Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

61 страница

407.00 ₽

Купить МУ 1.2.2634-10 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Документ устанавливает требования к проведению тестирования безопасности наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения на компонентах нормального микробиоценоза толстой кишки с изучением их микробиологических и молекулярно-генетических показателей.

  Скачать PDF

Оглавление

I. Введение

II. Область применения

III. Общие положения

IV. Метод оценки безопасности наноматериалов на нормальной микрофлоре кишечника в условиях in vivo

4.1 Принцип метода

4.2 Стандартные образцы наноматериалов

4.3 Лабораторные животные, их содержание и рацион

4.4 Методика введения тестируемого образца

4.5 Отбор проб

4.6 Средства измерений

4.7 Материалы, лабораторная посуда и реактивы

4.8 Методика проведения анализа

4.8.1 Приготовление суспензии фекалий (содержимого слепой кишки) животных

4.8.2 Проведение количественного посева

4.8.3 Учет результатов количественного посева

4.9 Исследование функциональной активности популяций микрофлоры

4.9.1 Оценка функциональной активности популяции бифидобактерий, выделенных из фекалий мышей или содержимого слепой кишки крыс

4.9.2 Дополнительные характеристики защитных представителей микрофлоры

4.10 Обработка полученных данных

4.11 Оформление результата

4.12 Интерпретация результата

V. Метод оценки безопасности наноматериалов по изменению активности фермента дегидрогеназы штамма бактерий Ecoli

5.1 Принцип метода

5.2 Характеристика тест-объекта

5.3 Оборудование, средства измерения, материалы, реактивы, используемые при биотестировании

5.3.1 Оборудование и средства измерения

5.3.2 Реактивы

5.4 Условия и процедура биотестирования

5.5 Обработка и интерпретация результатов испытаний

VI. Метод оценки безопасности наноматериалов с помощью люминесцентного бактериального теста

6.1 Принцип метода

6.2 Характеристика тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"

6.3 Оборудование, материалы, реактивы

6.4 Правила безопасного проведения работ

6.5 Подготовка к проведению измерений

6.5.1 Подготовка посуды для хранения проб и биотестирования

6.5.2 Подготовка проб

6.6 Процедура биотестирования

6.6.1 Оценка общей токсичности исследуемого наноматериалы

6.6.2 Определение токсикологических параметров пробы, ЕС20 и ЕС50

6.7 Обработка, интерпретация и оформление результатов

6.8 Контроль качества токсикологического анализа

6.9 Обработка данных и представление результатов анализа

VII. Количественный метод оценки безопасности наноматериалов при помощи ростовых микробиологических тестов

7.1 Принцип метода

7.2 Характеристика используемых микроорганизмов и тест-систем

7.3 Приборы и оборудование

7.4 Материалы и реактивы

7.5 Методика введения тестируемого образца

7.6 Методика проведения анализа

7.7 Обработка и интерпретация данных

7.8 Представление результата

VIII. Оценка мутагенной активности наноматериалов в тесте Эймса

8.1 Принцип метода

8.2 Лабораторные штаммы

8.3 Приборы и оборудование

8.4 Материалы и оборудование

8.5 Приготовление препарата для метаболической активации

8.6 Дозы тестируемого наноматериала

8.7 Методика проведения анализа

8.8 Обработка результатов

8.9 Представление и интерпретация результатов

Приложение 1. Список использованных сокращений

Приложение 2. Термины и определения

Приложение 3. Нормативные ссылки

Показать даты введения Admin

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза

Методические указания МУ 1.2.2634-10

Издание официальное

Москва • 2010

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза

Методические указания МУ 1.2.2634-10

МУ 1.2.2634-10

ма проведения исследования, описание методов статистической обработки результатов, результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой, и комментариев к ним, обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы.

3.5.2. Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

3.6.    Система обеспечения качества исследований по определению безопасности наноматериалов на модельных биологических тест-системах.

3.6.1.    Контроль за качеством проведения исследований по определению безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника включает в себя оформление перечня исследований, проводимых в организации, с указанием для каждого исследования руководителя и заказчика, названия определяемого наноматериала, даты начала и состояния каждого исследования на текущий момент времени, оценку протоколов и методов исследования на соответствие правилам лабораторной практики, мониторинг текущих исследований, отчет о проведенных проверках и рекомендации по устранению недостатков.

3.6.2.    Для осуществления контроля качества руководитель организации, проводящей тестирование безопасности наноматериалов по огношению к нормальной микрофлоре кишечника, назначает, в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики, ответственных лиц за мониторинг исследования из числа сотрудников, не участвующих в исследовании.

