Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

21 страница

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

 Скачать PDF

Оглавление

1. Общие положения

2. Приготовление коагглютинирующих морганеллезных, сальмонеллезных и эшерихиозных диагностикумов

3. Отбор и подготовка проб для исследования в реакции коагглютинации

4. Исследование культур в реакции коагглютинации и оценка результатов

5. Способ постановки реакции коагглютинации путем одновременного смешивания несенсибилизированного стафилококкового реагента, специфической агглютинирующей сыворотки и испытуемого материала

Приложение. Рецепты приготовления забуференного физиологического раствора и агара Минка

 
Дата введения01.01.2021
Добавлен в базу01.01.2019
Актуализация01.01.2021

Этот документ находится в:

Организации:

11.10.1999УтвержденДепартамент ветеринарии Минсельхозпрода России13-7-2/1759
РазработанВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ л РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Мвисельхозпрод Россия) /

департамент ветеринарии

107139. Москва. Орликов пср., ш|и Для телеграмм: Москва, 84 н в' Минроссельхозпрод Телекс: 417738 ЛЕН Телефон: 975-58-50

УТВЕРЖДАЮ

1999 г.

Зам. руководителя Департамента гарии Министерства хозяйства и ия РФ

В.В.Селизерстов


II.IQ,99r. N I3-7-2/I759

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями

1. Общие положения

1.1.    Смешанная кишечная инфекция - остропротекающая инфекционная болезнь молодняка разных видов сельскохозяйственных животных, которая имеет полиэтиологическую природу и вызывается двумя-тремя и более видами патогенных энтеробактерий, относящимся к родам Escherichia, Citrobacter, Proteus, Morganella, Klebsiella, Salmonella. Помимо указанных микроорганизмов возбудителями болезни Могут быть также бактерии других родов и семейств - Yersinia, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium и пр. Наряду с бактериальными агентами нередко (особенно на крупных фермах) болезнь обусловливают корона- и ротавирусы.

1.2.    Болезнь возникает в первые дни и недели жизни животных и проявляется чаще в виде энзоотической вспышки , развитию которой способствуют различные факторы, сзязанные с несоблюдением

технологических и ветеринарно-санитарных требований воспроизводства стада, а также нарушением режимов содержания и кормления молодняка.

1.3.    Смешанная кишечная инфекция может протекать в кишечной (энтеритной ) и септической формах. При кишечной форме возбудители болезни локализуются только в желудочно-кишечном тракте и брыжеечных лимфоузлах, регионарных параженным участкам кишечника; при септической форме - в паренхиматозных органах, различных тканях, а также в кишечнике и брыжеечных лимфоузлах. Основными клиническими признаками болезни являются: потеря аппетита, понос, переходящий в профузный, нарастающая слабость, депрессия, учащенное дыхание и сердцебиение, обезвоживание организма (при затяжном течении); нередко наблюдается поражение центральной нервной системы (возбуждение, судороги), иногда пневмония, артриты; температура тела в пределах нормы, в отдельных случаях повышена на 0,5-1 °С, в предагональном состоянии она снижается ниже нормы.

1.4.    Патологоанатомические изменения у погибших животных имеют картину катарального или катарально-геморрагического гастроэнтерита, на слизистой желудка, тонкого отдела кишечника и слепой кишки мо: встречаться язвы, нередко отмечаются множественные точечные, полосчатые и пятнистые кровоизлияния на слизистой желудка, толстого и тонкого отделов кишечника, под капсулой селезенки, эпи- и эндокарде (клапанах); иногда отмечается очаговая катаральная пневмония и отек легких, дистрофия печени; регионарные брыжеечные лимфатические узлы как правило увеличены, отечны, на разрезе розового или красно-вишневого цвета; при вскрытии черепной коробки - гиперемия кровеносных сосудов и отек ткани головного мозга. Указанные изменения могут быть в отдельных или одновременно в нескольких органах.

