Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
Документ устанавливает методику выполнения измерений массовой концентрации суммы летучих нитрозаминов - диметилнитрозамин и диэтилнитрозамина — в пищевых продуктах (мясных и колбасных изделиях, в рыбе и рыбных изделиях, в детском питании на основе мясных, рыбных и мучных продуктов) и продовольственном сырье (в зерне, сыром мясе, рыбе) методом жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором. Методика предназначена для органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор, для научно-исследовательских и других заинтересованных организаций.
1 Область применения
2 Показатели прецизионности методики
3 Средства измерений вспомогательные устройства, реактивы материалы
3.1 Средства измерений
3.2 Вспомогательные устройства и оборудование
3.3 Реактивы и материалы
4 Метод измерения
5 Требования безопасности
6 Требования к квалификации оператора
7 Условия выполнения измерений
8 Подготовка к выполнению измерений
8.1 Подготовка измерительной аппаратуры
8.2 Приготовление растворов
8.3 Установление градуировочной характеристики
8.4 Градуировка хроматографа
8.5 Контроль градуировочных характеристик
8.6 Подготовка анализируемых образцов
9 Проведение анализа
9.1 Выделение НА путем отгонки с водяным паром
9.2 Экстракция НА из дистиллята
10 Результаты анализа
11 Оформление результатов испытаний
12 Проверка приемлемоcти результатов испытаний
13 Проверка стабильности результатов испытаний
Приложение А (обязательное). Схема установки для перегонки с водяным паром для выделения летучих НА из пробы
Дата введения | 01.01.2021 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.01.2019 |
Актуализация | 01.01.2021 |
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
УТВЕРЖДАЮ Заместитель Министра - Елавный государственный санитарный врач ^-Лрслублики Беларусь
„г .
1.И. Римжа
\А\'ч zuo-yr.
^ Ы он н ы и но M ep № jQj-' iQO(,
\%\х 200|г.
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРОЗАМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
инструкция по применению
Учреждение-разработчик: Еосу дарственное Учреждение
«Республиканский научно-практический центр гигиены» Министерства здравоохранения Республики Беларусь
Авторы: Марусич Н.И., Перцовский А.Л., Левошук Н.П., Турко Н.Н., Масалов И.Н.
1 Область применения
Настоящий документ «Методика определения нитрозаминов в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» устанавливает методику выполнения измерений массовой концентрации (далее -концентрация) суммы летучих нитрозаминов (далее - НА) - диметилнитрозамин (далее -ДМНА) и диэтилнитрозамина (далее - ДЭНА) - в пищевых продуктах (мясных и колбасных изделиях, в рыбе и рыбных изделиях, в детском питании на основе мясных, рыбных и мучных продуктов) и продовольственном сырье (в зерне, сыром мясе, рыбе) методом жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором.
Методика предназначена для органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор, для научно-исследовательских и других заинтересованных организаций.
Диметилнитрозамин - маслянистая жидкость, плотность (далее - d18) 1,01, температура кипения 152- 153°С, растворим в воде, этаноле, эфире и других органических растворителях. Структурная формула - (ОДДИ - N=0, молекулярная масса - 74,08.
Диэтилнитрозамин - маслянистая жидкость, d20 0,95, температура кипения -176,9°С, растворим в воде, этаноле, эфире и других органических растворителях. Структурная формула - (Сг^ДДИ - N=0, молекулярная масса - 102,13.
ДМНА и ДЭНА обладают широким спектром токсического действия и могут вызывать опухоли различной локализации.
В соответствии с Санитарными правилами и нормами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» № 11 63 РБ 98, утвержденными постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 2 июля 1998 г. № 22, предельно допустимая концентрация (ПДК) НА в мясе, мясных изделиях, колбасах - не более 0,002 мг/кг, в копченостях - не более 0,004 мг/кг, в рыбе свежей - не более 0,003 мг/кг, в продуктах для детского питания - не допускается при чувствительности метода 0,001 мг/кг, в зерне (пивной солод) - не более 0,015 мг/кг. [1]
Метод основан на выделении НА перегонкой с водяным паром и экстракции органическим растворителем, денитрозировании НА бромистым водородом в уксусной кислоте до соответствующих аминов, синтезе производных полученных аминов с 5-(диметиламино)-нафталин-1-сульфохлоридом (далее - дансилхлоридом), хроматографическом разделении и количественном определении образовавшихся производных на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором.
