Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

16 страниц

Купить Инструкция по применению 107-1006 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Документ устанавливает методику выполнения измерений массовой концентрации суммы летучих нитрозаминов - диметилнитрозамина и диэтилнитрозамина — в пищевых продуктах (мясных и колбасных изделиях, в рыбе и рыбных изделиях, в детском питании на основе мясных, рыбных и мучных продуктов) и продовольственном сырье (в зерне, сыром мясе, рыбе) методом жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором. Методика предназначена для органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор, для научно-исследовательских и других заинтересованных предприятий

 Скачать PDF

Оглавление

1 Область применения

2 Показатели прецизионности методики

3 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

     3.1 Средства измерений

     3.2 Вспомогательные устройства и оборудование

     3.3 Реактивы и материалы

4 Метод измерения

5 Требования безопасности

6 Требовании к квалификации оператора

7 Условия выполнения измерений

8 Подготовка к выполнению измерений

     8.1 Подготовка измерительной аппаратуры

     8.2 Приготовление растворов

     8.3 Установление градуировочной характеристики

     8.4 Градуировка хроматографа

     8.5 Контроль градуировочных характеристик

     8.6 Подготовка анализируемых образцов

9 Проведение анализа

     9.1 Выделение НА путем отгонки с водяным паром

     9.2 Экстракция НА из дистиллята

10 Результаты анализа

11 Оформление результатов испытаний

12 Проверка приемлемости результатов испытаний

13 Проверка стабильности результатов испытаний

Приложение А (обязательное). Схема установки для перегонки с водяным паром для выделения летучих НА из пробы

 
Дата введения01.02.2020
Добавлен в базу01.01.2019
Актуализация01.02.2020

Организации:

05.01.2007УтвержденГлавный Государственный санитарный врач Республики Беларусь107-1006
РазработанГУ Республиканский научно-практический центр гигиены
Нормативные ссылки:
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16

УТВЕРЖДАЮ Заместитель Министра — Главный государственный санитарный врач


.И. Римжа

ffr ХмИаЬА    200|г.

Д'нныи номер №    {Q0(.


^-у'^Лес-публини Беларусь

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРОЗАМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

инструкция по применению

Учреждение-разработчик:    Государственное    Учреждение

«Республиканский научно-практический центр гигиены» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Авторы: Марусич Н.И., Перцовский АЛ., Левошук Н.П., Турко Н.Н., Масалов И.Н.

1    Область применения

Настоящий документ «Методика определения нитрозаминов в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» устанавливает методику выполнения измерений массовой концентрации (далее -концентрация) суммы летучих нитрозаминов (далее - НА) - диметилнитрозамин (далее -ДМНА) и диэтилнитрозамина (далее - ДЭНА) - в пищевых продуктах (мясных и колбасных изделиях, в рыбе и рыбных изделиях, в детском питании на основе мясных, рыбных и мучных продуктов) и продовольственном сырье (в зерне, сыром мясе, рыбе) методом жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором.

Методика предназначена для органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор, для научно-исследовательских и других заинтересованных организаций.

Диметилнитрозамин - маслянистая жидкость, плотность (далее - d18) 1,01, температура кипения 152- 153°С, растворим в воде, этаноле, эфире и других органических растворителях. Структурная формула - (СИзДИ - N=0, молекулярная масса - 74,08.

Диэтилнитрозамин - маслянистая жидкость, d20 0,95, температура кипения 176,9°С, растворим в воде, этаноле, эфире и других органических растворителях. Структурная формула - (СгЬДДИ - N=0, молекулярная масса -102,13.

ДМНА и ДЭНА обладают широким спектром токсического действия и могут вызывать опухоли различной локализации.

В соответствии с Санитарными правилами и нормами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» № 11 63 РБ 98, утвержденными постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 2 июля 1998 г. № 22, предельно допустимая концентрация (ПДК) НА в мясе, мясных изделиях, колбасах - не более 0,002 мг/кг, в копченостях - не более 0,004 мг/кг, в рыбе свежей - не более 0,003 мг/кг, в продуктах для детского питания - не допускается при чувствительности метода 0,001 мг/кг, в зерне (пивной солод) - не более 0,015 мг/кг. [1]

Метод основан на выделении НА перегонкой с водяным паром и экстракции органическим растворителем, денитрозировании НА бромистым водородом в уксусной кислоте до соответствующих аминов, синтезе производных полученных аминов с 5-(диметиламино)-нафталин-1-сульфохлоридом (далее - дансилхлоридом), хроматографическом разделении и количественном определении образовавшихся производных на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором.