5.    Определение патогенных свойств культур бактерий

5.1.    Патогенные свойства определяют у культур бактерий, относящихся к родам Proteus, Citrobacter, Klebsiella, а также родам Escherichia и Morganella, не имеющих адгезивные антигены и не типируемых по О-антигену, в биопробе на белых мышах.

5.2.    Для определения патогенных свойств бактерий используют агаровые культуры вышеуказанных микроорганизмов, выделенные из двух внутренних органов и тканей погибших или фекалий больных животных. С каждой из двух культур одного вида бактерий готовят смывы стерильным физиологическим раствором, устанавливают взвесь бактерий в концентрации 1 млрд микробных клеток/см3 (10 единиц по оптическому стандарту мутности), после чего их смешивают в равной пропорции.

5.3.    Взвесями культур каждого вида бактерий заражают по три белые мыши массой 14-15 г внутрибрюшинно в дозе 0,5 млрд микробных клеток. Культуру признают патогенной в случае гибели двух и более мышей в течение трех суток после заражения и относят ее к возбудителю болезни.

5.4.    При выделении культур энтеробактерий, относящихся к одному виду того или иного рода, указанного в п. 1.1, из селезенки, крови сердца, костного, головного мозга (не менее, чем из двух перечисленных органов и тканей) свежего трупа животного патогенные свойства этих культур в биопробе на белых мышах не определяют и их серологическую типизацию не проводят; такие культуры относят к возбудителю болезни.

6.    Учет результатов бактериологического исследования

6.1. Бактериологический диагноз на смешанную кишечную инфекцию молодняка сельскохозяйственных животных устанавливают на основании выделения из патологического материала культур,

принадлежащим к двум и более родам энтеробактерий, указанных в п.1 Л, и относящихся к возбудителям болезни по одному из показателей, изложенных в п.п.4Л,4.2,5.3,5.4.

6.2.    Результаты бактериологического исследования формулируют: «Из присланного патологического материала (указать какого) выделены возбудители смешанной кишечной инфекции (указать какие виды бактерий, талы адгезивных антигенов у энтеропатогенных эшерихий, серогруппу в случае серотипирования культур эшерихий и морганелл)».

6.3.    При необходимости определяют антибиоти-кочувствительность каждого вида выделенной культуры возбудителя кишечной инфекции в соответствии с действующими «Методическими указанию по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных».

6.4.    Общий срок бактериологического исследования патологического материала до 7 суток.

Методические указания разработаны Л.С. Кавруком, С.В. Бритовой, А.Б. Кононенко (ВНИИ ветсанитарии, гигиены и экологии), В.А. Седовым, Л.А. Тарановой (Центральная научно-методическая ветлаборатория Минсельхозпрода РФ).

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу “Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями”, утвержденные ГУВ Министерства сельского хозяйства и продовольствия СССР 12 ноября 1991г.

Приложение,

Рецепты приготовления реактивов, питательных сред и методы определения ферментативных свойств культур бактерий

1.    Глицериновый раствор для консервирования фекалий

Состав: Глицерин нейтральный    -    300 см3

Натрий хлористый    - 5 г

Вода дистиллированная    - 700    см3

Раствор стерилизуют при 1 атм (121 °С) в течение 20 мин или прогревают в водяной бане (100 °С) в течение 30-40 мин.

2.    Среда с мочевиной (по Преусу)

Состав: Бульон Хоттингера шш

мартеновский бульон

- 1000 см3

Агар-агар

- 15 г

Глюкоза

5 г

50% водный раствор мочевины

- 20 см3

0,2% раствор бромтимолблау

12 см3

Приготовление: к стерильному расплавленному агару на бульоне Хоттингера или мартеновском бульоне с pH 6,9-7,0 добавляют глюкозу, растворы мочевины и индикатора бромтимолблау. Расплавленную среду разливают в стерильные пробирки по 5 см3 и стерилизуют однократно текучим паром 20 мин. Перед употреблением среду скашивают. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет.

При расщеплении мочевины среда приобретает синий цвет, при отсутствии расщепления мочевины она окрашивается в желтый цвет.