Чувствительность жидкостного хроматографа с флуоресцентным детектором в анализируемом объеме (20 мкл) - 0,5 нг - для ДМНА, 0,75 нг - для ДЭНА.
Идентификация дансилпроизводных НА производится по временам удерживания, а количественное определение содержания ДМНА и ДЭНА - методом внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта применяется дипропилнитрозамин (далее -ДПНА), который соответствует требованиям, предъявляемым к выбору внутреннего стандарта при количественном анализе методом жидкостной хроматографии и является наиболее приемлемым для надежного результата. [2]
2 Показатели прецизионности методики
Относительные значения показателей прецизионности (повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости) при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ представлены в таблицах 1-2.
2
9 Проведение анализа
9.1 Выделение НА путем отгонки с водяным паром
Навеску 100 г измельченного в мясорубке или измельчителе пищевого продукта (напитков 250 см3 или детского питания) помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 смД соединенную с паровиком и прямым холодильником в соответствии с рисунком приложения 2 настоящей методики. К продукту добавляют 100-150 см3 дистиллированной воды (в зависимости от влажности продукта) и добавляют при помощи пипетки емкостью 1 cmj раствор ДПНА концентрацией 4 mkf/cmj в количестве0,5 см3 и перемешивают. В смесь добавляют 10 г хлорида натрия, 10 г сульфата натрия или магния, 1 г сульфаниловой кислоты, 10 см3 1 н раствора серной кислоты. Все перемешивают, подсоединяют колбу к системе и отгоняют НА с водяным паром, собирая 200-250 cmj дистиллята. Схема прибора для перегонки с водяным паром изображена в приложении А.
9.2 Экстракция НА из дистиллята
200-250 см3 дистиллята, полученного по п.9.1, экстрагируют в делительной воронке хлористым метиленом три раза порциями по 20 см3 в течение 5 мин. Каждую порцию экстракта сливают через воронку с бумажным фильтром, заполненную 5 г безводного сульфата натрия. Фильтр с безводным сульфатом натрия промывают 10 cmj экстрагента. Далее в осушенный экстракт добавляют 2 см3 3%-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, приготовленного по п. 8.2.2., перемешивают и оставляют для процесса денитрозирования не менее чем на 30 минут при комнатной температуре. Упаривают хлористый метилен на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 30°С. Полученный экстракт количественно переносят в фарфоровую чашку, колбу для упаривания омывают 0,5 cmj уксусной кислоты и присоединяют к содержимому фарфоровой чашки. Экстракт осторожно упаривают на песчаной бане при температуре не более 120°С.
Чашку с сухим остатком охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения в фарфоровую чашку добавляют 0,6 cmj буферного раствора и круговыми движениями растворяют сухой остаток. К полученному экстракту добавляют 0,8 см3 раствора дансилхлорида, приготовленного по п. 8.2.1., перемешивают и немедленно переносят смесь в пробирку с притертой пробкой вместимостью 5 см3. Плотно закрытую пробирку помещают в водяную баню с температурой 55°С не менее чем на 40 минут для прохождения процесса получения дансил-производных.
Затем пробирки извлекаются из водяной бани и охлаждаются до комнатной температуры. К полученному раствору добавляют 1 см3 бензола, интенсивно встряхивают в течении 5 минут и оставляют до момента четкого разделения фаз. Из верхнего прозрачного бензольно-ацетонового слоя пипеткой емкостью 2,0 см3 отбирают 1,62 см3 экстракта и переносят в пробирку емкостью 5 см3 с пришлифованной пробкой. Полученный экстракт выдувают в токе воздуха досуха строго в вытяжном шкафу. К полученному сухому остатку добавляют 0,9 см3 подвижной фазы, плотно закрывают и растворяют сухой остаток путем встряхивания.
Дансилпроизводные анализируют на жидкостном хроматографе, записывая хроматограммы не менее 3-х раз.
10 Результаты анализа
Для расчета конечного содержания суммы НА в исследуемом образце замеряют площади пиков дансилпроизводных диметиламина, диэтиламина и дипропиламина в
И
исследуемом образце и в контрольном образце. Рассчитывают содержание, (X мг/кг), суммы НА с использованием внутреннего стандарта по формулам
^вн.ст. Х ^'обр.ДМНА Х ^ отнДМНА
ДМНАобр
- {мкг)
(2)
^вн.ст. Х ^ контр. ДМНА Х ^ отнДМНА
ДМНАконтр.