Чувствительность жидкостного хроматографа с флуоресцентным детектором в анализируемом объеме (20 мкл) - 0,5 нг - для ДМНА, 0,75 нг - для ДЭНА.

Идентификация дансилпроизводных НА производится по временам удерживания, а количественное определение содержания ДМНА и ДЭНА - методом внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта применяется дипропилнитрозамин (далее -ДПНА), который соответствует требованиям, предъявляемым к выбору внутреннего стандарта при количественном анализе методом жидкостной хроматографии и является наиболее приемлемым для надежного результата. [2]

2    Показатели ирецизионности методики

Относительные значения показателей прецизионности (повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости) при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ представлены в таблицах 1-2.

2

9    Проведение анализа

9.1    Выделение НА путем отгонки с водяным паром

Навеску 100 г измельченного в мясорубке или измельчителе пищевого продукта (напитков 250 см3 или детского питания) помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 cmj. соединенную с паровиком и прямым холодильником в соответствии с рисунком приложения 2 настоящей методики. К продукту добавляют 100-150 см3 дистиллированной воды (в зависимости от влажности продукта) и добавляют при помощи пипетки емкостью 1 см3 раствор ДПНА концентрацией 4 мкг/см'3 в количестве0,5 см3 и перемешивают. В смесь добавляют 10 г хлорида натрия, 10 г сульфата натрия или магния, 1 г сульфаниловой кислоты, 10 см3 1 н раствора серной кислоты. Все перемешивают, подсоединяют колбу к системе и отгоняют НА с водяным паром, собирая 200-250 cmдистиллята. Схема прибора для перегонки с водяным паром изображена в приложении А.

9.2    Экстракция НА из дистиллята

200-250 см3 дистиллята, полученного по п.9.1, экстрагируют в делительной воронке хлористым метиленом три раза порциями по 20 см3 в течение 5 мин. Каждую порцию экстракта сливают через воронку с бумажным фильтром, заполненную 5 г безводного сульфата натрия. Фильтр с безводным сульфатом натрия промывают 10 cmj экстрагента. Далее в осушенный экстракт добавляют 2 см3 3%-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, приготовленного по п. 8.2.2., перемешивают и оставляют для процесса денитрозирования не менее чем на 30 минут при комнатной температуре. Упаривают хлористый метилен на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 30°С. Полученный экстракт количественно переносят в фарфоровую чашку, колбу для упаривания омывают 0,5 cmj уксусной кислоты и присоединяют к содержимому фарфоровой чашки. Экстракт осторожно упаривают на песчаной бане при температуре не более 120°С.

Чашку с сухим остатком охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения в фарфоровую чашку добавляют 0,6 cmj буферного раствора и круговыми движениями растворяют сухой остаток. К полученному экстракту добавляют 0,8 см3 раствора дансилхлорида, приготовленного по п. 8.2.1., перемешивают и немедленно переносят смесь в пробирку с притертой пробкой вместимостью 5 см3. Плотно закрытую пробирку помещают в водяную баню с температурой 55°С не менее чем на 40 минут для прохождения процесса получения дансил-производных.

Затем пробирки извлекаются из водяной бани и охлаждаются до комнатной температуры. К полученному раствору добавляют 1 см3 бензола, интенсивно встряхивают в течении 5 минут и оставляют до момента четкого разделения фаз. Из верхнего прозрачного бензольно-ацетонового слоя пипеткой емкостью 2,0 см3 отбирают 1,62 смэкстракта и переносят в пробирку емкостью 5 см3 с пришлифованной пробкой. Полученный экстракт выдувают в токе воздуха досуха строго в вытяжном шкафу. К полученному сухому остатку добавляют 0,9 см3 подвижной фазы, плотно закрывают и растворяют сухой остаток путем встряхивания.

Дансилпроизводные анализируют на жидкостном хроматографе, записывая хроматограммы не менее 3-х раз.

10    Результаты анализа

Для расчета конечного содержания суммы НА в исследуемом образце замеряют площади пиков дансилпроизводных диметиламина, диэтиламина и дипропиламина в

И

исследуемом образце и в контрольном образце. Рассчитывают содержание, (X мг/кг), суммы НА с использованием внутреннего стандарта по формулам


т

ДМНАобр


^вн.ст. Х ^ обр.ДМНА Х ^отнДМНА


S


(2)


вн.ст.оор.


т

^ вн.ст. Х ^контр. ДМНА Х ^отнДМНА


ДМНАконтр.


S


- (мкг)

(3)


вн .cm.контр.


тДМНА ~ т ДМНАобр.    171 ДМНАконтр ,


т


твн.ст. Х $обр.ДЭНА Х К-отнДЭНА


ДЭНАобр


т

ДЭНАконтр.


