Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

27 страниц

456.00 ₽

Купить ГОСТ 34105-2017 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза: - реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами; - пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба); - реакция связывания комплемента; - реакция длительного связывания комплемента на холоде; - реакция непрямой гемагглютинации; - реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном; - реакция иммунодиффузии в геле агара с R-бруцеллезным антигеном; - кольцевая реакция с молоком; - иммуноферментный анализ; - иммунохроматографический анализ. Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.

 Скачать PDF

Информация бюро по стандартам МГС о дополнительном присоединении страны Узбекистан (UZ, Узстандарт); ИУС 2-2018

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Термины, определения и сокращения

4 Условия выполнения исследований и требования безопасности

5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные.

6 Отбор проб

7 Методы серологической диагностики бруцеллеза

8 Интерпретация результатов исследований

 
Дата введения01.07.2018
Добавлен в базу01.01.2018
Актуализация01.01.2019

Этот ГОСТ находится в:

Организации:

07.06.2017УтвержденМежгосударственный Совет по стандартизации, метрологии и сертификации99-П
22.06.2017УтвержденФедеральное агентство по техническому регулированию и метрологии582-ст
ИзданСтандартинформ2017 г.
РазработанФГБУ ВГНКИ

Animals. Laboratory Diagnostics of brucellosis. Serological methods

Нормативные ссылки:
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

Животные

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Серологические методы

ГОСТ

34105—

2017

Издание официальное


Москва

Стандартинформ

2017


Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия. обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г № 99-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны no МК (ИСО 3166) 004—97

Код страны по МК (ИСО 3166)004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Казахстан

KZ

Госстандарт Республики Казахстан

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Россия

RU

Росстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. № 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5    ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

© Стандартинформ. 2017

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР. исследуют на бруцеллез в РБП. или в РА и РСК (РДСК). или в РА и РИД. или в РИГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.

7.4    Реакция агглютинации (РА) в пробирках

7.4.1    РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец. коз. лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

7.4.2    Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5 %

В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют соответственно 8.5. 50 и 100 г хлористого натрия и добавляют к каждому раствору по 5 г фенола. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2 °С до 20 °С. и используют в течение 1 мес.

7.4.3    Проведение исследования

7.4.3.1    При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0,85 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз — фенолизированным 5 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) — фенолизированным 10 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

7.4.3.2    Сыворотки крови исследуют в четырех разведениях в пробирках Флоринского в обьеме 1 см3:

-    для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — в разведениях 1:50.1:100.1:200 и 1:400;

-    для овец. коз. оленей (маралов) и собак — в разведениях 1:25.1:50.1:100 и 1:200;

-    для собак с R-бруцеллезным антигеном (B.canis)— в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

-    для пушных зверей и морских свинок — в разведениях 1:10,1:20.1:40 и 1:80.

Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.

7.4.3.3    Получение исходного разведения проб сыворотки:

-    сыворотки крови крупного рогатого скота (лошадей, верблюдов) по 0.1 см3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2.4 см3 фенолизироваиного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия по

7.4.2    (разведение 1:25);

-    сыворотки крови овец, коз и собак по 0.2 см3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2.3 с».»фенолизированного 5 %-ного раствора хлористого натрия по 7.4 2 (разведение 1:12.5);

-    сыворотку крови оленей и маралов по 0.2 см3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по

2,3 см3 фенолизированного 10 %-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12.5);

-    сыворотку крови пушных зверей и морских свинок по 0.3 ал3 вносят в пробирки первого рада, содержащие по 1.2 см3 фенолизированного 0,85 %-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:5);

-    при исследовании с ^-бруцеллезным антигеном (B.canis) сыворотку крови собак по 0.1 см3 вносят в пробирки, содержащие по 2.4 см3 фенолизированного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия по

7.4.2    (разведение 1:25).

В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.

В пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0.5 см3 соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2.

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0.5 см3 исходного разведения сыворотки.

После пипетирования (не менее трех раз) разведение сыворотки из третьего ряда по 0.5 см3 переносят в пробирки четвертого рада и после пипетирования из четвертого — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0.5 см3 жидкости удаляют. Таким образом, получают последовательные двукратные разведения образцов сыворотки.

7.4    3 4 В пробирки второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0.5 см3 антигена в рабочем разведении 1:10 (1.0 ♦ 9.0 сгл3) соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.

ГОСТ 34105-2017

В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглютина-цию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглю-тинации не учитывают.

