Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

14 страниц

191.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Руководящий документ предназначен для инженерно-технических и научных работников предприятий (организаций) Миннефтепрома, занимающихся проблемами защиты нефтепромыслового оборудования и коммуникаций от микробиологической коррозии.

Оглавление

1 Общие положения

2 Оборудование и материалы

3 Подготовка стерилизация питательных сред, добавок и посуды

4 Культивирование адгезированных сульфатвосстанавливающих бактерий

 5 Оценка бактерицидного действия реагентов

Показать даты введения Admin

Страница 1

МЖИСТЕРСТВО НЕФТЯНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

внииспт

НЕФТЬ

ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИДНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕАГЕНТОВ

ОТНОСИТЕЛЬНО АДГЕЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИИ ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЯХ

РД 39 - 0147103 - 350 - 89

г. Уфа

Страница 2

Министерство нефтяной промышленности ВНШЛГГ нефть

УТВЕРШН

начальником Главного научно-технического управления Довжком Е.М.

9 марта 1989г.

РУКОВОДЯЩИЙ ДОКЛЕИТ

ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИДНО!! ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕАГЕНТОВ 0ТН0СИТЕШ0 АДГЕЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК СУДЬФАТВДССТАНАВЛИВАЩКХ БАКТЕРИЙ ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЯХ

РД 39-0147103-350-89

Страница 3

Руководящей документ "Оценка бактерицидной вф&екткввости реагентов относительно адгезированных клеток сульфатвосстанав-ливаюцих бактерий при лабораторных могштаниях" разработан ВНКИ-СПТнефть при учаотия ОКЦ Башкирского научного центра УрО АН СССР. Исполнители:

от ВНИИСПТнефть - с.н.с.Мурзагильдия З.Г., м.н.с.Юдина Е.Г., м.н.о.Сабирова А.Х.;

от ОЩ Башкирского научного центра УрО АН СССР - вод.научи. сотр.Кмагужкн М.С.

Страница 4

руководда ДОКУМЕНТ

Оценка бактерицидной эффективности реагентов относительно адгеэированных клеток сульфатвосстанавливащих бактерий при лабораторных испытаниях

РД 39-0147103-350-89

Вводится впервые

Срок введения установлен с I мая 1989г.

Настоящий руководящий документ предназначен для инженерно-технических и научных работников предприятий (организаций) Миннефтепрома, занимающихся проблемами защиты нефтепромыслового оборудования и коммуникация от микробиологической коррозии.

I. оецие подоакниа

I.I. Значительная часть коррозионных повреждений нефтепромыслового оборудования и коммуникаций обусловлена жизнедеятельностью микробных сообществ, формирующихся в условиях нефтяного месторождения. Среди микроорганизмов, инициирующих процесс разрушения металла, главная роль принадлежит сульфатросстанавливающим бактериям (СВБ). При этом большая часть СВБ, содержащаяся в нефтепромысловых водах, адгеэирована на твердой поверхности и лишь небольшое количество представлено свободно-плавающими (планктон-:гыми) клетками. Адгезия бактериальных клеток на поверхности осуществляется с помощью продуцируемых ими внеклеточных биополиморов - полисахаридов, которые играют роль барьера, предохраняющего клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, е том число и бактерицидов. Бактерициды оказывают избирательное действие на клетки бактерий. Как правило, адгезировшсные СВБ бо-

Страница 5

4

лее устойчивы к их действии, чем планктонные клетки.

Следовательно, для оценки реальной эффективности бактерицидов необходимы исследования как на планктонных, так и на адгеэи-рованных клетках СВБ.

1.2.    Данная методика разработана для скрининга реагентов относительно адгезированных на металлической поверхности СВБ d лабораторных условиях.

1.3.    Сущность метода заключается в следующем: образцы из малоуглеродистой стали выдерживают в актирной культуре СЗБ.

Затем их обрабатывают бактерицидом и асептически переносят в культуральные сосуды с питательной средой и определяют минимальную летальную концентрацию реагента. Испытания проводятся в статических условиях.

2. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

2.Х. Для работы с адгезированными на металлической поверхности сульфатвосстанавливающими бактериями необходимо следующее оборудование:

автоклав электрический

- по ГОСТ 9586-75Е

термостат суховоздушный

ТС-80М-2

- по ТУ 64-1-1382-83

икаф сушильный лаборатор

ный

- по ТУ 16-531.097-67

диспергатор ультразвуковой

- по ТУ 25-05.2170-77

приспособление для закру

чивания алюминиевых кол

пачков

-

аптрицы медицинские, емкостью 1,2 мл, с набором инъекцион

ных игл

ГОСТ 22967-82Е ГОСТ 25377-82Е

Страница 6

5

пипетки

колбы плоскодонные склянки пенициллинорые с плоскими резинорыми пробками пробирки химические стерилизатор медицинский пробки резиновые спиртовки

спирт этиловый ректификованный технический рН-метр-милливольтметр типа рН-673Ы

-    по ГОСТ 20292-74Е

-    по ГОСТ 25336-82Е

-    по ГОСТ 25336-82Е

-    по ГОСТ I9569-60E

-    по ГОСТ 7852-76

-    по ГОСТ 25336-82Е

ГОСТ 18300-87

- ГОСТ 15150-69

бумага индикаторная универсальная

алюминиевые колпачки образцы плоские диаметром 10 мм (f) ■ 2 мм) из малоуглеродистой стали 3 камера с ламинарным течением воздуха типа УО-БГ или УНБК-1 - ТУ 46-22-562-80 2.2. Для обнаружения СВБ и поддержания культуры с целью сохранения жизнеспособности клеток, а также таксономических свойств бактерий используется среда Постгейта В: основная среда калий фосфорнокислый

однозамещеннь-й HHgP04-0,5 г -по ГОСТ 4198-75 аммоний хлористый - I г    -    по    ГОСТ    3773-72

кальций сернокислый - 1,0 г

Са$04

- по ГОСТ 3210-77

Страница 7

e

магния сернокислый 7-водный Му$04.7Н20 - 2,0 г натрий молочнокислый CgHgO^/Za -3,5 г

натрий хлористый А'вСР - 5 г Добавки:

дрожжевой экстракт(5% водный экстракт)- I г железо сернокислое эакисное 7-водное ^ei>04.7H20 - 0,5 г натрий углекислый кислый /ГаНСО» натрий сернистый .1    ,9Н20    -    0,2 г - по ГОСТ 2053-77

В качестве восстановителей для питательных сред ыожно использовать сульфид натрия, аскорбиновую кислоту и другие.

Все реактивы основной среды растворяют в I л водопроводной воды. Добавки готовят каждую в отдельности.

2.3. Для накопления клеток СВБ в лабораторной практике для исследовательских целей используется среда Постгейта С!

-    по ГОСТ 4523-77

-    ТУ 6-09-3664-74

-    по ГОСТ 4233-77

-    по ТУ 6-09-3979-75

-    по ГОСТ 4148-78

-    по ГОСТ 4201-79

калий фосфорнокислый одноэаме-

щенный КН^РО^ - 0,5 г

- по ГОСТ 4198-75

еыыоний хлористый //Н4С* - I г

- по ГОСТ 3773-72

натрий сернокислый A'bgS 04 - 4,5 г

- по ГОСТ 6053-77

кальций хлористый 6-водный

СаС£2.6Н20 - 0,06 г

- по ГОСТ 4209-77

магний сернокислый 7-водный

UQ&04.7Н20 - 0,06 г

- по ГОСТ 4523-77

натрий молочнокислый С^О^Л а - 6 г

- по ТУ 6-09-3664-74

натрий лимоннокислый С^Н^О^Уа -

0,3 г

- по ГОСТ 22280-76

дрожжевой экстракт - 0,1 г

- по ТУ 6-09-3979-75

Страница 8

- по ГОСТ 4I4S-78

7

релезо сернокислое - 7-водное - 0,004 г

дистиллированная вода - I л

хлористый натрий    по    мере надобности

3. ПОДГОТОВКА И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ДОБАВОК И ПОСУЛЫ

3.1.    Приготовление добавок

Навеску дрожжевого экстракта, растворенную в дистиллированной воде, тщательно перемешивают, кипятят 20 кин и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат вновь кипятят 20 кин и фильтруют череэ мелхопористыЯ бумажный фильтр.