3.7.    Стандартные операционные процедуры.

3.7.1.    Стандартные операционные процедуры разрабатываются организацией, проводящей исследования безопасности нано-материалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, на все производственные операции, включая: поступление, идентификацию, маркировку, отбор, обработку проб, использование и хранение исследуемых проб, хранение и аттестацию стандартов; обслуживание и калибровку измерительных приборов и оборудования; ведение тест-систем и их поддержание в функциональном состоянии; приготовление реактивов, ведение записей, отчетов и их хранение; обслуживание помещений; обезвреживание или утилизацию наноматериалов, содержащих их образцов (если это необходимо) и использованных компонентов тест-систем, осуществление программы по обеспечению качества, и утверждаются руководителем организации.

3.7.2.    Соблюдение стандартных операционных процедур осуществляется в целях обеспечения безопасности исследова-

10

МУ 1.2.2634-10

ния, качества, достоверности и воспроизводимости его результатов.

3.7.3.    Отклонения от стандартных операционных процедур должны быть документально оформлены и согласованы с руководителем исследования.

3.7.4.    Организация, проводящая исследование по определению безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, обязана:

•    иметь утвержденный порядок приема и учета поступления анализируемых проб и стандартов наноматериалов;

•    проводить учет анализируемых проб и стандартов наноматериалов при поступлении, расходовании, возврате заказчику или их утилизации;

•    принимать меры по обеспечению идентификации исследуемых веществ (указание на этикетке названия, химической формулы, номера серии, даты выпуска, условий хранения и сроков годности) и их стабильности на протяжении всего исследования. Для образцов наномагериалов на этикетке дополнительно должны указываться степень дисперсности, размер, форма частиц, при необходимости, удельная площадь поверхности и кристаллическая структура.

3.8. Меры конфиденциальности.

3.8.1.    Сотрудники, принимающие участие в проведении исследований безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе исследования, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.8.2.    Организация, проводящая исследования по определению безопасности наноматериалов, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

IV. Метод оценки безопасности наноматериалов на

нормальной микрофлоре кишечника в условиях in vivo

4Л. Принцип метода

Оценку влияния наноматериалов на нормальную микрофлору кишечника в условиях ш vivo проводят на основании изучения видового состава и количественных уровней основных микробных популяций микробиоценоза кишечника, их функциональной активности путем посевов фекальных масс или содержимого толстого кишечника лабораторных животных, которым внутрижелудоч-

11

МУ 1.2.2634-10

но вводят образцы наноматериалов, при сравнении с животными, которым вводят традиционный аналог наноматериала, и с контрольными животными. В качестве групп сравнения (контроль) используют животных, которым вводят дистиллированную воду или среду - носитель наноматериала.

Проводят изучение не менее 4-х групп и родов защитных популяций микрофлоры (лактобактерии, бифидобактерии, бактероиды, лактозоферментирующие энтеробактерии) и 5-ти групп и родов транзиторных (условно-патогенных) представителей микробиоты (энтеробактерии, стафилококки, энтерококки, дрожжевые и дрожжеподобные грибы, споровые анаэробы и др.) на соответствующих дифференциально-диагностических и селективных средах.

Количественный учет бифидобактерий проводят на тиоглико-левой среде или среде Блаурокка; лактобацилл — на среде МРС; энтеробактерий - на среде Эндо и нитратном агаре. Содержание стафилококков определяют на желточно-солевом агаре и среде Байрд-Паркера; стрептококков — на кровяном агаре; энтерококков — на среде МИС; количество сульфитредуцируюших клостри-дий - на железосульфитной среде; дрожжей — на среде Сабуро; плесневых грибов - на среде Сабуро или Чапека.

У штаммов энтеробактерий, стафилококков проводят определение таксономической принадлежности до уровня вида с использованием системы мультимикротестов API для биохимической идентификации, производства фирмы «Bio Merieux» (Api 10S, Api 20E, Api RapiD 20E, Api Staph), и/или классических методов исследования.

Содержание определенных групп, родов, видов микроорганизмов (плотность популяций) выражают в десятичном логарифме числа колониеобразующих единиц на I г сырой массы фекалий или кишечного содержимого (lg КОЕ/г).

Помимо количественных характеристик определяют наличие факторов патогенности, таких как гемолитическая активность энтеробактерий, стафилококков, энтерококков, лецитиназная и коа-гулазная активность стафилококков, способность к образованию хламидоспор и псевдомицелия дрожжеподобными грибами.