После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37 °С—38 *С на 16—20 ч. затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

7.4.3.5 На территориях, угрожаемых или неблагополучных по бруцеллезу, проводят массовые серологические исследования. При этом допускается проведение исследований в двух разведениях Сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с резиновой грушей), или групповыми дозаторами Флоринского. или одноканальными пипеточными дозаторами в две серологические пробирки Флоринского в дозах 0.02 и 0.01 см3 (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0.04 и 0.02 см3 при исследовании сывороток овец, коз. оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку вносят по 1.0 смантигена, разведенного соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 в соотношении 1:20. При этом сыворотки крови будут разведены соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.

Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.

7.4.4 Обработка результатов

Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания. оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а >ющ-кость остается прозрачной (100 % агглютинации);

«♦++» (три креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» агглютината (75 % агглютинации);

«++» (два креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» агглютината умеренно выражен (50 % агглютинации);

«+» (один крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25 % агглютинации);

«-» (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на два креста («++»), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 см3 сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME. 1:200 — 200 ME и т. д.).

Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75 %. 50 %. 25 % и 0 % просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно вносят 0.5; 1.0; 1.5 и 2,0 см3 антигена, разведенного 0,85 %-ным фенолизированным раствором хлористого натрия в соотношении 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 1,5; 1,0 и 0,5 см3 соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2. После перемешивания содержимого пробирок из каждой из них переносят по 1.0 см3 в серологические пробирки. Полученные образцы сравнения мутности соответствуют 75 %. 50 % и 25 % просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Образцы сравнения мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста («++») в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

В заключении лаборатории о результатах исследования должны быть отражены диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки. в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой два — четыре креста — «положительная» 200 МЕ/см3; титр сыворотки 1:100 с оценкой два — четыре креста — «сомнительная» 100 МЕ/см3).

9

Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.

7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания

комплемента на холоде (РДСК)

7.5.1    РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков. зебу), овец. коз. свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Сущность реакции состоит в том. что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело.

7.5.2    РДСК применяют вместо РСК, в том числе для исследования сывороток, обладающих анти-комллементарными свойствами.

Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген — антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.

7.5.3    Подготовка к исследованию

7.5.3.1    Приготовление 0.85 %-ного раствора хлористого натрия

Для приготовления 1 дм3 раствора 8.5 г хлористого натрия растворяют в дистиллированной воде, устанавливают pH 6.8—7,2 ед. pH 5 %-ным раствором натрия гидроокиси и дважды фильтруют через бумажный фильтр. 0.85 %-ный раствор хлористого натрия хранят в стеклянной бутыли, закрытой резиновой или корковой пробкой, и используют в течение 1 мес.

7.5.3.2    Приготовление 5 %-ного раствора натрия гидроокиси

Для приготовления 5 %-ного раствора натрия гидроокиси 5 г натрия гидроокиси растворяют в 100 см3. Раствор хранят при комнатной температуре в течение месяца.

7.5.3.3    Образцы сыворотки крови и компоненты РСК и РДСК разводят 0.85 %-ным раствором хлористого натрия по 7.5.3.1. Сухой комплемент регидратируют и титруют по ГОСТ 16446.

Берут такое количество флаконов (ампул), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта копичество комплемента. В каждый флакон (ампулу) вносят 0.85 %-ный раствор хлористого натрия в объеме, указанном на этикетке, и. не встряхивая, помещают в холодильник на 20—30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания флаконов (ампул), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при температуре от 4 °С до 10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования регидратированный комплемент разводят 0,85 %-ным раствором хлористого натрия в соотношении 1:20. а остальной — хранят в холодильнике. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки при постановке реакции. Рабочий титр комплемента должен быть на два интервала больше его титра

А В

20


X =


(1)


где А — рабочий титр комплемента, см3;

8 — количество пробирок в опыте, ил;

20 — исходное разведение комплемента (1:20).


Xm0J2J00

20


Пример —


Количество комплемента X. см3, необходимого для проведения опыта, рассчитывают по формуле

Так как количество комплемента о рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 см3 (0,2 ■ 100), то к 0,6 см3 регидратированного комплемента добавляют 19,4 см0,85 %-ного раствора хлористого натрия.

Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.

Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так. если титр сыворотки равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.

Эритроциты барана — 2.5 %-ную взвесь эритроцитов барана в 0,85 %-ном растворе хлористого натрия для РСК и РДСК готовят из свежей или консервированной крови барана по ГОСТ 16446. Дефи-бринированную кровь фильтруют через марлю и консервируют стрептомицином из расчета 1 г препарата. растворенного в 10—20 см3 стерильного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия, на 100 см3 крови. Ю

ГОСТ 34105-2017

Консервированная кровь при хранении в холодильнике пригодна для использования, как правило, в течение 10—14 сут.

Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2.5 %-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 °С—38 °С в течение 15—35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.

Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК — при 60 "С—62 °С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64 *0—65 °С. буйволов — 62 С—64 °С. свиней — 58 °С—60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 С—64 ’С в течение 30 мин.

Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1 — Проверка антикомплементармых и гемотоксических свойств компонентов реакций

Наименование и объем компонентов реакции, см3

Антикомпле

ментарность

Гемо токсичность

комплемента

гемолитической

сыворотки

антигена

0.85 %-ный раствор хлористого натрия

Комплемент в разведении 1:20

0.2

0.2

Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении

0.2

0.2

_

_

Антиген в рабочем разведении

0.4

0.4

Эритроциты.

2.5 %-ная взвесь

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.85 %-ный раствор хлористого натрия

_

0.6

0.6

0.4

0.8

Водяная баня 10 мин при 37 °С—38 °С

Результат

Гемолиз

Полная задержка гемолиза эритроцитов

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

7.5.4 Проведение исследования в РСК

При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).

Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:

-    при массовом исследовании в одной пробирке к 0.05 см3 исследуемой сыворотки добавляют 0.2 см3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:5);

-    при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0.1 см3 исследуемой сыворотки, добавляют 0.4 см3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия (разведение сыворотки крови 1:5 в объеме 0.5 см3) и смешивают. Из первой пробирки переносят 0.2 см3 во вторую пробирку и 0.1 см3 — в третью. В третью пробирку добавляют 0,1 см3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:10).

Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в 7.5.3.3.

Сыворотку. 0.85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пи-петочных дозаторов с наконечником.

Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

и

Таблица 2

Компоненты реакции

При массовом исследовании

При исследовании в двух разведениях

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

1 (1:5)

1(15)

2(15)

3(1:10)

Исследуемая сыворотка, см3

0.05

0.1

0.2

0.1

0,85 %-ный раствор хлористого натрия, см3

0.2

0.4

0.1

Водяная баня 30 мин при 58 еС—65 °С

0,85 %-ный раствор хлористого натрия, см3

0.2

Антиген в рабочем разведении, см3

0.2

0.2

0.2

Комплемент в рабочем разведении, см3

0.2

0.2

0.2

0.2

Водяная баня 20 мин при 37 X—38 *С

Гемолитическая система, см3

0.4

0,4

0.4

0,4

Водяная баня 20 мин при 37 *С — 38 *С

Примечание —Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки

При постановке реакции ставят следующие контроля:

-    негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 сантигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);

-    гемолитической системы (0,4 см3 гемолитической системы и 0,6 см3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза:

-    комплемента (0.2 см3 комплемента в рабочем разведении. 0.4 см3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия и 0.4 см3 гемолитической системы) — полный гемолиз;

-    антигена (0.2 см3 антигена в рабочем разведении. 0.2 см3 комплемента в рабочем разведении. 0,2 см3 0,85 %-ный раствор хлористого натрия и 0.4 см3 гемолитической системы) — полный гемолиз.

При необходимости определения титра исследуемых проб сыворотки, разведения готовят следующим образом: в пробирки первого ряда (разведение 1:5) вносят по 0.8 см3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия. 0.2 см3 пробы сыворотки и смешивают пипетированием. В пробирки третьего, четвертого. пятого и шестого рядов вносят по 0.2 см3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия. Пробы сыворотки из первого ряда пробирок вносят по 0.2 см3 в пробирки второго и третьего рядов. В пробирках третьего ряда сыворотку смешивают, получая разведение 1:10; 0.2 см3 разведения сыворотки вносят в пробирки четвертого ряда, смешивают, получая разведение 1:20. и так далее до шестого разведения 1:80 Из пробирок последнего ряда по 0.2 см3 разведений сыворотки удаляют. В пробирки второго ряда вносят по 0.2 см3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия (ряд без внесения антигена — контроль антикомпле-ментарных свойств сыворотки). Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)

7.5.5.1 Подготовка к исследованию

Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактивирование разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 ипи 1:20 при титре 0.06—0.1 ипи в разведении 1:20—1:15 при титре 0.1—0.14

Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.

Учет результатов титрования проводят немедпенно после выемки штатива из водяной бани.