{мкг)

_ "1вн.ст. '' LJ контр.ДЭНА Л ^отнДЭНА


S


вн.ст.оор.


S


{мкг)

вн.ст.контр.


т ДЭНА ~ т ДЭНАобр


т

ДЭНАконтр


(4)

(5)

(6) (7)


X


ДМНАт ДЭНА


171 ДМНА + т ДЭНА

Р


{мг / кг) 5


(8)


где шдмна; гпдэна - содержание ДМНА и ДЭНА в исследуемом образце, мкг;

S06p.flMHA; S06p. дэна - площади пиков ДМНА и ДЭНА в исследуемом образце, см2; Sfcomp. дмна; ^контр, дэна - площади пиков ДМНА и ДЭНА в контрольном образце, смд твн.ст. - масса ДПНА, введенного в образец и контроль и найденная по калибровочному графику ДПНА, мкг;

Котн дмна, дэнл - относительный коэффициент отклика для ДМНА и ДЭНА;

Р - навеска, г.

.Расчет содержания (X мг/кг) суммы НА с использованием калибровочных графиков:



ДМНАобр.


L ДМНАконтр


н


1 ДЭНАобр.


1 ДЭНАконтр .


ДМНА+ДЭНА


Р-К„

(9)


где гпдмна; тдэнл - содержание ДМНА и ДЭНА в исследуемом образце и контроле, вычисленное по калибровочным графикам, мкг;

Р - навеска, г.

Кизвл - степень извлечения, найденная по ДПНА. (по соотношению содержания внесенного ДПНА и полученного после извлечения)


В случае получения результатов анализа с содержанием ДПНА (внутреннего стандарта) выше внесенной величины, что бывает крайне редко, необходимо провести анализ образца без внесения внутреннего стандарта и рассчитать содержание ДПНА, ориентируясь на площади пиков ДМНА и ДЭНА в анализируемой пробе с внесенным ДПНА, т.е. в данном случае контролем за степенью извлечения будут служить пики ДМНА и ДЭНА на обеих хроматограммах и присутствии пика ДПНА на хроматограмме без внесения ДПНА, будет подтверждением его наличия.


12


В случае получения результатов выходящих за пределы максимальной концентрации по калибровочному графику необходимо повторить определение с уменьшенной навеской анализируемого образца.

11    Оформление результатов испытаний

Результаты измерений оформляют по форме, установленной действующей в лаборатории системой регистрации данных.

Результаты должны включать следующую информацию:

-    наименование (шифр) пробы;

-    дату проведения измерений;

-    результаты измерений;

-    фамилию оператора.

Гарантированный результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в виде

(Х±и(Х)),т/кг    (10)

где X - результат измерений, полученный в соответствии с настоящей методикой и рассчитанный согласно п. 10, по результатам не менее 2-х параллельных исследований одного образца;

U(X) - расширенная неопределенность результата измерений X, мг/кг.

Расширенную неопределенность рассчитывают по формуле

U = кх ис(Х),    (11)

где к - коэффициент охвата, равный 2 при доверительной вероятности Р=0,95;

ис (X) - суммарная стандартная неопределенность результата измерений X, мг/кг.

12    Проверка приемлемости результатов испытаний

Проверку приемлемости результатов осуществляют согласно п. 5.2.2.1 СТБ ИСО 5725-6-2002. Два результата испытаний должны быть получены в условиях повторяемости. В процессе внутреннего оперативного контроля проводят контроль стабильности градуировочного графика, определяют соответствие полученных результатов пределам повторяемости и воспроизводимости, нормативу точности.

Контроль стабильности градуировочного графика ДПНА проводится ежедневно с контрольной пробой. Вносится концентрация ДПНА, лежащая в середине концентраций градуировочного графика. Градуировочный график считается стабильным если выполняется условие:

I    г -С I

изм зад ^ ут*    /1    \

II    < Кгр, где    (12)

^ зад

Сзад - заданное значение концентрации ДПНА в градуировочном растворе, мкг/см3.

Сдам - измеренное значение концентрации ДПНА в контрольной пробе, мкг/см3.

Кф - норматив контроля градуировочного графика, % получен по пункту 7.1 Отчета

Диапазон измерений, мкг/см3

Норматив контроля Кф, %

Иф(Х), %

0,05-0,50

18,95

8,6

0,50-5,00

3,38

1,6

Если абсолютное значение разности гк между двумя результатами испытаний не превышает предел повторяемости гп (таблица 2), то оба результата считаются приемлемыми, и конечный заявляемый результат является их средним арифметическим. гк рассчитывается по формуле:

13

(С™-С,*,)*100

гк -    р    и-5;

ср

гк - найденное расхождение между двумя результатами, %;

Стах - максимальный результат определения;

Стт ' минимальный результат определения;

Сср - среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.