3. Цитратный агар Симонса

Для определения способности бактерий усваивать цитратно-аммонийные соли используют коммерческую сухую среду, которую

готовят согласно указаниям на этикетке препарата, или агар Симонса, приготовленный на основе жидкой среды Козера.

Состав среды Козера:

Натрий-аммоний фосфорнокислый

-1,5 г

двузамещенный (NaNHj НР04 х 4Н20)

Калий фосфорнокислый

-1 г

однозамещенный (КН2Р04)

Магний сернокислый (MgS04 х 7Н20)

-0,2 г

Натрий лимоннокислый (Na3C$HsC>7 х 5Н20)

- 3 г

Дистиллированная вода

- 1000 см3

Для приготовления агара Симонса к 1дм3 среды

Козера добавляют

20 г агар-агара и 10 см3 индикатора бромтимолблау. Последний готовят из расчета: бромтимолблау 1 г, ОД N раствор NaOH - 25 см3 (для получения указанного раствора к 100 см3 дистиллированной воды добавляют 0,4 г NaOH), дистиллированная вода - 475 см3.

Среду нагревают до полого расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют при 0,5 атм в течение 15 мин. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет. Перед употреблением среду скашивают.

Бактерии, способные усваивать цитратно-аммонийные соли, дают рост на агаре Симонса с изменением его в синий цвет. При отсутствии указанного свойства роста культуры не происходит и цвет среды не изменяется.

4. Среда для определения сероводорода К 1 дм3 расплавленного стерильного 1,7%-ного МПА добавляют 0,2 г сернокислого железа (FeS0ax7H20), 0,3 г серноватистокислого натрия-тиосульфата (Na2S203x5H20), I г лактозы, 12 см3 0,2% водного раствора фенолрота. После размешивания компонентов среду разливают в стерильные пробирки по 6-7 см3 и стерилизуют текучим паром в течение

20 мин. Готовая среда имеет бордово-красный цвет. Перед употреблением среду скашивают так, чтобы она имела столбик размером 2,5-3 см.

Среду засевают агаровой культурой бактерий вначале на скошенную поверхность, а затем уколом в столбик. В случае образования сероводорода среда в столбике окрашивается в черный цвет. При отрицательном результате почернения среды не наступает.

5. Реактивы для обнаружения индола

5.1.    Реактив Эрлиха

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид    -1 г

Спирт этиловый 96°    - 95    см3

Соляная кислота концентрированная - 20 см3

Приготовление и хранение: альдегид растворяют в спирте, затем

добавляют кислоту; хранят реактив в закрытом темном флаконе.

5.2.    Реактив Ковача

Состав: Пара-дим етиламинобензальдегид    - 5    г

Спирт амиловый    - 75    см3

Соляная кислота концентрированная    - 25 см-*

Приготовление и хранение: альдегид растворяют в спирте при нагревании в водяной бане (50-55 °С), после остывания смеси добавляют кислоту; хранят реактив при температуре 4-6 °С.

Применение реактивов: к двухсуточной культуре бактерий в бульоне Хоттингера добавляют 0,5 см3 реактива Эрлиха или Ковача, пробирки встряхивают и через 1-2 мин учитывают результаты. В случае образования индола верхний слой жидкости приобретает красномалиновый цвет, при отрицательной реакции он окрашивается з желтый цвет.

5.3.    Индикаторные бумажки для определения индола

Предварительно готовят следующий реактив:

Пара-диметилами нобензал ьде гид Ортофосфорная кислота концентрированная (Н3Р04)

- 5 г -10 см3

-50 см3

Спирт этиловый 96 0

Полученный реактив переливают в эмалированный металлический кювет, в который помещают кусочки фильтровальной бумаги. Смоченные реактивом бумажки высушивают на воздухе при комнатной температуре, затем нарезают полосками размером 0,7-0,8 хЮ-12 см. Бумажки имеют желтый цвет. Хранят их в банке из темного стекла, закрытой резиновой или корковой пробкой.