{мкг)
(3)
вн.ст.контр.
тДМНА — тДМНАобр. 171 ДМНАконтр ■.
твн.ст. Х $обр.ДЭНА Х ^-отнДЭНА , ч
тп^ил^ =-----—- {мкг)
ДЭНАобр
(4)
(5)
вн.ст.оор.
твн.ст. Х ^контр.ДЭНА Х ^ отнДЭНА
ДЭНАконтр.
{мкг)
(6)
вн.ст.контр.
^ ДЭНА ДЭНАобр. ^ ДЭНАконтр.
(7)
X
ДМНА-г ДЭНА
т ДМНА + 171 ДЭНА
{мг / /сг)
(8)
где шдмна; Шдэна - содержание ДМНА и ДЭНА в исследуемом образце, мкг;
S06p.flMHA; S06p. дэна - площади пиков ДМНА и ДЭНА в исследуемом образце, см2; SKOirrp. дмна; Sконтр, дэна - площади пиков ДМНА и ДЭНА в контрольном образце, см-; швн.ст. - масса ДПНА, введенного в образец и контроль и найденная по калибровочному графику ДПНА, мкг;
КОТц дмну дэна - относительный коэффициент отклика для ДМНА и ДЭНА;
Р - навеска, г.
.Расчет содержания (X мг/кг) суммы НА с использованием калибровочных графиков:
1 ДМНАконтр
ДЭНАобр.
1 ДЭНАконтр .
ДМНАрДЭНА
р-к„
(9)
где тдмнл; шдэна - содержание ДМНА и ДЭНА в исследуемом образце и контроле, вычисленное по калибровочным графикам, мкг;
Р - навеска, г.
Кизвл - степень извлечения, найденная по ДПНА (по соотношению содержания внесенного ДПНА и полученного после извлечения)
В случае получения результатов анализа с содержанием ДПНА (внутреннего стандарта) выше внесенной величины, что бывает крайне редко, необходимо провести анализ образца без внесения внутреннего стандарта и рассчитать содержание ДПНА, ориентирзшсь на площади пиков ДМНА и ДЭНА в анализируемой пробе с внесенным ДПНА, т.е. в данном случае контролем за степенью извлечения будут служить пики ДМНА и ДЭНА на обеих хроматограммах и присутствии пика ДПНА на хроматограмме без внесения ДПНА, будет подтверждением его наличия.
12
В случае получения результатов выходящих за пределы максимальной концентрации по калибровочному графику необходимо повторить определение с уменьшенной навеской анализируемого образца.
11 Оформление результатов испытаний
Результаты измерений оформляют по форме, установленной действующей в лаборатории системой регистрации данных.
Результаты должны включать следующую информацию:
- наименование (шифр) пробы;
- дату проведения измерений;
- результаты измерений;
- фамилию оператора.
Гарантированный результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в виде
(X ±U(X)), мг/кг (10)
где X - результат измерений, полученный в соответствии с настоящей методикой и рассчитанный согласно п. 10, по результатам не менее 2-х параллельных исследований одного образца;
U(X) - расширенная неопределенность результата измерений X , мг/кг.
Расширенную неопределенность рассчитывают по формуле
U = кх ис(Х), (11)
где к - коэффициент охвата, равный 2 при доверительной вероятности Р=0,95;
ис (X) - суммарная стандартная неопределенность результата измерений X, мг/кг.
12 Проверка приемлемости результатов испытаний
Проверку приемлемости результатов осуществляют согласно и. 5.2.2.1 СТБ ИСО 5725-6-2002. Два результата испытаний должны быть получены в условиях повторяемости. В процессе внутреннего оперативного контроля проводят контроль стабильности градуировочного графика, определяют соответствие полученных результатов пределам повторяемости и воспроизводимости, нормативу точности.
Контроль стабильности градуировочного графика ДПНА проводится ежедневно с контрольной пробой. Вносится концентрация ДПНА, лежащая в середине концентраций градуировочного графика. Градуировочный график считается стабильным если выполняется условие:
I г -С I
изм зад тг /1 /-\ \
---1 < Кгр, где (12)
^ зад
Сзад - заданное значение концентрации ДПНА в градуировочном растворе, мкг/см3.