Белезо сернокислое гакдсное готовят в виде 5 % раотвора в 2 % растворе соляной кислоты.

Натрий углекислый кислый - 5 % водный раствор, который используют для установления pH среды до 7,2.

Натрий сернистый - 5 % раствор в 5 % растворе натрия углекислого кислого, хранится в холодильнике, после стерилизации используется не более 7 дней.

3.2.    Стерилизацию питательных сред, добавок и других материалов проводят насыщенны}.! водяным паром при давлении выше атмосферного в специально предназначенных для этого автоклавах.

Питательную среду и добавки разливают в колбы не выше чем на половину объема колбы и закрывают ватными пробками и бумажными колпачками. Стерилизацию основной сред:: проводят в автоклаве при температуре 120* 2 °С, избыточном давлении 0,1 МПа, а добавок г при давлении 0,05 МПа. Время стерилизации 30 мин.

3.3.    После отерилиаахш основной раствор питательной ореды обескислооожявают кипячением о последующим быстрым охлаждением под

Страница 9

8

струей водопроводной воды. Затем в той же последовательности, которая указана в п.2.2., вносятся добавки.

3.4.    Величину pH среды контролируют с помощью pH-метра или по универсальной индикаторной бумаге. Раствор сульфида натрия приливает по каплям стерильной пипеткой до появления темно-серой окраски среде. Разлив сред и добавок проводят с соблюдением правил стерильности над пламенем спиртовки.

3.5.    Установка автоклава и работа с ним производится при строгом выполнении правил, указанных в прилагаемой к аппарату инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица.

Простерилиэованные автоклавированием среды проверяют на стерильность путем термостатирования в течение суток при температуре 30 °С. Если среда сохраняет прозрачность, считают, что она стерильна.

Хранят среды в холодильнике. Срок хранения не более 2-х недель.

3.6.    Всю посуду перед стерилизацией тщательно моют и высушивают .

3.7.    Колбы, пробирки и пенициллиновые склянки закрывают ватными пробками и заворачивают в бумагу.

3.8.    Цробки готовят из медицинской ваты, обертывают слоем, марли и завязывают ниткой на свободном конце.

3.9.    В концы пипеток вставляют ватные тампоны и заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4-5 см.

3.10.    Резиновые пробки моют горячей водой с добавлением соды, затем тщательно промывают водопроводной к дистиллированной водой, помещают р термостойкие стаканы с водой и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и избыточном давлении 0,1 Ш*.

3.IX. Подготовленную посуду стерилизуют сухим паром в сушильном шкафу при 160 °С в течение 2 часов с момента достижения

Страница 10

9

указанной температуры.

3.12. Простерклизозанную посуду вынимаю? из сусального шка-фа после ого охлаждения ниже 60 °С.

4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АДП2КР0ВЛКШХ СУЛЬФАТВОССГАНАВЛИВАЩИХ БАКТЕРИИ

4.1.    Металлические образцы тщательно обезжиривают, промывают водой, опускаю? ко 5 мин в раствор соляной кислоты 1:1, снова промывают водой и затем обрабатывают ?0 % раствором этанола.

4.2.    Подготовленные образцы помещают на дно стерильного сосуда, вносят питательную среду Постгейта и накопительную культуру СЗБ (2-3 суточную) в количестве 5-10 % от объема среды, закрывают пробкой и помещают в термостат (температура 32-35 °С).

4.3.    Период инкубации длится 5-7 дней до достижения статических условий роста адгезированных СВБ. Рост СВБ определяется количественно во время всего периода инкубации.

4.4.    Количественная оценка адгезированных СЗБ производится методом предельных разведений после предварительного удаления клеток с поверхности металлических образцов. Результаты представляются как количество клеток на единицу площади - кл/см^.