Для приготовления индикаторных бумажек можно использовать реактив Эрлиха или Ковача.

Применение: после посева изучаемой культуры бактерий в бульон Хоттингера или МПБ помещают в пробирку полоску индикаторной бумажки, верхний конец которой прижимают ватной пробкой. Нижний конец бумажки должен быть на расстоянии не менее 2-3 см от поверхности среды. Засеянные пробирки инкубируют в термостате в течение двух суток. При наличии индолообразования нижний конец индикаторной бумажки окрашивается в красно-малиновый цвет, при отрицательной реакции цвет бумажки не изменяется.

6. Среда с фенилаланином Для определения способности бактерий дезаминировать фенилаланин используют коммерческую сухую среду, которую готовят по прописи, указанной на этикетке, или среду приготовленную по следующему рецепту:

Дрожжевой экстракт сухой    -    3    г

ДЬ-фенилаланин    -    2    г

(или L-фенилаланин - 1 г)

Натрий фосфорнокислый

двузамещенный (Na2HP04xl2H20)

- 1 г

Натрий хлористый (NaCl)

- 5 г

Агар-агар

-12 г

Вода дистиллированная

- 1000 см3

Компоненты растворяют в воде

при нагревании,

устанавливают, среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 3-4 см3 и стерилизуют при 0,5 атм в течение 15 мин. После стерилизации среду скашивают.

Применение:    к    одно-двухсуточной культуре на среде с

фенилаланином в наклонном положении добавляют 10-12 капель 10% раствора хлорного железа (РеС1зх6Н20). При положительной реакции через 2-3 мин культура окрашивается в зелено-синий или зеленовато-

голубой цвет, при отрицательной реакции цвет культуры не изменяется. 7. Среда Кларка для реакций с метилротом и Фогес-Проскауэра

Состав: Пептон ферментативный Калий фосфорнокислый

- 5 г

двузамещенный (К2НРО^хЗН20)

- 5 г

Глюкоза

- 5 г

Вода дистиллированная

-1000 см3

Приготовление:    после растворения компонентов в воде

устанавливают pH среды 6,9-7,0, затем кипятят ее 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют при 0,5 атм в течение 15 мин.

Применение: для постановки реакции с метилротом из пробирки с двухсуточной культурой бактерий в среде Кларка отсасывают в чистую сухую пробирку 2,5 cmj жидкости, добавляют к ней 8-10 капель индикатора метилрота, пробирку встряхивают, после чего учитывают реакцию. Изменение цвета культуры зависит от величины pH : розовое

окрашивание (при pH ниже 5,0) означает положительную реакцию, желтое окрашивание (при pH выше 6,0) - отрицательную реакцию, светло-оранжевое окрашивание (при pH 5,0-6,0) - сомнительную реакцию.

Состав индикатора метилрота:

Метиловый красный    -0,01 г

Спирт этиловый 96°    -    30    см3

Вода дистиллированная    - 20 см3

Приготовление: навеску краски растворяют в спирте, затем добавляют воду и смесь размешивают. Хранят индикатор в темном месте под притертой пробкой.

Для постановки реакции Фогес-Проскауэра к 2,5 см3 культуры бактерий добавляют вначале 1 см3 6%-ного спиртового раствора cL-нафтола, а затем 0,4 см3 40%-ного водного раствора КОН, пробирку тщательно встряхивают и спустя 3-5 мин учитывают результаты. При наличии в культуре ацетилметилкарбинола она окрашивается в розовый цвет - положительная реакция, окраска культуры в желтый цвет свидетельствует об отрицательной реакции, при сомнительной реакции культура окрашивается в светло-оранжевый цвет.