Определение функциональных свойств (антагонистической активности) популяций бифидобактерий, выделенных из кишечника лабораторных животных, проводят по степени их кислотообразующей активности в среде культивирования.

Полученные значения подвергают статистической обработке с помошью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Мана-Уитни. Различие между опытной и контрольными группами признаются достоверными на уровне значимости

12

МУ 1.2.2634—10

Р < 0,05. Расчеты проводят с помощью пакетов программ EXCEL и SPSS.

4.2. Стандартные образцы наноматериалов

При калибровке метода используются стандартные образцы из банка стандартных образцов наноматериалов.

4.3. Лабораторные животные, их содержание и рацион

Тестирование выполняют на мышах-самцах инбредной линии Balb/C с исходной массой 20—22 г или крысах-самцах линии Ви-стар с исходной массой тела 150—160 г, в соответствии со специально разработанным дизайном эксперимента. После семи (для мышей) или десяти (для крыс) дней адаптации на рационе вивария у животных контролируют массу тела и определяют динамику прироста массы тела. Особей, отстающих в приросте массы тела, удаляют.

Животных делят на группы, количество которых определяется количеством тестируемых видов и доз наноматериалов + 1 контрольная группа. Оптимальное число животных в каждой группе составляет 10 особей, но не менее 6. В зависимости от количества вводимых доз наноматериалов формируют следующие группы животных (по 6—10 особей в каждой): животных опытных групп подвергают воздействию тестируемого наноматериала, животных групп сравнения - воздействию его традиционного аналога, животные контрольной группы получают плацебо - среду, в которой был диспергирован наноматериал (в общем случае — дистиллированную воду).

В течение всего периода эксперимента животные получают стандартные рационы, согласно МУ 1.2.2520—09 «Токсикологогигиеническая оценка безопасности наноматериалов».

Ежедневно контролируют состояние животных, поедаемость корма; еженедельно - поведение, состояние шерстного покрова, наличие/отсутствие диареи, прирост массы тела.

Для исключения влияния на микрофлору кишечника неспецифических факторов, связанных со стрессом животных, все животные подвергаются тем же манипуляциям, что и животные, получающие наноматериалы.

4.4. Методика введения тестируемого образца

Образцы наноматериалов вводят ежедневно однократно вну-трижелудочно через зонд, снабженный гладкой оливой диаметром, не более 2 мм, в виде дисперсии в дистиллированной воде. При приготовлении дисперсии тестируемых наноматериалов необходимо применять физические методы диспергирования (перемешивание, встряхивание, ультразвуковая обработка). Примене-

13

ние органических растворителей и детергентов не допускается. В порядке исключения допустимо введение наноматериалов на носителе, биологическая инертность которого подтверждена в дополнительных контрольных тестах.

Дистиллированную воду животным контрольной группы вводят внутрижелудочно в том же объёме, в котором вводятся наноматериалы опытным группам.

Тестируемые дозы вводимого наноматериала устанавливаются на основе сведений о возможности экспонирования человека данным наноматериалом с учётом 10-кратного коэффициента запаса.

Продолжительность введения наноматериалов составляет не менее 20 дней.

4.5. Отбор проб

По окончании введения тестируемых наноматериалов животных подвергают эвтаназии одним из разрешённых для этого способов (приказ М3 СССР № 755).

Мышей после усыпления эфиром подвергают вскрытию и проводят отбор фекальных масс из содержимого их толстого кишечника в стерильную одноразовую посуду.

Крыс после усыпления эфиром подвергают вскрытию, в процессе вскрытия выделяют слепую кишку, помещают в стерильную одноразовую посуду и в условиях асептики отбирают её содержимое в бакпечатку для исследования микрофлоры.

Образцы хранят не более 3 ч при (4 ± 2) °С.

4.6. Средства измерений и оборудование

Термостат, поддерживающий рабочую

температуру в интервале от (25 ± 1) до

(45 ± 1)°С    ТУ    64-1-1382-72

или других моделей, с аналогичными

характеристиками

Морозильная камера, обеспечивающая температуру (-20) °С или ниже

Ламинарный шкаф марки ЛШ1 фирмы «Biokom» или аналогичный

Центрифуги со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин для пробирок вместимостью 15 и 1,5 см3

Встряхиватель вибрационный типа «Вортекс» со скоростью вращения до 3 000 об./мин

МУ 1.2.2634-10


Холодильник бытовой электрический



Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвеши


вания 200 г

Мембранные установки для получения деионизованной воды



ОСТ 11-029.003-80


Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH ± 0,01 ГОСТ 27987-88

Дозаторы с переменным объёмом


дозирования


ТУ 9452-002-33189998-2002


или аналогичные:

0,2—2,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, с точностью + 1,2 %;

2.0— 20,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, с точностью ± 0,8 %;

1.0— 10,0 см3 с шагом 0,10 см3, с точностью ± 0,5 %\

0,5—10,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, с точностью ± 0,8 %;

20.0— 200,0 мм3 с шагом 0,10 мм3, с точностью ± 0,6 %\

100.0— 1 000,0 мм3 с шагом 1,00 мм3, с точностью ± 3,0 %

Пробирки стерильные типа «Эппен-дорф», объемом 1,5 см* или аналогичные

Пробирки стерильные с крышкой «Costar*, вместимостью 15 см* или аналогичные

Наконечники пластиковые, объемом 1—200 мм*

Наконечники пластиковые, объемом 200—1 000 мм*

Ножницы медицинские    ГОСТ    21239—89

Анаэробные контейнеры с оборудованием для генерирования анаэробной атмосферы, включая систему для проверки анаэробных условий


15


МУ 1.2.2634—10

Дистиллятор    ГОСТ 6709-72

Микроскоп биологический, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением 900—1000х с иммерсионной системой или с приспособлением для фазово-контрастного микроскопи-рования

Облучатель бактерицидный

настенный ОБН-150    ТУ 16-535-8

или аналогичный

Стерилизатор суховоздушный для температурного режима (160 ± 0,5) °С

Стерилизатор паровой

медицинский    ГОСТ 19569-89

или аналогичный

Петля бактериологическая платиноиридиевая или никель-хромовая, диаметром 3 мм

Петля бактериологическая полимерная, объемом 1, 10 мм3

Пинцет медицинский    ГОСТ    21241—89

Скальпель хирургический, 15 см    ГОСТ 21240-89

Спиртовки лабораторные

стеклянные    ГОСТ    23932—90

Термоконтейнер (сумка-холодильник)

Отраслевой стандартный образец мутности на 5 и 10 ЕД мутности

или стандарт МакФарланда    ОСО    42-28-85-04П

4.7. Материалы, лабораторная посуда и реактивы

Бумага фильтровальная

лабораторная    ГОСТ    12026—76

Вата медицинская гигроскопическая    ГОСТ 5556-81

Марля медицинская    ГОСТ 9412-93

16

МУ 1.2.2634-10


Индикаторы анаэробной атмосферы

Мешки полимерные для стерилизации и деструкции лабораторных принадлежностей

Перчатки резиновые или

пластиковые    ГОСТ    3—88

Колбы плоскодонные конические разной вместимости

Цилиндры стеклянные мерные лабораторные, вместимостью 25, 100, 1000 см5

Воронки стеклянные

Флакон-диспенсер для дозирования жидкостей

Флаконы с резьбой и крышкой стерилизуемые, объемом 500-1000 см3

Пипетки градуированные Палочки стеклянные

Стекла предметные для микропрепаратов    ГОСТ    9284—75

Стекла предметные для микропрепаратов    ГОСТ    6672—75

Стекла часовые

Шпатели бактериологические

Чашки Петри, диаметр 90 или 100 мм

Штативы для пробирок

Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90

Пробирки типов П1, П2    ГОСТ    25336—82

Флаконы стерильные, объемом 100 и 200 см' «Costar» или аналогичные

17


Бакпечатки стерильные однократного применения

ТУ 64-2-279-79

Питательная среда для контроля стерильности(тиогликолевая)

ФСП 42-0010-4456-03 или

ТУ 9398-040-7895326-2007

Питательная среда для культивирования и выделения бифидобактерий

(Бифидум-среда)    ТУ 9398-041-7895326—2007

Среда МРС агаризованная, соответствующая требованиям    ГОСТ 10444.11-89,

Среда Эндо

ГОСТ 51331-99,

РУ ФСЗ 2007/00435,

SMDP, АРНА

ТУ 9229-072-00419785,

ТУ 9398-027-7895326-2007

Цитратный агар Симмонса, питательная среда № 14 ГРМ

Кровяной агар, трипказо-соевый агар с 5 %-й бараньей кровью

ФС 42-3623-98,

ТУ 9398-014-7895326-2006, ТУ 9229-072-00419785

Трехсахарный железистый агар (TS1, среда № 13)

ТУ 9398-013-7895326-2006

Молочно-ингибиторная среда (МИС), питательная среда для выделения энтерококков, соответствующая требованиям

ГОСТ 28566-90.