4.5.    Удаление адгезированных клеток (биопленки) о поверхности образцов осуществляется следующим образом:

ооразец помещают в стерильную часку Петри и, придерживая пинцетом, очищают его поверхность небольшими кусочками (—1 см^) стерильной губки типа "Эффект", загрязненные кусочки гуоки помещают во флакон со средой Постгейта; или образец помещают в стерильную чашку Петри (или фарфоровую чашку) с питательной средой и, при-дорживая его пинцетом, делают ооскоб стерильным скальпелем. Полученный соскоб переносят в пенициллиновый флакон.

Страница 11

10

Затем для диспергирования биопленки флакон энергично встряхивают в течение (ЗО-СО)с или подвергают ультразвуковой обработке на диспергаторе (22 хГц, 0,3-0,4 А, 30-€0 с). При этом клетки СЗБ сохраняют сэою жизнеспособность. Из приготовленной суспензия делают 7-9 разведений. Пробы инкубируют з течение 14 дной при температуре 32-35 °С.

5. ОЦЕНКА ШТЕР’/ЗДКОГС ДЕЙСТ&И РЕАГЕНТОВ

5.1.    Б ряд маркированных стерильных пробирок известного

о

объема (20-25 су ) вводят определенное количество исследуемого реагента (например, 100,200...500 ыг/ды3 и т.п.) и наливают предварительно прокипяченную и охлажденную минерализованную воду.

Состав соответствует сточкой воде месторождения, где предполагается дальнейиее испытание реагента.

5.2.    ОСразцы со сформировавшейся кг них окопленкой достают из сосуда стсрилыам пинцетом к промывают их стерильным буферных! растворо?л (pH = 7,0-7,2) 3-4 раза для удаления культуральной сродн и планктонных клеток СВ5.

1ая сохранения асептических условий эту и псследуядие операции рекомендуется выполнять в хаиеро с ламинарным течением воздуха или ь струе инертного (стерильного) газа, например, гелия.

5.3.    Образцы с адгезироваккыми хло?ка.\гл СВБ помечают в пробирки с бактерицидом и закрывают пробиргх пробкой. Пробы выдерживают лрк коьпштнсР. тэмпоратуро от I до 24 часов, для выбора более оптимальных параметров технологического режима время выдержки

и концентрации исследуемого бактерицида варьируют.

5.4.    Затем обработанные бактерицидом образцы с адгесирован-ними клетками помещают в пробирки с питательной средой Постгейта у. инкубируют в термесгате в течение 14 суток при температуре 32-35 °С. fee пробирки с образцами без добавления реагента служат контрольной пробой.

Страница 12

II

Лая каждой концентрации проводят три параллельных испытания.

5.5.    Наблюдение за образцами осуществляют визуально» отмечая развитие СВБ по образованию черного осадка сульфида железа, распространяющегося от образца вверх по объему питательной среды. Отсутствие роста СВБ свидетельствует об эффективности действия бактерицида.

5.6.    С целью определения эффективности действия бактерицидов на одгеаированяне клетки бактерий можно рекомендовать ноличоотпоп-ное выявление жизнеопособных СВБ в биопленке методом предельных разведений. Для этого адгезированные клетки СВБ после воздействия на них бактерицида удаляют о поверхности образцов (п.4.5), готовят суспензию клеток и делают ряд разведений. Затем пенициллиновые флаконы о пробами помещают в термоотат при температуре 33 °С и наблюдают зе развитием бактерий по образованию осадка сульфида яелеза. Отсутствие роста СВБ свидетельствует об эффективности дейотвия бактерицида.

Страница 13

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

1.Общие положения    3

2.Оборудование и материалы    4

3. Подготовка и стерилизация питательных

сред,добавок а посуды    7

4. Культивирование адгезироваинкх суль£атвос-

станавливаюг’ях бактерия    9

5.Оценка бактерицидного действия реагентов Ю

Страница 14

РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ

ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИДНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕАГЕНТОВ ОТНОСИТЕЛЬНО АДГЕЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК СУЛЬФАТ-ВОССТЛНАВЛИВАШЯ БАКТЕРИЯ ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЯХ

РД 39-0147103-350-89

450055, Г.Уфе,проол.Октября,144/3

Полпхсвно к печати 12.04.69г.

Формат 60x90/16. 0,6 уч.-иэд.л. Tipax 136 вха.

_уФШ t iJA,_

Ротапринт акиСПТнефти