Состав реактивов для реакции Фогес-Проскауэра:

а)    <^-нафтол (CioHgO)    -    30    г

Спирт этиловый 96°    -    500    см3

б)    Калий гидроокись (КОН)    -    120    г

Бода дистиллированная    -    300    см3

-    Юг

-    Юг

8. Среды для предварительной идентификации культур лактозоотрицательных бактерий

8.1. Среда Олькеницкого Состав: Лактоза Сахароза

Глюкоза

- 1 г

Аммоний-железо (11) сульфат

-0,2 г

(FeSo4 x(NH4)S04 x6H20)

Натрий тиосульфат

-0,3 г

(Na2S203 х5Н20)

Мочевина

- 10 г

Феноловый красный

(0,4% водный раствор)

- 4 см3

Агар питательный сухой

-25 г

Вода дистиллированная

- 1000 см3

Приготовление: компоненты растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды нагретой до температуры 45-50 °С; сухой питательный агар расплавляют в отдельной посуде в остальной части дистиллированной воды при нагревании, затем смешивают растворы солей и расплавленного агара, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2-7,4, после чего добавляют раствор индикатора и тщательно размешивают его; готовую среду разливают в пробирки по 6-7 см3 и стерилизуют текучим паром дробно в течение трех суток ежедневно по 20 мин. Стерильную среду скашивают таким образом, чтобы столбик был не менее 2-2,5 см. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

Применение: для посева используют агаровую культуру бактерий, которую засевают бактериологической петлей вначале на поверхность скошенной части среды (косяка), затем уколом в столбик. Засеянные пробирки инкубируют при 37-38 °С в течение 24-48 часов.

В культурах, ферментирующих только глюкозу, столбик окрашивается в желтый цвет, косяк имеет розовый цвет. В культурах, ферментирующих глюкозу, а также лактозу и сахарозу или только один из последних двух сахаров, столбик и косяк окрашиваются в желтый

цвет. Культуры, расщепляющие мочевину, окрашивают столбик и косяк в красный цвет; при образовании сероводорода столбик (или часть его) приобретает черный цвет. Газообразование устанавливают по наличию трещин и разрывов в столбике среды.

Среда Клиглера

Агар Клиглера готовят из сухой коммерческой среды согласно рецепту, указанному на этикетке.

При отсутствии готовой среды ее приготовляют по следующему

рецепту:    Лактоза    -    10 г

Сахароза    -    10 г

Глюкоза    -    1 г

Железо сернокислое (FeSC>4 х7Н20)    - 0,2 г

Натрий тиосульфат

(Na2S203 х5Н20)    - 0,08    г

Натрий сульфит (Na2S03)    -    0,04    г

Феноловый красный

(0,2% раствор в 50% этиловом спирте    -12 см3

Агар питательный сухой    - 20 г

Вода дистиллированная    - 1000 см3

Порядок и последовательность растворения компонентов среды, величина pH, объем готовой среды в пробирках и режим стерилизации такие же, как и при приготовлении среды Олькеницкого. Готовая среда имеет буровато-красный или оранжево-красный цвет.

Применение:    условия    посева    культур    бактерий,    время

инкубирования пробирок и характер изменений в столбике и на косяке среды аналогичны тем, которые наступают в среде Олькеницкого.

1.5. Диагноз на смешанную кишечную инфекцию в хозяйствах устанавливают на основании совокупности эпизоотологических данных (возраст заболевших животных, массовость поражения, стационарность и др.), клинических признаков болезни, патологоанатомической картины и результатов бактериологического (при необходимости еще и вирусологического) исследования патологического материала от больных или погибших животных.

2. Отбор материала для исследования

2.1.    Для посмертной бактериологической диагностики в

лабораторию направляют 2-4 свежих трупа погибших или убитых с диагностической целью больных животных (желательно не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами). В случае невозможности доставки целого трупа посылают следующий патологический материал:    голову, трубчатую кость, сердце,

перевязанное лигатурой вблизи разреза сосудов и аорты, селезенку, долю печени с желчным пузырем, брыжеечные лимфатические узлы, регионарные воспаленному участку кишечника, а также пораженный отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух концов лигатурой (в отдельной таре или полиэтиленовом пакете). Указанный патологический материал исследуют в день поступления его в лабораторию.