Если значение гк меньше либо равно гп, то повторяемость параллельных определений признают удовлетворительной и конечный результат является их средним арифметическим значением, при превышении гк значения гп контроль повторяют. При повторном превышении указанного норматива должны быть выяснены и устранены причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля воспроизводимости.

13 Проверка стабильности результатов испытаний.

Стабильность результатов измерений может быть проверена с использованием метода добавок и разведений или с использованием контрольной карты Шухарта в соответствии с СТБ ИСО 5726-6-2002.

При построении контрольной карты используют рабочие пробы с ДМНА, ДЭНА и ДПНА. Содержание ДМНА, ДЭНА и ДПНА в рабочей пробе соответствует содержанию их в середине диапазона исследований.

Рассчитывают:

-    центральную линию: d2xcтг,

где d2 =1,128 (коэффициент для расчета центральной линии для п=2);

-    границы регулирования: UCL= D7 х оу,

где D2 = 3,686 (коэффициент для расчета границы регулирования для п=2);

-    предупреждающие границы: UCL=D2(2) х оу,

где D2 (2) = 2,834 (коэффициент для расчета предупреждающих границ для п=2);

су - стандартное отклонение повторяемости, мг/кг.

(14)

Оценку стандартного отклонения повторяемости sr получают по формуле:

,/2>,

L

размах;

где w = \хг

X, и х2 - результаты первого и второго определения, мг/кг;

L - количество проведенных измерений.

Дата

проведения

анализа

Наблюдаемые значения

Размах w

Описание

ХщмНАСДЭНА)

Х?ДМНА(ДЭНА)

Сумма

Среднее значение

w/

/d2


Полученные значения заносят в лист данных контрольной карты:

14

Графически по оси X откладываю дату проведения анализа, по оси У - размах w. Также отмечают центральную линию и линии предупреждающей и регулирующей границ.

Если размах w выходит за линии предупреждающей и регулирующей границ, то результаты признаются нестабильными. В этом случае выясняются причины нестабильности и проводятся мероприятия по их устранению.

Методика разработана лабораторией хроматографических исследования, отдела физико-химических исследований ГУ «РНПЦ гигиены» М3 РБ.

Разработчики:

Н.И. Марусич Н.П. Левошук

Вед. научный сотрудник лаборатории хроматографических исследований, канд. химических наук

И.Н. Масалов

Ст. научный сотрудник

Мл. научный сотрудник

Литература

[1]    Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов № 11-63-РБ-98. Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача РБ от 2.07.1998 г. п 22.

[2]    Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В., Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. -М,: Химия, 1986. - 288 с.

[3]    СТБ ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. 4.6. Использование значений точности на практике. -Минск: Госстандарт, 2003 - 42 с.

15

Приложение А (Обязательное)



Рисунок А. 1. Схема установки для перегонки из пробы.

1.    Паровик;

2.    Дистиллированная вода;

3.    Круглодонная колба;

4.    Гомогенизат исследуемого продукта;

5.    Баня с глицерином;

6.    Насадка Вюрца;


с водяным паром для выделения летучих НА


7.    Трубка на шлифе;

8.    Насадка-барбатер;

9.    Холодильник Либиха;

10.    Аллонж;

11.    Приемник.


16


Таблица 1    -    Относительные    значения показателей повторяемости и

внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ при определении ДМНА___

Диапазон

измерений

ДМНА

(мг/кг)

Показатель повторяемости, % Or

Показатель внутрилабораторной воспроизводимости, % or

Расширенная относительная стандартная неопределенность, %

и

0,0005-0,0050

4,0

5,4

67,0

0,0050-0,0500

5,9

6,4

22,0

0,0500-0,5000

5,6

-

Таблица 2    -    Относительные    значения показателей повторяемости и

внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 МВИ при определении ДЭНА_______

Диапазон

измерений

ДЭНА

(мг/кг)

Показатель повторяемости, % ог

Показатель внутрилабораторной воспроизводимости, %

OR

Расширенная относительная стандартная неопределенность, %

и

0,00075-0,00750

5,4

5,9

45,0

0,00750-0,07500

5,3

5,8

18,0

0,07500-0,75000

5,1

6,2

-

Относительные значения пределов повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 указаны в таблицах 3-4.