ФСП 42-0504-7787-06

Среда Сабуро агаризованнная, питательная среда № 2 ГРМ (Сабуро), среда для определения дрожжей и плесеней

ФС 42-3729-99,

ФСП 42-0504-0813-04,

ТУ 9229-014-00419789-95, ТУ 9398-098-7895326-2008

Среда Чапека, соответствующая требованиям

ГОСТ 10444.12-88

Агар Байрд-Паркера, соответствующая требованиям 18

ГОСТ 10444.2-94

МУ 1.2.2634—10

1676РУ М3 РФ №2003/1663, IS06888—1983,

РУ ФС 6888-2—1999

Среда для определения S. aureus (желточно-солевой агар)

ГОСТ 10444.11-89,

ТУ 9229-013-00419789-95, РУ ФС №2006/1176,

ISO 7937

ТУ 9229-072-00419785-97

Железосульфитная среда, соответствующая требованиям

Среда Клиглсра Кровяной агар

Фосфатно-тиогликолевый буфер (калия дигидрофосфат 4,5 г, натрия гидрофосфат 6,0 г, агар-агар 1,0 г, тиогликолевая кислота 0,4 см* на 1 ООО см3 воды дистиллированной)

Красители для окрашиванию по Грамму

Неомицин-агар (КАБ) для определения бактероидов (10 г пептона,

3.0    г NaCI, 2,0 г Na2HP04 х 2Н20,

3.0    г мясо-пептонного бульона,

4.0    г дрожжевого экстракта, 6,0 г декстрозы, 1,0 см3 твин-80, 20,0 г агар-агара, доводят дистиллированной водой до I 000 см3, затем добаатяют 250 мг цистина,

80 мг неомицина, 200 мгдезокси-холата натрия, 30 см3 крови, pH готовой среды 7,2)

Биотест для контроля паровой стерилизации

Индикаторы термовременные для контроля паровой и воздушной стерилизации

Биотест для контроля суховоздуш-нойстерилизации

Агар микробиологический

19

ББК 51.2 М59

М59 Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза: Методические указания. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010,—59 с.

ISBN 978-5-7508-0948-6

1.    Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере зашиты прав

потребителей и благополучия человека (Г Г. Онишенко); Учреждением Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт питания» РАМН (В. А. Тутельян, И. В. Гмошинский, С. А. Хотим-ченко, С А. Шевелева, Н. Р. Ефимочкина, И. В. Аксенов, Е. А. Арманова, В. В. Бессонов, В, М. Верников, М. М. Гаппаров, Р. В. Распопов, А. А. Шумакова, В. В. Смирнова, О. Н.Тананова, О. И. Передеряев, Г. Г. Кузнецова, С. Ю. Батищева); ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (И. А. Дятлов,

B.    П. Холоденко, В. А. Чугунов, Е. Н. Кобзев, И. А. Ирхина, В. Б. Родин, И. И. Мартовецкая, Е. В. Тимошинова, Н. В Александрова); Учреждением Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика Н.Ф. Гамалеи» РАМН (А Л. Гинцбург, Б. С Народицкий, М. М. Шма-ров, Д. Ю. Логунов, Л. Н. Нестеренко, Н. А. Зигангирова, Ю. М. Романова, А. Ф Мороз, М. В Мезенцева, Д. В Шебляков, И Л. Тутыхина, Л. В. Черенова, А. И Тухватулин, И. Ю. Грибова); Учреждением Российской академии наук «Центр «Биоинженерия» РАН (К. Г Скрябин, О. А. Зсйналов, Н. В. Равин, С. П. Комбарова); Учреждением Российской Академии наук «Институт биохимии им. А Н. Баха* РАН (В. О. Попов, Б. Б. Дзантиев, А. В. Жердев, Н. В. Голуб); ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (С А. Кононогов,

C.    С. Голубев); ООО «Интерлаб» (А. Н. Веденин. Г В. Казыдуб).

2.    Разработаны в рамках реализации Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2010 годы».

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г Онишенко 24 мая 2010 г.

4.    Введены в действие с 24 мая 2010 г

5.    Введены впервые.