2.2.    Для прижизненной бактериологической диагностики в лабораторию направляют фекалии больных диареей животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Пробы фекалий берут от 5-6 больных животных одной фермы в стерильные пробирки по 2-3 г непосредственно из прямой кишки с помощью прокипяченного резинового катетера. Пробирки вместе с сопроводительной запиской упаковывают в полиэтиленовый пакет или картонную коробку.

Лист ознакомлении с документом

ФИО,

должность

Наименование

подразделения

Дата

ознако

мления

Подпись

Изм.1

Изм.2

Изм.З

Дата

ознаком

ления

/подпись

Дата

ознаком

ления

/подпись

Дата

ознаком

ления

/подпись

У4 <у*¥

Ьш><£рис*1cZ.

&./П/7

Vi

Ь&«- 1лм/

teucfaucb/1#

tft

бы- 'lUc<

4/4

{■]Л- 'lu*

л $ /о* 7

(жс(

При невозможности быстрой доставки проб фекалий в лабораторию (через 3-4 часа после взятия) их консервируют стерильным 30% -ным глицериновым раствором в соотношении 1:2 (см. приложение).

2.3. Пробы фекалий и содержимого тонкого отдела кишечника (в количестве не более 0,5 г) разводят в 10 см 3 стерильного 0,85%-ного раствора хлорида натрия, тщательно размешивают и затем выдерживают 10-15 минут при комнатной температуре для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость используют для посева на питательные среды не позднее 1-2 часов после приготовления взвесей. При исследовании консервированных фекалий, их тщательно размешивают, после чего разводят физиологическим раствором в 5-10 раз.

3. Выделение культур энтеробактерий, изучение их морфологических, культуральных и ферментативных свойств

3.1. Патологический материал (за исключением содержимого тонкого отдела кишечника и фекалий) засевают в пробирки с МПБ и на плотные дифференциально-диагностические среды в чашках: Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-сульфит агар). Содержимое тонкого отдела кишечника и фекалий засевают только на указанные выше плотные среды в чашках. Кроме того для выделения из фекалий сальмонелл неразведенные пробы фекалий засевают еще в одну из сред обогащения (селенитовый бульон, магниевую, Мюллера или др.) в соотношении I : 5.

3.1.1. Посев материала в МПБ проводят пастеровской пипеткой. Посевы на плотные среды в чашках из внутренних органов и тканей, указанных в п.2.3, делают путем отпечатков разрезанной поверхностью кусочка органа из предварительно профламбированного участка на подсушенную питательную среду или вносят материал пастеровской

пипеткой на поверхность среды, а затем оавномерно растирают его стеклянным шпателем.

3.1.2.    Содержимое тонкого отдела кишечника, взятое путем соскоба с пораженного участка слизистой оболочки, суспендируют в 10 см3 стерильного 0,85%-ного раствора хлорида натрия, затем засевают суспензию бактериологической петлей на подсушенные в термостате плотные дифференциально-диагностические среды в чашках широким частым штрихом по всей поверхности среды. Аналогичным образом проводят посев разведенных фекалий.

3.2.    Пробирки с посевами в МПБ из внутренних органов и тканей инкубируют при температуре 37-38 °С в течение 18-24 часов. При наличии в МПБ помутнения среды культуру микроскопируют и в случае обнаружения мелких грамотрицательных палочек пересевают ее на агар Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-сульфит- агар) в чашках, которые помещают в термостат (37-38 0 С ) на 18-24 часа

Пересев культур, полученных в МПБ, на плотные селективные среды проводят в том случае, если отсутствует рост колоний на этих средах в первичных посевах из соответствующих органов и тканей.

3.3.    Чашки с посевами на агаре Эндо (или Левина) из внутренних органов, тканей или фекалий инкубируют при температуре 37-38 0 С в течение 18-24 часов. После просмотра культур пересевают колонии лактозоположительных бактерий (круглые, средних размеров S-формы, красно-малинового цвета на агаре Эндо и темно-фиолетового цвета на агаре Левина с наличием или отсутствием металлического блеска) в чашки с МПА и средой Минка в соответствии с рекомендациями, изложенными в действующих «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных».