Таблица 3    - Относительные значения пределов повторяемости и

внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 при определении ДМНА___

Диапазон измерений

Предел повторяемости (для

Предел внутрилабораторной

ДМНА

двух результатов

воспроизводимости (для двух

(мг/кг)

параллельных

результатов анализа), %

определений), % Гп

Rn

0,0005-0,0050

10,5

15,0

0,0050-0,0500

16,5

17,5

0,0500-0,5000

14,2

15,6

Таблица 4    - Относительные значения пределов повторяемости и

внутрилабораторной воспроизводимости при доверительной вероятности Р=0,95 при определении ДЭНА____

Диапазон измерений ДЭНА (мг/кг)

Предел повторяемости (для двух результатов параллельных определений), % гп

Предел внутрилабораторной воспроизводимости (для двух результатов анализа), %

Rn

0,00075-0,00750

15,1

16,4

0,00750-0,07500

14,7

16,1

0,07500-0,75000

14,4

17,4

3 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Agilent 1100

ГОСТ 24104-2001

фирма «Sigma-Aldrich», производитель USA ГОСТ 29227-91

3.1 Средства измерений

Хроматограф жидкостной с флуоресцентным детектором

Весы аналитические ВЛА-200, второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200г Микрошприц для хроматографа, «Hamilton» 50мкл, цена деления 1 мкл Пипетки 1-1-1-ОЛ 1-1-1-1 1-1-1-2 1-1-1-5

Колба мерная 11-1-5 (25,100,250,500)-2 Цилиндр мерный на 50, 100, 250 смПробирка со шлифом на 5,10 см3

3.2 Вспомогательные устройства и оборудование

ТУ 25-11-917-74 ТУ 64-1-423-72 ГОСТ 25336-82 ГОСТ 25336-82

Баня песчаная

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М Баня водяная Воронки ВД-1-500

Воронки конические, стеклянные диаметром 30-33 мм

Колба Кн-1-100(250)- 14/23 (29/32) ТС    ГОСТ    25336-82

Колба Кг-50-14/23 ТС    ГОСТ    25336-82

Колба К-1-100(250) - 29/32 ТС    ГОСТ 25336-82

Мясорубка и измельчитель

Фарфоровые чашки для выпаривания (диаметр 55 мм, объем 20 см3)

УФ-лампа ОКН-11    ТУ 84-1-1618-77

Могут быть использованы другие средства измерений и вспомогательные устройства, по точности, не уступающие рекомендованным в методике.

фирма «Agilent»

№ 990967-902 фирма «Sigma»,

каталожный № N 7756

фирма «Sigma»,

каталожный № N 0756

фирма «Supelko», каталожный № 40061 фирма «Merck» фирма «Merck»

Фирма «Acros»

3.3 Реактивы и материалы

Колонка для жидкостной хроматографии металлическая (250x4,6) Eclipse XDB-C18, 5мкм Диметилнитрозамин, р=1,01 г/см3

Диэтилнитрозамин, р=0,95 г/см'*

Дипропилнитрозамин в метаноле 100 мг Метанол 99,9%

Ацетон ос.ч. Ацетонитрил для ВЭЖХ или сорт 1-3 «Криохром»

4

Кислота бромистоводородная, х.ч. Кислота уксусная, х.ч.

Хлористый метилен, о.с.ч.

Натрий сернокислый безводный, х.ч. Дансилхлорид, 95%


ТУ 6-09-3534-74 ТУ 6-09-1649-87 фирма «Merck» ГОСТ 4166-76 фирма «Sigma»,


каталожный № D2625-lr


Кислота серная, х.ч.

Натрия гидроокись, х.ч.

Натрий углекислый кислый, х.ч. Сульфаминовая или сульфаниловая кислота Бензол, х.ч.

Натрий хлористый, х.ч.

Вода дистиллированная Фильтры бумажные, «синяя лента»



Могут быть использованы реактивы и материалы по техническим характеристикам отличающиеся от указанных, но не влияющие на результаты измерения методики.

4 Метод измерения

Измерения результатов исследования образцов содержащих НА производится жидкостной хроматографией с флуориметрическим детектором после следующих этапов подготовки:


перегонка с водяным паром нитрозаминов;

экстракция из водной среды в органический растворитель;

получение аминов - денитрозирование;

удаление органического растворителя и упаривание досуха;

- получение дансилпроизводных аминов;

переэкстракция дансилпроизводных из водно-ацетоновой среды в органический растворитель; удаление органического растворителя;

хроматографирование полученных дансилпроизводных в подвижной фазе на


ВЭЖХ.


5 Требования безопасности

Помещение, в котором производится определение НА обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с НА следует проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др.).