ББК 51.2

© Роспотребнадзор, 2010

© Федеральный центр гигиены

и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010

МУ 1.2.2634-10 Ацетон

Бриллиантовый зеленый Бромкрезол пурпурный Бромтимоловый синий Водорода перекись Хлороформ

Экстракт дрожжевой сухой

Яйца куриные пищевые

Натрий хлористый

Спирт этиловый ректификованный

Масло иммерсионное для микроскопии



ГОСТ 10929-76

ТУ 2631 -001 -29483781 -2004




Вода дистиллированная

Набор реактивов для окраски по Грамму

Тест-системы для биохимической идентификации энтеробактерий API 10S, API 20Е, API Rapid 20E,

Enterotube или аналогичные

Мультимикротесты для биохимической идентификации стафилококков API Staph., производства фирмы «Biomerieux*, Франция

Дезинфицирующий раствор типа «Жавель Сол ид», «Виркон»,

«Самаровка» или аналогичные

Неомицина сульфат

Допускается использование других реактивов и материалов аналогичного назначения, разрешенные к применению в установленном порядке и с характеристиками, обеспечивающими проведение исследований в соответствии с данными методическими указаниями.

На питательные среды и биологические препараты импортного производства должен иметься сертификат системы качества изготовителя по ИСО 9000 или EN 29000.

МУ 1.2.2634—10

Содержание

I.    Введение....................................5

II.    Область применения.............................6

III.    Общие положения..............................7

IV    Метод оценки безопасности наноматериалов

на нормальной микрофлоре кишечника в условиях    in vivo......11

4.1.    Принцип метода...........................11

4.2.    Стандартные образцы наноматериалов..............13

4.3.    Лабораторные животные, их содержание и рацион.......13

4.4.    Методика введения тестируемого образца............13

4.5.    Отбор проб..............................14

4.6.    Средства измерений и оборудование...............14

4.7.    Материалы, лабораторная посуда и реактивы..........16

4.8.    Методика проведения анализа...................21

4.8.1.    Приготовление суспензии фекалий (содержимого

слепой кишки) животных..................21

4.8.2.    Проведение количественного посева...........21

4.8.3.    Учет результатов количественного посева........24

4.9.    Исследования функциональной активности популяций

микрофлоры.............................24

4.9.1.    Оценка функциональной активности популяции бифидобактерий, выделенных из фекалий мышей

или содержимого слепой кишки крыс..........24

4.9.2.    Дополнительные характеристики защитных

представителей микрофлоры................26

4.10.    Обработка полученных данных..................26

4.11.    Оформление результата.......................26

4.12.    Интерпретация результата.....................28

V    Метод оценки безопасности наноматериалов по изменению активности фермента дегидрогеназы штамма бактерий Е. coli ... 29

5.1.    Принцип метода...........................29

5.2.    Характеристика тест-объекта....................29

5.3.    Оборудование, средства измерения, материалы, реактивы,

используемые при биотестировании...............29

5.3.1.    Оборудование и средства измерения...........29

5.3.2.    Реактивы............................30

5.4.    Условия и процедура биотестирования..............30

5.5.    Обработка и интерпретация результатов испытаний......31

VI. Метод оценки безопасности наноматериалов с помощью

люминесцентного бактериального теста................31

6.1. Принцип метода...........................31

3

МУ 1.2.2634-10

6.2.    Характеристика тест-объекта «Эколюм*

и прибора «Биотоке-10».......................32

6.3.    Оборудование, материалы, реактивы...............33

6.4.    Правила безопасного проведения работ.............34

6.5.    Подготовка к проведению измерений..............35

6.5.1.    Подготовка посуды для хранения проб

и биотестирования......................35

6.5.2.    Подготовка проб.......................35

6.6.    Процедура биотестирования....................36

6.6.1.    Оценка обшей токсичности исследуемого

наноматериала........................36

6.6.2.    Определение токсикологических параметров

пробы, ЕС20 и ЕС50.....................37

6.7.    Обработка, интерпретация и оформление    результатов . . . . 38

6.8.    Контроль качества токсикологического анализа........39

6.9.    Обработка данных и представление результатов анализа . . . 39

VII.    Количественный метод оценки безопасности наноматериалов

при помощи ростовых микробиологических тестов..........40

7.1.    Принцип метода...........................40

7.2.    Характеристика используемых микроорганизмов

и тест-систем.............................40

7.3.    Приборы и оборудование......................41

7.4.    Материалы и реактивы.......................42

7.5.    Методика введения тестируемого образца............42

7.6.    Методика проведения анализа...................42

7 7.    Обработка и интерпретация данных...............43

7.8.    Представление результата......................47

VIII.    Оценка мутагенной активности нпноматериалов в тесте Эймса . . 47

8.1.    Принцип метода...........................47

8.2.    Лабораторные штаммы.......................47

8.3.    Приборы и оборудование......................48

8.4.    Материалы и реактивы.......................49

8.5.    Приготовление препарата для метаболической активации . .50

8.6.    Дозы тестируемого наноматериала................50

8.7.    Методика проведения анализа...................51

8.8.    Обработка результатов........................53

8.9.    Представление и интерпретация результатов..........53

Приложение 1. Список использованных сокращений..........56

Приложение 2. Термины и определения..................56

Приложение 3. Нормативные ссылки....................58

МУ 1.2.2634-10

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

24 мая 2010 г.