При наличии на агаре Эндо (или Левина) роящегося налета, харак-

СУША

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА НА СМЕШАННУЮ КИШЕЧНУЮ ИБ5ЕКЦИЮ


Агар Плоскирева

I

Микроскопия культур (окраска по Граму) - при необходимости


Фекалии

Разведение

Среда

1:20-30

обогащения


Изучение культур согласно методическим указаниям по бактериологияес кой диагностике сальмонеллезов человека и к вотнкх


Агар Эндо или Левина


Агар

Длоскирева


Отбор колоний и их пересев


Отбор колоний и их пересев


МПА


Среда

Минка

Скошен.

МПА

'Г


Скошенный

МПА


Изучение культур согласно методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (эше-рихиоза) животных


Микроскопия культур (окраска по Граму)


Микроскопия культур (окраска по Граму)


Среды для изучения ферментативных свойств культур, скошенный МПА


Биопроба на белых мышах


отрицат.


положит.


J_.

Серологическая идентификация культур_


положит.! отрицат


L


Возбудитель болезни


теплого для протея, пересевают его на скошенный МПА (культуры из двух-трех внутренних органов, тканей или фекалий). Чашки и пробирки с посевами инкубируют 18-20 часов при той же температуре.

3.4.    Чашки с первичными посевами на агаре Плоскирева инкубируют при температуре 37-38 °С в течение 24-36 часов. После просмотра культур пересевают мелкие круглые колонии S-формы полупрозрачные, сероватого цвета с голубым оттенком в пробирки со скошенным МПА (по 1-2 колонии с культур из двух-трех внутренних органов, тканей или фекалий, каждую колонию в отдельную пробирку), которые помещают в термостат на 18-24 часа.

В том случае, если пересев проводят на комбинированную среду (Олькеницкого, Клиглера), то каждую колонию пересевают в одну пробирку с этой средой и в одну пробирку со скошенным МПА.

3.5.    Суточные культуры бактерий на скошенном МПА или комбинированной среде, выделенные из внутренних органов, тканей или фекалий, микроскопируют (окраска по Граму) и при наличии в мазках однородных мелких грамотрицательных палочек, не образующих спор и капсул (бактерии вида Klebsiella pneumoniae образуют капсулу), используют для изучения ферментативных, патогенных, антигенных свойств, а также (при необходимости) определения подвижности в полужидком МПА. Для выявления у культур клебснелл капсулы окраску мазков проводят по методу Гинса (тушью).

3.6.    Ферментативные свойства изучают у 2-6 агаровых (в порядке исключения у бульонных) культур бактерий, выделенных из одного патологического материала, на наборе сред с углеводами и индикатором Андреде или полужидких средах с индикатором ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на средах с мочевиной, сернокислым железом (определение сероводорода), агаре

Симонса, в бульоне Хоттингера или МПБ (определение индола), мясо-пептонной желатине, среде с фенилаланином.

При использовании комбинированной среды Олькеницкого или Клиглера учитывают изменения, вызываемые представителями разных родов энтеробактерий в этой среде, после чего данную культуру изучают по другим необходимым биохимическим тестам.

Засеянные пробирки инкубируют при температуре 37-38 °С.

Предварительные результаты изучения ферментативных свойств культур учитывают через 24 часа, окончательные результаты - через 48 часов. Изучение ферментативных свойств культур энтеробактерий можно проводить также с помощью тест-системы для биохимической идентификации энтеробактерий. Родовую и видовую принадлежность культур устанавливают по показателям таблицы.

Следует учитывать, что у бактерий рода Proteus встречаются нероящиеся штаммы, образующие при росте на плотных питательных средах мелкие круглые колонии S-формы сероватого цвета. Важными признаками родовой идентификации таких штаммов является их способность дезаминировать фенилаланин и разжижать желатин.