В лаборатории, где проводится работа с канцерогенными летучими НА необходимо всегда иметь 4% раствор бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте для разрушения НА при попадании их на рабочие места и пол. В целях разрушения летучих НА в воздухе по окончании работы помещение необходимо обработать УФ-светом в течение 30 минут.

Транспортировка и хранение НА осуществляется в стеклянных запаянных ампулах, обернутых в асбестовую ткань и упакованных в металлическую тару, которую также оплавляют парафином.

НА хранят в специальном холодильнике в отсутствие анализируемых проб.

6    Требований к квалификации оператора

К выполнению измерений могут быть допущены лица, имеющие высшее или среднее специальное образование, изучившие требования безопасности и настоящую методику, имеющие опыт работы с ядовитыми веществами и навыки в методах экстракции, концентрирования и получения различных производных.

7    Условия выполнения измерений

Выполнение измерений в лаборатории по настоящей методике осуществляется при следующих условиях:

-    температура воздуха при приготовлении растворов, в том числе градуировочных (20±2)°С;

-    температура воздуха при измерении (20±5) °С;

атмосферное давление 84,0-106,7 кПа (630-800 мм ртутного столба);

-    влажность воздуха (65±15)% при температуре 25 °С; напряжение питающей сети (220±10)В;

частота переменного тока (50±0,5)Гц, что соответствует ГОСТ 15150-69.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводятся в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и настоящей методикой

8    Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб к анализу.

8.1    Подготовка измерительной аппаратуры

Включить жидкостной хроматограф согласно инструкции по эксплуатации. Установить рабочие режимы для колонки и детектора. Для дегазации колбу с элюентом помещают на водяную баню при температуре 40-50 °С, открыв при этом пробку. После охлаждения колбы до комнатной температуры подвижная фаза готова к применению. Элюент должен быть всегда закрыт пробкой и храниться в холодильнике.

8.2    Приготовление растворов

8.2.1    Раствор дансилхлорида с концентрацией 0,5 мг/см3.

Навеску дансилхлорида массой 26,3 мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3 и растворяют в 20 см3 ацетона, доводят до метки ацетоном. Готовый раствор хранят в холодильнике, тщательно предохраняя от попадания влаги. Срок хранения - не более 3 Месяцев.

8.2.2    3%-ный раствор бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте (денитрозирующий раствор).

3    3

В коническую колбу вместительностью 100 см вносят 5 см 30%-ной бромистоводородной кислоты и добавляют 45 см3 ледяной уксусной кислоты. Смесь хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Срок хранения - не более 1 месяца. Признаком непригодности смеси является появление желто-коричневой окраски.

6

8.2.3    Буферный раствор с pH- 10,5.

В мерную колбу вместимостью 500 cmj помещают 3,2 г NaOH и вливают 200 cmj дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения щелочи, добавляют 20,0 г NaHCC>3. Тщательно перемешивают раствор до полного растворения соли, доводят объем смеси до метки дистиллированной водой. Хранят раствор в полиэтиленовой посуде. Срок хранения - 3 месяца.

8.2.4    Раствор серной кислоты с концентрацией 1н.

В мерную колбу вместимостью 250 см3 помещают 200 cmj дистиллированной воды. Добавляют 6,7 см3 концентрированной серной кислоты (плотностью 1,98 г/см3), перемешивают, охлаждают до комнатной температуры. Доводят объем до метки дистиллированной водой. Срок хранения не ограничен.

8.2.5    Рабочий раствор ДМНА с концентрацией 101 мкг/см3.

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 20 см3 метилового спирта. Добавляют 10 мм3 ДМНА микропипеткой на 0,1 cmj (концентрацией 1,01 г/см3) и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.

8.2.6    Рабочий раствор ДЭНА с концентрацией 95 мкг/см3.

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 20 cmj метилового спирта. Добавляют 10 mmj ДЭНА микропипеткой на 0,1 см3 (концентрацией 0,95 г/см3) и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.

8.2.7    Рабочий раствор ДПНА с концентрацией 400 мкг/ см3.

В мерную колбу вместимостью 250 cmj количественно переносят стандартный образец состава ДПНА с навеской 100 мг, растворяя его в метиловом спирте, и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 1 года.

8.2.8    Рабочий раствор ДПНА с концентрацией 4 мкг/ см3 (внутренний стандарт).

В мерную колбу вместимостью 100 см3 пипеткой емкостью 1 см3 вносят 1 cmj рабочего раствора ДПНА с концентрацией 400 мкг/см3 добавляют 20 см3 метилового спирта, тщательно перемешивают и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более 6 месяцев.

8.2.9    Подвижная фаза для жидкостного хроматографа - смесь ацетонитрил : вода (7:3).