СИзм - измеренное значение концентрации ДПНА в контрольной пробе, мкг/см3.
Кгр - норматив контроля градуировочного графика, % получен по пункту 7.1 Отчета
Диапазон измерений, мкг/см3 |
Норматив контроля К^, % |
Urp(X), % |
0,05-0,50 |
18,95 |
8,6 |
0,50-5,00 |
3,38 |
1,6 |
Если абсолютное значение разности гк между двумя результатами испытаний не превышает предел повторяемости гп (таблица 2), то оба результата считаются приемлемыми, и конечный заявляемый результат является их средним арифметическим. гк рассчитывается по формуле:
13
(Стах-Стш)х100
Сср
гк - найденное расхождение между двумя результатами, %;
Стах - максимальный результат определения;
Ce - минимальный результат определения;
Сср - среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.
Если значение гк меньше либо равно гп, то повторяемость параллельных определений признают удовлетворительной и конечный результат является их средним арифметическим значением, при превышении гк значения гп контроль повторяют. При повторном превышении указанного норматива должны быть выяснены и устранены причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля воспроизводимости.
13 Проверка стабильности результатов испытаний.
Стабильность результатов измерений может быть проверена с использованием метода добавок и разведений или с использованием контрольной карты Шухарта в соответствии с СТБ ИСО 5726-6-2002.
При построении контрольной карты используют рабочие пробы с ДМНА, ДЭНА и ДПНА. Содержание ДМНА, ДЭНА, и ДПНА в рабочей пробе соответствует содержанию их в середине диапазона исследований.
Рассчитывают:
центральную линию: d2xar, где d2 =1,128 (коэффициент для расчета центральной линии для п=2);
- границы регулирования: UCL= D2 х <гг,
где D2 = 3,686 (коэффициент для расчета границы регулирования для п=2);
- предупреждающие границы: UCL=D2(2) х а,,
где D2 (2) = 2,834 (коэффициент для расчета предупреждающих границ для п=2); аг - стандартное отклонение повторяемости, мг/кг.
Оценку стандартного отклонения повторяемости sr получают по формуле:
(14)
где w = |Х] - х2 . - размах;
X, и х2 - результаты первого и второго определения, мг/кг;
L - количество проведенных измерений.
Дата |
Наблюдаемые значения |
Размах w |
Описание | |
проведения |
ХщмНАСЦЭНА) |
Х7ДМНА(ДЭНА) | ||
анализа | ||||
Сумма | ||||
Среднее значение |
w/ / di |
Полученные значения заносят в лист данных контрольной карты:
14
Графически по оси X откладываю дату проведения анализа, по оси У - размах w. Также отмечают центральную линию и линии предупреждающей и регулирующей границ.
Если размах w выходит за линии предупреждающей и регулирующей границ, то результаты признаются нестабильными. В этом случае выясняются причины нестабильности и проводятся мероприятия по их устранению.
Методика разработана лабораторией хроматографических исследования, отдела физико-химических исследований ГУ «РНПЦ гигиены» М3 РБ.
Разработчики:
Вед. научный сотрудник лаборатории хроматографических исследований, канд. химических наук
Н.И. Марусич
Ст. научный сотрудник
Н.П. Левошук
Мл. научный сотрудник
И.Н. Масалов
Литература
[1] Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов № 11-63-РБ-98. Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача РБ от 2.07.1998 г. п 22.
[2] Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В., Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. -М.,: Химия, 1986. - 288 с.
[3] СТБ ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. 4.6. Использование значений точности на практике. -Минск: Госстандарт, 2003 - 42 с.
15
Приложение А (Обязательное)
Рисунок А. 1. Схема установки для перегонки из пробы.
1. Паровик;
2. Дистиллированная вода;
3. Круглодонная колба;
4. Гомогенизат исследуемого продукта;
5. Баня с глицерином;
6. Насадка Вюрца;
с водяным паром для выделения летучих НА
7. Трубка на шлифе;
8. Насадка-барбатер;
9. Холодильник Либиха;
10. Аллонж;
11. Приемник.
16
Таблица 1 - Относительные значения показателей повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ при определении ДМНА___ | ||||||||||||||||
|
Таблица 2 - Относительные значения показателей повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ при определении ДЭНА | ||||||||||||||||
|
Относительные значения пределов повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 указаны в таблицах 3-4.