При наличии у культур отклонений от основных показателей таблицы используют дополнительные тесты: реакции с метилротом и Фогес-Проскауэра, наличия образования оксидазы, определение подвижности и др.

4. Серологическая идентификация культур бактерий 4.1. Серологическую идентификацию культур эшерихий и сальмонелл проводят в соответствии с действующими “Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных” и “Методическими указаниями по лабораторной диагностике сальмонеллезов человека и животных, обнаружению сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды”.

Дифференциальные признаки энтеробактерий по ферментативным свойствам

1 *•!

Т е с т ы

Р О д ы

И ВИДЫ БАКТЕРИЙ

Esc

heri

chia

coli

Citrobactcr

Kntcrobactcr

Klebsiella

pneumo

niae

Salmonella (подрод 1)

Proteus

M organella morg-anii

Yersinia cntcroco-litica («• 22-25°C)

freu-

ndii

J

divc-

rsus

•erog-

CIICS

cloacae

vulg

aris

Mira-

bills

M)XO-

faci-

CIIS

О снов и ы с

1

Глюкоза

+

+

+

+

+

•f

+

+

+

+ 00

2

Лактоза

ih

+

-

-

-

-

-

-

3

Сахароза

±

±

±

+

A

+

-

+

±

+

-

+

4

Маннит

+

+

+

+

+

+

+ ,

-

-

-

-

+

5

Мальтоза

±

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

6

Рост на агаре Симонса

-

+

+

+

+

+

<±>

±

+

±

-

-

7

Образование индола

-

+

-

-

±

+

-

-

+

±

8

Образование сероводорода

+

-

-

-

-

A

+

+

-

-

-

9

Расщепление мочевины

-

±

+

-

+

+

+

+

+

+

+

10

Разжижение желатины

-

-

-

±

-(+)

-

-

+

+

+

-

-

11

Дезаминирование

фенилаланина

*

*

*

+

+

+

+

*

| о и о л н и т е л в и м е

I

Реакция с метилротом

+

+

±

+

+

+

+

+

2

Реакция Фогес-11роскауэра

-

-

-

+

+

±

-

-

i

+

+

3

Подвижность

±

+

-

_l±l_

+

+

+

... J*?

+

Обозначения: «+» - ферментация сахара (КГ), образование индола, расщепление мочевины и т.д.

«-» - отсутствие ферментации сахара, образования индола, расщепления мочевины и т.д. «±» - различные показатели

«(-)» - отдельные штаммы нс вызывают ферментации сахара, образования индола и т.д. «(+)»- замедленное разжижение желатины

Культуры названных бактерий относят к возбудителям болезни на основании показателей, указанных в этих методических указаниях.

4.2.    Для серотипирования культур морганелл, выделенных из патологического материала, применяют набор нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых сывороток. Серологическую типизацию культур осуществляют в соответствии с наставлением по применению указанных сывороток, утвержденным Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 28.04.1997 г. При выделении культур морганелл патогенной серологической группы их относят к возбудителям болезни и у таких культур патогенные свойства в биопробе на белых мышах не определяют.

4.3.    Ускоренное обнаружение эпизоотических штаммов морганелл в

первичных смешанных культурах, полученных после посева патологического материала на среду Плоскирева, с одновременной серологической типизацией их осуществляют в реакции нейтрализации антител (РНАт) в соответствии с “Методическими указаниями по ускоренной индикации эпизоотических штаммов морганелл в реакции нейтрализации антител”, утвержденными Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 24.03.1999 г. Для постановки РНАт применяют набор агглютинирующих морганеллезных серогрупповых сывороток, указанный в п.4.2, и набор морганеллезных эритроцитарных диагностикумов, которые используют в соответствии с “Наставлением по применению набора диагностикумов    морганеллезных

эритроцитарных”, утвержденному Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 24.03.1999 г. При обнаружении в реакции нейтрализации антител эпизоотических штаммов морганелл серогрупп 01, 016, 026, 029, 033, 045, 049, “13” выделение чистых культур данных бактерий и изучение их морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств не проводят.