Дата введения: с момента утверждения

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза

Методические указания МУ 1.2.2634-10

I. Введение

В течение ближайших лет ожидается резкое увеличение объёмов производства во всём мире, вт. ч. в Российской Федерации, искусственных наноматериалов, в частности таких, как наночастицы оксидов кремния, титана, цинка, железа, церия, алюминия, металлические наночастицы железа, меди, кобальта, никеля, алюминия, серебра, золота, углеродные нанотрубки, фуллерены, наночастицы биополимеров и рекомбинантных вирусов. Это с неизбежностью приведёт к поступлению значительных количеств наноматериалов в окружающую среду, их накоплению в компонентах биоты и абиотических средах с последующей возможной передачей человеку.

Создание комплексной системы безопасности в процессе исследований, освоения, производства, обращения и утилизации наноматериалов в Российской Федерации требует наличия методов, позволяющих всесторонне тестировать безопасность искусственных наноматериалов и нанотехнологической продукции для широкого спектра биологических объектов. В качестве важной «мишени» воздействия наночастиц, специфически обусловленного их малыми размерами и высокоразвитой межфазной поверхностью, в настоящее время рассматриваются компоненте! микробиоценоза. Воздей-

МУ 1.2.2634—10

ствие наноматериалов на отдельных представителей нормальной и патологической микрофлоры толстой кишки человека может про-являться в селективной ингибиции или, напротив, усилении роста отдельных её представителей, что может вызвать дисбиотические нарушения, приводящие к развитию разнообразных негативных последствий для организма, включая угнетение функции иммунитета, патологию желудочно-кишечного тракта. Возможное мутагенное действие, которое наночастицы способны оказывать на микроорганизмы, входящие в состав нормального микробиоценоза, может приводить к появлению новых патогенных и условно-патогенных штаммов, обладающих потенциально непредсказуемыми свойствами и влиянием на макроорганизм хозяина.

Настоящие методические указания разработаны в целях внедрения единого, научно обоснованного, количественного подхода к оценке безопасности искусственных наноматериалов на основе изучения их воздействия на нормальные и транзиторные компоненты микробиоценоза толстой кишки лабораторных животных в условиях естественного (физиологического) перорального пути введения наноматериала, атакже выявления у наноматериаловспо-собности индуцировать мутагененез (в молекулярно-генетическом тесте на модельных штаммах микроорганизмов) и приобретать гены трансмиссивной антибиотикоустойчивости. Результаты проводимых тестов должны входить как неотъемлемая часть в систему оценки безопасности новых наноматериалов входе их разработки, регистрации, производства, оборота, использования и утилизации в Российской Федерации.

II. Область применения

2.1.    Настоящие методические указания устанавливают требования к проведению тестирования безопасности наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения на компонентах нормального микробиоценоза толстой кишки с изучением их микробиологических и молекулярно-генетических показателей.

2.2.    Требования, изложенные в настоящих методических указаниях, применяются в ходе установления безопасности наноматериалов на стадиях их производства, оборота, использования и утилизации в Российской Федерации в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с данными процессами.

2.3.    Методические указания разработаны с целью обеспечения единства измерений и адаптации имеющихся методов и средств измерений в ходе оценки безопасности наноматериалов искусственного происхождения.

2.4.    Методические указания предназначены для специалистов органов Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав ио-6

МУ 1.2.2634-10

трсбителей и благополучия человека, научно-исследовательских организаций гигиенического профиля и медицинских учебных заведений, а также иных организаций и учреждений, проводящих исследования по оценке рисков, связанных с нанотехнологиями и использованием наноматериалов.

III. Общие положения

3.1.    Проведение исследований по микробиологической и молекулярно-генетической оценке воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза определяются правилами надлежащей лабораторной практики в соответствии с положениями приказа Минздрава РФ от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики» (зарегистрирован Министерством юстиции российской Федерации 25 июня 2003 г., регистрационный номер 4809)..

3.2.    Требования к стандартным наноматериалам.

3.2.1.    Для верификации, стандартизации и калибровки методов, применяемых при определении безопасности наноматериалов на модельных биологических тест-системах используются стандартные образцы наноматериалов (стандарты).