Таблица 3 - Относительные значения пределов повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 при определении ДМНА.___ | ||||||||||||
|
Таблица 4 - Относительные значения пределов повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 при определении ДЭНА____ | ||||||||||||
|
3 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1 Средства измерений
Хроматограф жидкостной с флуоресцентным детектором
Весы аналитические ВЛА-200, второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200г Микрошприц для хроматографа, «Hamilton» 50мкл, цена деления 1 мкл Пипетки 1-1-1-ОД 1-1-1-1 1-1-1-2 1-1-1-5
Колба мерная 11-1-5 (25,100,250,500)-2 Цилиндр мерный на 50, 100, 250 см3 Пробирка со шлифом на 5, 10 см3
3.2 Вспомогательные устройства и оборудование
ТУ 25-11-917-74 ТУ 64-1-423-72 ГОСТ 25336-82 ГОСТ 25336-82
Баня песчаная
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М Баня водяная Воронки ВД-1-500
Воронки конические, стеклянные диаметром 30-33 мм
Колба Кн-1-100(250) - 14/23 (29/32) ТС Колба Кг-50-14/23 ТС Колба К-1-100(250) - 29/32 ТС Мясорубка и измельчитель
Фарфоровые чашки для выпаривания (диаметр 55 мм, объем 20 см3)
УФ-лампа ОКН-11 ТУ 84-1-1618-77
Могут быть использованы другие средства измерений и вспомогательные устройства, по точности, не уступающие рекомендованным в методике.
фирма «Agilent»
№ 990967-902 фирма «Sigma»,
каталожный № N 7756
фирма «Sigma»,
каталожный № N 0756
фирма «Supelko», каталожный № 40061 фирма «Merck» фирма «Merck»
Фирма «Acros»
3.3 Реактивы и материалы
Колонка для жидкостной хроматографии металлическая (250x4,6) Eclipse XDB-C18, 5мкм Диметилнитрозамин, р=1,01 г/см3
Диэтилнитрозамин, р=0,95 t/cmj
Дипропилнитрозамин в метаноле 100 мг Метанол 99,9%
Ацетон ос.ч. Ацетонитрил для ВЭЖХ или сорт 1-3 «Криохром»
4
Кислота бромистоводородная, х.ч. Кислота уксусная, х.ч.
ТУ 6-09-3534-74 ТУ 6-09-1649-87 фирма «Merck» ГОСТ 4166-76 фирма «Sigma»,
Хлористый метилен, о.с.ч.
каталожный № D2625-lr
ГОСТ 4204-77 ГОСТ 4201-79 ГОСТ 4201-79 ГОСТ 5821-78 ГОСТ 5955-75 ГОСТ 4233-77 ГОСТ 6709-72 ТУ-6-09-1678-86
Натрий сернокислый безводный, х.ч. Дансилхлорид, 95%
Кислота серная, х.ч.
Натрия гидроокись, х.ч.
Натрий углекислый кислый, х.ч. Сульфаминовая или сульфаниловая кислота Бензол, х.ч.
Натрий хлористый, х.ч.
Вода дистиллированная Фильтры бумажные, «синяя лента»
Могут быть использованы реактивы и материалы по техническим характеристикам отличающиеся от указанных, но не влияющие на результаты измерения методики.
4 Метод измерения
Измерения результатов исследования образцов содержащих НА производится жидкостной хроматографией с флуориметрическим детектором после следующих этапов подготовки:
перегонка с водяным паром нитрозаминов;
экстракция из водной среды в органический растворитель;
получение аминов - денитрозирование;
удаление органического растворителя и упаривание досуха;
получение дансилпроизводных аминов;
переэкстракция дансилпроизводных из водно-ацетоновой среды в органический растворитель; удаление органического растворителя;
ВЭЖХ.
хроматографирование полученных дансилпроизводных в подвижной фазе на
5 Требования безопасности
Помещение, в котором производится определение НА обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.
Работу с НА следует проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др.).
В лаборатории, где проводится работа с канцерогенными летучими НА необходимо всегда иметь 4% раствор бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте для разрушения НА при попадании их на рабочие места и пол. В целях разрушения летучих НА в воздухе по окончании работы помещение необходимо обработать УФ-светом в течение 30 минут.