В коническую колбу вместимостью 1000 см3 помещают 700 см3 ацетонитрила. Добавляют 300 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и дегазируют. Для дегазации колбу с элюентом помещают на водяную баню при температуре 40-50 °С, открыв при этом пробку. После охлаждения колбы до комнатной температуры подвижная фаза готова к применению. Элюент должен быть всегда закрыт пробкой и храниться в холодильнике. Срок хранения не ограничен.

7

8.2.10    Хлористый метилен.

Очистку хлористого метилена производят перегонкой с дефлегматором. При этом отбирают не более 80% растворителя от начального объема.

8.2.11    Приготовление градуировочных растворов

8.2.11.1    Приготовление основной смеси ДМНА, ДЭНА и ДПНА с концентрациями компонентов 3,0, 4,5 и 6,0 мкг/ см3 соответственно.

В колбе вместимостью 100 cmj с притертой пробкой смешивают 2,97 см3 раствора ДМНА (95 мкг/^см3), 4,74 см3 ДЭНА (101 мкг/ см3) и 0,60 см3 ДПНА (400 мкг/ см3) пипеткой на 5cmj и на 0,1см3. Смесь хранится в посуде из темного стекла в холодильнике (при температуре +4°С) не более 6 месяцев.

8.2.11.2    Выделение НА путем отгонки с водяным паром

В колбу для перегонки вместимостью 500 смД соединенную с паровиком и прямым холодильником в соответствии с рисунком приложения А настоящей методики, поместить 250 cmj дистиллированной воды, добавить 2 см3 стандартной смеси ДМНА, ДЭНА и ДПНА в метаноле пипеткой на 2,0 см3. Содержание НА в водном растворе составляет 6,0, 9,0 и 12,0 мкг соответственно. К смеси добавить 10 г сульфата натрия или сульфата магния, 1 г сульфаминовой кислоты, 10 г хлорида натрия, 10 см3 3 н раствора серной кислоты. Все перемешивают, подсоединяют колбу к системе и отгоняют НА с водяным паром, собирая 250 cmj дистиллята в колбу на 300 cmj.

8.2.11.3    Экстракция НА из дистиллята

250 см^ дистиллята, полученного по п. 8.2.11.2 помещают в делительную воронку на 500 смД колбу ополаскивают 20 cmj хлористого метилена, который затем сливают в делительную воронку с экстрактом и производят экстракцию в течении 5 мин. Экстракцию хлористым метиленом повторяют еще дважды порциями по 20 см3 в течение 5 мин. Каждую порцию экстракта сливают через воронку с бумажным фильтром, заполненную 5 г безводного сульфата натрия или сульфата магния в колбу для отгонки на 100 cmj. Фильтр с безводным сульфатом натрия промывают 10 см3 экстрагента.

8.2.11.4    Получение дансилпроизводных НА.

В осушенный экстракт добавляют 2 cmj 3%-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, приготовленного по п. 8.2.2., перемешивают и оставляют для процесса денитрозирования не менее чем на 30 минут при комнатной температуре. Упаривают хлористый метилен на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 30°С до приблизительно 2 см3. Полученный экстракт количественно переносят в фарфоровую чашку, колбу для упаривания омывают 0,5 см3 уксусной кислоты и присоединяют к содержимому фарфоровой чашки. Экстракт осторожно упаривают на песчаной бане при температуре не более 120°С.

Чашку с сухим остатком охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения в фарфоровую чашку добавляют 0,6 см3 буферного раствора и круговыми движениями растворяют сухой остаток. К полученному экстракту добавляют 0,8 cmj раствора дансилхлорида, приготовленного по п. 8.2.1., перемешивают и немедленно переносят смесь в пробирку с притертой пробкой вместимостью 5 cmj. Плотно закрытую пробирку

помещают в водяную баню с температурой 55°С не менее чем на 40 минут для прохождения процесса получения дансил-производных.

Затем пробирки извлекаются из водяной бани и охлаждаются до комнатной температуры. К полученному раствору добавляют 1 cmj бензола, интенсивно встряхивают в течении 5 минут и оставляют до момента четкого разделения фаз. Из верхнего прозрачного бензольно-ацетонового слоя пипеткой емкостью 2,0 см3 отбирают 1,62 cmэкстракта и переносят в пробирку емкостью 5 см3 с пришлифованной пробкой. Полученный экстракт выдувают в токе воздуха досуха строго в вытяжном шкафу. К полученному сухому остатку добавляют 1,8 см3 подвижной фазы, плотно закрывают и растворяют сухой остаток путем интенсивного встряхивания. Отстоявшийся раствор является основным раствором для приготовления остальных градуировочных растворов (раствор №6).

