. Величина ДП при измерении на сахариметре должна находиться в пределах от 0,2 до 2,5 °S; при измерении на автоматическом поляриметре — от 0,6 до 7 °S.

За.5. Обработка результатов

Глюкоамилазную активность ГлСп, ед/г (или ед/см³), вычисляют по формуле

(Продолжение см. с. 56)

(Продолжение изменения № 1 к ГОСТ 20264.4-89)

где — угол вращения плоскости поляризации опытного раствора, °S\

П₂ — угол вращения плоскости поляризации контрольного раствора,

0,00243 — массовая концентрация глюкозы, соответствующая VS, г/см³;

31 — объем инкубационной смеси, см³;

10⁶ — коэффициент перевода г в мкг;

т — масса (объем) препарата в рабочем растворе, г (см³);

15 — время гидролиза, мин;

2 — коэффициент, учитывающий образование из мальтозы двух молекул глюкозы;

180 — молярная масса глюкозы, мкг/мкмоль.

В случае применения осветления конечный результат, вычисленный по формуле (4а), умножают на коэффициент, учитывающий изменение объема инкубационной смеси на 2 см³ за счет осветления, равный 1,06.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок. Результат округляют до второго десятичного знака. Расхождение между каждым измерением и средним арифметическим значением не должно превышать 5 % среднего значения при доверительной вероятности Р = 0,95.

Перевод единиц активности, полученных поляриметрическим методом, в единицы стандартного глюкозооксидазного метода осуществляется в соответствии с приложением А.

Стандарт дополнить приложением — А:

«Приложение А (справочное)

Перевод единиц активности в единицы глюкозооксидазного метода

Для перевода единиц активности, полученных поляриметрическим методом, в единицы глюкозооксидазного метода используется переводной коэффициент К, полученный экспериментальным путем.

1. Для препаратов, полученных при культивировании гриба Asp. awamori, выращенного глубинным способом, К= 1,76 ±0,11; выращенного поверхностным способом -К- 1,51 ± 0,11.

При изменении условий культивирования продуцента глюкоамилазы

(Продолжение см. с. 57)

56

(Продолжение изменения № 1 к ГОСТ20264.4^89)

значение коэффициента следует уточнять. Для контрольных заводских условий уточнение коэффициента проводят путем сравнительного определения активности глюкоамилазы глюкозооксидазным и поляриметрическим методами.

Работу проводят на пяти пробах, полученных при разных ферментациях.

Переводной коэффициент К вычисляют по формуле

(Продолжение см. с. 58)

(Продолжение изменения № 1 к ГОСТ 20264.4-89)

ГлС ГлСп ⁹

где ГлС— глюкоамилазная активность, определенная глюкозооксидазным методом, ед/г;

ГлСп — глюкоамилазная активность, определенная поляриметрическим методом, ед/г».

(ИУС No 8 1998 г.)