Транспортировка и хранение НА осуществляется в стеклянных запаянных ампулах, обернутых в асбестовую ткань и упакованных в металлическую тару, которую также оплавляют парафином.
НА хранят в специальном холодильнике в отсутствие анализируемых проб.
6 Требований к квалификации оператора
К выполнению измерений могут быть допущены лица, имеющие высшее или среднее специальное образование, изучившие требования безопасности и настоящую методику, имеющие опыт работы с ядовитыми веществами и навыки в методах экстракции, концентрирования и получения различных производных.
7 Условия выполнения измерений
Выполнение измерений в лаборатории по настоящей методике осуществляется при следующих условиях:
температура воздуха при приготовлении растворов, в том числе градуировочных (20±2)°С;
температура воздуха при измерении (20±5) °С; атмосферное давление 84,0-106,7 кПа (630-800 мм ртутного столба); влажность воздуха (65±15)% при температуре 25 °С; напряжение питающей сети (220±Ю)В;
частота переменного тока (50±0,5)Гц, что соответствует ГОСТ 15150-69.
Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводятся в условиях, рекомендованных технинеской документацией к прибору и настоящей методикой
8 Подготовка к выполнению измерений
Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб к анализу.
8.1 Подготовка измерительной аппаратуры
Включить жидкостной хроматограф согласно инструкции по эксплуатации. Установить рабочие режимы для колонки и детектора. Для дегазации колбу с элюентом помещают на водяную баню при температуре 40-50 °С, открыв при этом пробку. После охлаждения колбы до комнатной температуры подвижная фаза готова к применению. Элюент должен быть всегда закрыт пробкой и храниться в холодильнике.
8.2 Приготовление растворов
8.2.1 Раствор дансилхлорида с концентрацией 0,5 мг/см3.
Навеску дансилхлорида массой 26,3 мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3 и растворяют в 20 см3 ацетона, доводят до метки ацетоном. Готовый раствор хранят в холодильнике, тщательно предохраняя от попадания влаги. Срок хранения - не более 3 Месяцев.
8.2.2 3%-ный раствор бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте (денитрозирующий раствор).
В коническую колбу вместительностью 100 см3 вносят 5 cmj 30%-ной бромистоводородной кислоты и добавляют 45 см3 ледяной уксусной кислоты. Смесь хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Срок хранения - не более 1 месяца. Признаком непригодности смеси является появление желто-коричневой окраски.
6
8.2.3 Буферный раствор с pH- 10,5.
В мерную колбу вместимостью 500 см3 помещают 3,2 г NaOH и вливают 200 см3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения щелочи, добавляют 20,0 г NaHCC>3. Тщательно перемешивают раствор до полного растворения соли, доводят объем смеси до метки дистиллированной водой. Хранят раствор в полиэтиленовой посуде. Срок хранения - 3 месяца.
8.2.4 Раствор серной кислоты с концентрацией 1н.
В мерную колбу вместимостью 250 см3 помещают 200 cmj дистиллированной воды. Добавляют 6,7 см3 концентрированной серной кислоты (плотностью 1,98 г/см3), перемешивают, охлаждают до комнатной температуры. Доводят объем до метки дистиллированной водой. Срок хранения не ограничен.
8.2.5 Рабочий раствор ДМНА с концентрацией 101 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 20 см3 метилового спирта. Добавляют 10 мм3 ДМНА микропипеткой на 0,1 см3 (концентрацией 1,01 г/см3) и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.
8.2.6 Рабочий раствор ДЭНА с концентр ацией 95 мкг/см3.
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 20 см3 метилового спирта. Добавляют 10 мм3 ДЭНА микропипеткой на 0,1 см3 (концентрацией 0,95 г/см3) и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.
8.2.7 Рабочий раствор ДПНА с концентрацией 400 мкг/ см3.
В мерную колбу вместимостью 250 см3 количественно переносят стандартный образец состава ДПНА с навеской 100 мг, растворяя его в метиловом спирте, и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.
8.2.8 Рабочий раствор ДПНА с концентрацией 4 мкг/см3 (внутренний стандарт).
В мерную колбу вместимостью 100 см3 пипеткой емкостью 1 см3 вносят 1 см3 рабочего раствора ДПНА с концентрацией 400 мкг/см3 добавляют 20 см3 метилового спирта, тщательно перемешивают и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 6 месяцев.