В таблице 5 представлена схема разведения для получения калибровочных растворов. Калибровочные растворы готовятся в пробирках вместимостью 5 см3 при помощи пипеток емкостью 1 и 2 cmj путем последовательного разведения подвижной фазой.

Таблица 5 - Приготовление калибровочных растворов и содержание в них НА.

градуиро

вочного

раствора

Объем смеси, см3

Объем подвижной фазы, см'5

ДМНА, мкг/

3

см

ДЭНА, мкг/ см3

ДПНА,^ мкг/

CMJ

1

1,0 р-ра №2

1,0

0,025

0,0375

0,050

2

0,5 р-ра №3

2,0

0,050

0,075

0,100

3

0,5 р-ра №4

1,5

0,250

0,375

0,500

4

1,0 р-ра №5

1,0

1,000

1,500

2,000

5

1,0 р-ра №6

0,5

2,000

3,000

4,000

6

1,8

0

3,000

4,500

6,000

Таким образом из раствора № 6 получают раствор № 5 путем смешивания 1,0 cmj основного раствора с 0,5 см3 подвижной фазы, получен раствор общим объемом 1,5 cmj с концентрацией ДМНА, ДЭНА и ДПНА 2,0; 3,0 и 4,0 мкг/мл соответственно.

8.2.11.5 Приготовление контрольной пробы.

Приготовление контрольной пробы или контроль на реактивы проводится с целью определения наличия НА в применяемых реактивах для их вычитания из результатов анализа.

В колбу для перегонки помещают все используемые реактивы (п 8.2.11.2) в 250 см3 дистиллированной воды, добавляют при помощи пипетки емкостью 1 см3 раствор ДПНА концентрацией 4 мкг/см3 в количестве 0,5 см3.

8.3 Установление градуировочной характеристики

Хроматографирование градуировочных растворов и контрольной пробы проводится при следующих условиях:

-    жидкостной хроматограф с флуоресцентным детектором;

-    колонка из нержавеющей стали (250x4 мм), заполненная сорбентом Eclipse XDB-С18, зернением 5 мкм;

-    температура колонки 30 °С;

9

-    подвижная фаза - смесь ацетоннитрил-вода в объемном соответствии 7:3, скорость элюирования - 1,2 см7мин;

-    длина волны возбуждения - 350 нм;

-    эмиссионный фильтр - 530 нм;

-    объем вводимой пробы - 20 мкл;

-    время удерживания дансилпроизводных устанавливается по калибровочным смесям при подобранных условиях хроматографии.

8.4 Градуировка хроматографа

Приготовленные в соответствии с табл. 3 градуировочные смеси используются для градуировки хроматографа.

При условиях хроматографии, указанных в п. 8.3, записывают не менее трех хроматограмм для каждого из приготовленных растворов и измеряют площади пиков дансилпроизводных диметиламина, диэтиламина и дипропиламина. Определяют среднеарифметическое значение площадей пиков, рассчитанное из площадей хроматограмм.

Численное значение относительных коэффициентов отклика детектора КоХН получают из хроматографических данных градуировочных растворов с известными концентрациями ДМНА, ДЭНА и ДПНА по формуле

0)

т х S-

вн.ст. i


к = ю,-х

где /и, - масса введенных в хроматограф ДМНА и ДЭНА, мкг;

Si - площади полученных пиков ДМНА и ДЭНА, см2;

8вн ст - площадь внутреннего стандарта - ДПНА, см2;

тен ст - масса введенного внутреннего стандарта - ДПНА, мкг.

Численное значение Котн каждый экспериментатор вычисляет в соответствии с применяемыми приборами, реактивами, установками и его необходимо пересчитывать при изменении любой из перечисленных составляющих.

5.5    Контроль градуировочных характеристик

Контроль градуировочных характеристик осуществляется по внутреннему стандарту, вводимому в контрольную и исследуемую пробу. Площадь вносимого внутреннего стандарта в холостую и исследуемую пробу в одинаковой концентрации не должны отличаться более чем на 10 % от площади, по которой были рассчитаны коэффициенты отклика. Если обнаружится, что результаты сильно отличаются, то необходимо пересчитать коэффициент отклика Кн-

8.6    Подготовка анализируемых образцов

Отбирают не менее 1 кг средней пробы пищевого продукта или продовольственного сырья в соответствии с требованиями СТБ 1036-97 «Продукты пищевые и продовольственное сырье. Методы отбора проб для определения показателей безопасности».

Отобранные образцы можно хранить в морозильной камере при -8--18°С 1-3 суток в зависимости от сроков реализации продукции.

10