3.2.2.    Каждый стандарт наноматериала должен быть охарактеризован на соответствие по показателям химического состава (включая наличие примесей), размеру и форме частиц, удельной площади поверхности, типу кристаллической структуры. Указанные характеристики определяются с использованием методов масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, трансмиссионной электронной микроскопии, определения изотерм адсорбции инертных газов, рентгенофазового (рентгенодифракционного) анализа. В случае стандартных образцов фуллеренов при проверке соответствия следует использовать метод обращённофа-зовой ВЭЖХ.

3.2.3.    Каждый стандартный образец наноматериала должен быть снабжён «Паспортом безопасности наноматериалов», составленным на основе ГОСТ 30333-2007 «Паспорт безопасности химической продукции. Общие требования».

3.2.4.    Стандартные образцы наноматериалов должны быть упакованы для защиты при транспортировании от загрязнения или порчи.

3.2.5.    Хранение стандартных образцов наноматериалов осуществляется отдельно от остальных применяемых веществ с соблюдением условий хранения, указанных в «Паспорте безопасности наноматериалов» на протяжении всего срока годности образца.

7

МУ 1.2.2634-10

3.2.6. Хранение и использование стандартных образцов наноматериалов осуществляется в соответствии с утвержденным протоколом исследования.

3.3.    Требования к используемому оборудованию.

3.3.1.    Организации, проводящие определение безопасности наноматериалов в отношении нормальной микрофлоры кишечника, должны быть оснащены необходимым оборудованием, прошедшим метрологический контроль и калибровку в установленном порядке.

3.3.2.    Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения калибровки и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание.

3.4.    Планирование и проведение исследований.

3.4.1.    Определение безопасности наноматериалов в отношении нормальной микрофлоры кишечника проводится по утвержденному плану с ведением протокола и составлением отчета, в который заносятся все результаты исследований.

3.4.2.    Тесты по определению безопасности наноматериалов, требующие использования лабораторных животных, поводятся только на здоровых животных, прошедших карантин в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и приказом Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

3.4.3.    Помещения для лабораторных животных должны обеспечивать изоляцию (карантин) поступающих животных для наблюдения и выбраковки больных животных и животных, подозреваемых в носительстве инфекций; позволять осуществлять раздельное содержание как различных видов животных, так и различных групп животных одного вида, соответствовать санитарно-эпидемиологическим и ветеринарным требованиям.

3.4.4.    Корма, оборудование и инвентарь для ухода за животными необходимо хранить в помещениях, изолированных от мест содержания животных. Помещения, корма и инвентарь должны соответствовать требованиям, установленным в приказе Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и приказе Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию орга-

МУ 1.2.2634—10

низационных форм работы с использованием экспериментальных животных» и СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

3.4.5- Исследования безопасности наноматериалов на животных проводятся в соответствии с установленными правилами. Исполнителем должен быть обеспечен контроль за соблюдением правовых и этических норм использования лабораторных животных в соответствии с утверждённым протоколом (п 3.4.7).

3.4.6.    Корма и вода для животных должны обеспечивать пищевые потребности в соответствии с протоколом исследования, быть свободными от патогенных микроорганизмов и вредных примесей и не должны влиять на результаты исследования.

3.4.7.    Данные исследования безопасности наноматериалов по отношению к нормальной микрофлоре кишечника заносятся в протокол, в котором отражены цели работы и методы, используемые для достижения этих целей.

Протокол исследования утверждается руководителем организации, проводящей исследования, и включает: цель и задачи исследования, имеющиеся сведения о тестируемом наноматериале (физические, химические, биологические, токсикологические свойства), используемые стандарты, схему проведения тестирования и её обоснование, методы введения наноматериала в биологический объект, применяемые дозы наноматериала, методы исследования, определяемые показатели, результаты исследований, метрологическую характеристику используемого метода анализа, статистическую обработку результатов исследования, заключение, список используемой литературы.

3.4.8.    Вносимые изменения в протокол исследования утверждаются руководителем исследования, а отклонения от протокола (незапланированные события, непредвиденные обстоятельства и т. д.) записываются, пронумеровываются, подписываются руководителем исследования, датируются в приложении с указанием причин.

3.5. Требования к оформлению отчета.

3.5.1. По окончании проведенных исследований безопасности наноматериалов по влиянию на микробиологические и молекулярно-генетические показатели компонентов микробиоценоза оформляется отчет, в котором должны быть представлены: название, адрес организации, даты начала и завершения исследований, цель и задачи исследования; характеристика тестируемого наноматериала, включая имеющиеся сведения о физических, химических, биологических, токсикологических свойствах; перечень протестированных образцов наноматериала и применяемых стандартов, метод введения наноматериала в организм животного, схе-

9