8.2.9 Подвижная фаза для жидкостного хроматографа - смесь ацетонитрил : вода (7:3).
В коническую колбу вместимостью 1000 см3 помещают 700 см3 ацетонитрила. Добавляют 300 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и дегазируют. Для дегазации колбу с элюентом помещают на водяную баню при температуре 40-50 °С, открыв при этом пробку. После охлаждения колбы до комнатной температуры подвижная фаза готова к применению. Элюент должен быть всегда закрыт пробкой и храниться в холодильнике. Срок хранения не ограничен.
7
8.2.10 Хлористый метилен.
Очистку хлористого метилена производят перегонкой с дефлегматором. При этом отбирают не более 80% растворителя от начального объема.
8.2.11 Приготовление градуировочных растворов
8.2.11.1 Приготовление основной смеси ДМНА, ДЭНА и ДПНА с концентрациями компонентов 3,0, 4,5 и 6,0 мкг/ см3 соответственно.
В колбе вместимостью 100 см^ с притертой пробкой смешивают 2,97 см3 раствора ДМНА (95 мкг/^см3), 4,74 см3 ДЭНА (101 мкг/ см3) и 0,60 см^ ДПНА (400 мкг/ смД пипеткой на 5cmj и на 0,1см3. Смесь хранится в посуде из темного стекла в холодильнике (при температуре +4°С) не более 6 месяцев.
8.2.11.2 Выделение НА^ путем отгонки с водяным паром
В колбу для перегонки вместимостью 500 см2 соединенную с паровиком и прямым холодильником в соответствии с рисунком приложения А настоящей методики, поместить 250 см^ дистиллированной воды, добавить 2 см3 стандартной смеси ДМНА, ДЭНА и ДПНА в метаноле пипеткой на 2,0 см3. Содержание НА в водном растворе составляет 6,0, 9,0 и 12,0 мкг соответственно. К смеси добавить 10 г сульфата натрия или сульфата магния, 1 г сульфаминовой кислоты, 10 г хлорида натрия, 10 см3 1 н раствора серной кислоты. Все перемешивают, подсоединяют колбу к системе и отгоняют НА с водяным паром, собирая 250 cmj дистиллята в колбу на 300 см2
8.2.11.3 Экстракция НА из дистиллята
250 см^ дистиллята, полученного по п. 8.2.11.2 помещают в делительную воронку на 500 см2 колбу ополаскивают 20 cmj хлористого метилена, который затем сливают в делительную воронку с экстрактом и производят экстракцию в течении 5 мин. Экстракцию хлористым метиленом повторяют еще дважды порциями по 20 см3 в течение 5 мин. Каждую порцию экстракта сливают через воронку с бумажным фильтром, заполненную 5 г безводного сульфата натрия или сульфата магния в колбу для отгонки на 100 см2 Фильтр с безводным сульфатом натрия промывают 10 см3 экстрагента.
8.2.11.4 Получение дансилпроизводных НА.
В осушенный экстракт добавляют 2 cmj 3%-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, приготовленного по п. 8.2.2., перемешивают и оставляют для процесса денитрозирования не менее чем на 30 минут при комнатной температуре. Упаривают хлористый метилен на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 30°С до приблизительно 2 см3. Полученный экстракт количественно переносят в фарфоровую чашку, колбу для упаривания омывают 0,5 cmj уксусной кислоты и присоединяют к содержимому фарфоровой чашки. Экстракт осторожно упаривают на песчаной бане при температуре не более 120°С.
Чашку с сухим остатком охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения в фарфоровую чашку добавляют 0,6 см3 буферного раствора и круговыми движениями растворяют сухой остаток. К полученному экстракту добавляют 0,8 cmj раствора дансилхлорида, приготовленного по п. 8.2.1., перемешивают и немедленно переносят смесь в пробирку с притертой пробкой вместимостью 5 см2 Плотно закрытую пробирку
помещают в водяную баню с температурой 55°С не менее чем на 40 минут для прохождения процесса получения дансил-производных.
Затем пробирки извлекаются из водяной бани и охлаждаются до комнатной температуры. К полученному раствору добавляют 1 cmj бензола, интенсивно встряхивают в течении 5 минут и оставляют до момента четкого разделения фаз. Из верхнего прозрачного бензольно-ацетонового слоя пипеткой емкостью 2,0 см3 отбирают 1,62 cmj экстракта и переносят в пробирку емкостью 5 см3 с пришлифованной пробкой. Полученный экстракт выдувают в токе воздуха досуха строго в вытяжном шкафу. К полученному сухому остатку добавляют 1,8 см3 подвижной фазы, плотно закрывают и растворяют сухой остаток путем интенсивного встряхивания. Отстоявшийся раствор является основным раствором для приготовления остальных градуировочных растворов (раствор №6).
В таблице 5 представлена схема разведения для получения калибровочных растворов. Калибровочные растворы готовятся в пробирках вместимостью 5 см3 при помощи пипеток емкостью 1 и 2 cmj путем последовательного разведения подвижной фазой.
Таблица 5 - Приготовление калибровочных растворов и содержание в них НА. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Таким образом из раствора № 6 получают раствор № 5 путем смешивания 1,0 cmj основного раствора с 0,5 см3 подвижной фазы, получен раствор общим объемом 1,5 cmj с концентрацией ДМНА, ДЭНА и ДПНА 2,0; 3,0 и 4,0 мкг/мл соответственно.
8.2.11.5 Приготовление контрольной пробы.
Приготовление контрольной пробы или контроль на реактивы проводится с целью определения наличия НА в применяемых реактивах для их вычитания из результатов анализа.
В колбу для перегонки помещают все используемые реактивы (п 8.2.11.2) в 250 см3 дистиллированной воды, добавляют при помощи пипетки емкостью 1 см3 раствор ДПНА концентрацией 4 мкг/см3 в количестве 0,5 см3.
8.3 Установление градуировочной характеристики
Хроматографирование градуировочных растворов и контрольной пробы проводится при следующих условиях:
- жидкостной хроматограф с флуоресцентным детектором;
- колонка из нержавеющей стали (250x4 мм), заполненная сорбентом Eclipse XDB-С18, зернением 5 мкм;
- температура колонки 30 °С;
9
- подвижная фаза - смесь ацетоннитрил-вода в объемном соответствии 7:3, скорость элюирования - 1,2 см7мин;
- длина волны возбуждения - 350 нм;
- эмиссионный фильтр - 530 нм;
- объем вводимой пробы - 20 мкл;
- время удерживания дансилпроизводных устанавливается по калибровочным смесям при подобранных условиях хроматографии.
8.4 Градуировка хроматографа
Приготовленные в соответствии с табл. 3 градуировочные смеси используются для градуировки хроматографа.
При условиях хроматографии, указанных в п. 8.3, записывают не менее трех хроматограмм для каждого из приготовленных растворов и измеряют площади пиков дансилпроизводных диметиламина, диэтиламина и дипропиламина. Определяют среднеарифметическое значение площадей пиков, рассчитанное из площадей хроматограмм.
Численное значение относительных коэффициентов отклика детектора КоХН получают из хроматографических данных градуировочных растворов с известными концентрациями ДМНА, ДЭНА и ДПНА по формуле
К.
ви.ст. i
где mi - масса введенных в хроматограф ДМНА и ДЭНА, мкг;
Si - площади полученных пиков ДМНА и ДЭНА, см2;
SeH ст - площадь внутреннего стандарта - ДПНА, см2;
тен ст - масса введенного внутреннего стандарта - ДПНА, мкг.
Численное значение Котн каждый экспериментатор вычисляет в соответствии с применяемыми приборами, реактивами, установками и его необходимо пересчитывать при изменении любой из перечисленных составляющих.
8.5 Контроль градуировочных характеристик
Контроль градуировочных характеристик осуществляется по внутреннему стандарту, вводимому в контрольную и исследуемую пробу. Площадь вносимого внутреннего стандарта в холостую и исследуемую пробу в одинаковой концентрации не должны отличаться более чем на 10 % от площади, по которой были рассчитаны коэффициенты отклика. Если обнаружится, что результаты сильно отличаются, то необходимо пересчитать коэффициент отклика Котн-
8.6 Подготовка анализируемых образцов
Отбирают не менее 1 кг средней пробы пищевого продукта или продовольственного сырья в соответствии с требованиями СТБ 1036-97 «Продукты пищевые и продовольственное сырье. Методы отбора проб для определения показателей безопасности».
Отобранные образцы можно хранить в морозильной камере при -8--18°С 1-3 суток в зависимости от сроков реализации продукции.
10