ГОСТ 34105-2017

Таблица 3

Компоненты

Ряды

Номера пробирок

реакции

пробирок в штативе

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Сыворотка в разведении 1 5,см3

первый

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

второй

0.2

0,2

0.2

0.2

0.2

0,2

0.2

0.2

0.2

0.2

Водя

ная баня 30 мин при 63 *С—64 С

0,85 %-ный раствор хлористого натрия,

первый

см3

второй

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

Антиген в рабочем разведении, см3

первый

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

второй

Комплемент в рабочем разведении, см3

первый

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

второй

0,2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

Холодильник 16—18

ч при 2 °С—6 °С

Гемолитическая система, см3

первый

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

второй

0.1

0,2

0.3

0.4

0.5

0,6

0.7

0,8

0.9

1.0

Водяная баня 20 мин при 37

вС—38 ‘С

Примерный результат

первый

ПГ

ПГ

ПГ

ПГ

ПГ

ПГ

ПГ

ЗГ

НГ

НГ

второй

ПГ

ПГ

ПГ

ПГ

ПГ

ПГ

ПГ

ЗГ

ЗГ

НГ

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативной сывороткой или в безантигенном ряду, если исследуемая сыворотка оказалась позитивной. Рабочая доза на один интервал ниже (например, при титре гемолитической системы 0.7 см3, рабочая доза — 0.6 см3).

7.5.5.2 Проведение исследования

Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4

Таблица 4

Компоненты

реакции

При массовом исследовании

При исследовании в трех пробирках

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

1(1:5)

1 (1:5)

2(1:5)

3(1:10)

Исследуемые сыворотки

0.05

0.1

0.2

0.1

0.85 %-ный раствор хлористого натрия

0.2

0.4

_

0.1

Водяная баня 30 мин при 63 °С—64 °С

0.85 %-ный раствор хлористого натрия

0.2

_

Антиген в рабочем раведе-нии

0.2

0.2

0.2

Комплемент в рабочем разведении

0.2

0.2

0.2

0.2

Холодильник 2—6 *С 16—18 ч и 20 мин при комнатной температуре

Гемолитическая система в рабочей дозе

0.6

0.6

0.6

0.6

Водяная баня 20 мин при 37 °С—38 ®С

13

ГОСТ 34105-2017

Содержание

1    Область применения................................................................ 1

2    Нормативные ссылки................................................................ 1

3    Термины, определения и сокращения.................................................. 2

4    Условия выполнения исследований и требования безопасности............................ 3

5    Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы    и животные...................... 3

6    Отбор проб........................................................................ 5

7    Методы серологической диагностики бруцеллеза........................................ 6

8    Интерпретация результатов исследований..............................................21

III

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

Животные

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА Серологические методы

Animals Laboratory diagnostics of brucellosis Serological methods

Дата введения — 2018—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:

-    реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами;

-    пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);

-    реакция связывания комплемента;

-    реакция длительного связывания комплемента на холоде;

-    реакция непрямой гемагглютинации;

-    реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;

-    реакция иммунодиффузии в геле агара с ft-бруцеллезным антигеном;

-    кольцевая реакция с молоком;

-    иммуноферментный анализ;

-    иммунохроматографический анализ.

Примечание — Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0 004—2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИС01042—83. ИС04788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 34105-2017

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025—2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4—81) Посуда лабораторная стеклянная Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку

3 Термины, определения и сокращения

3.1    В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.

3.2    В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

-    РА — реакция агглютинации;

-    РСК — реакция связывания комплемента;

-    РБП — пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;

-    РДСК — реакция длительного связывания комплемента;

-    РИД— реакция иммунодиффузии;

-    ЛПС — липополисахаридный антиген;

-    О-ПС — олигополисахаридный антиген;

-    РИГА — реакция непрямой гемагглютинации;

-    КР с молоком — кольцевая реакция с молоком;

-    ИФА — иммуноферментный анализ;

-    ИХА — иммунохроматографический анализ;

-    PKr-G — раствор коньюгата. конъюгированного с пероксидазой;

-    ФСБ-Т — фосфатно-солевой буферный раствор с тайном;

-    РБР-С — разводящий буферный раствор для сывороток;

-    ТМБ-субстрат — тетраметилбензидин-субстрат;

-    К+ — инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);

ГОСТ 34105-2017

-    К- — инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).

4    Условия выполнения исследований и требования безопасности

4.1    Условия выполнения исследований

4.1.1    Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.

4.1.2    Требования к персоналу — по ГОСТ ISO 7218. ГОСТ ИСО/МЭК 17025.

4.1.3    К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности1, изучившие методики микробиологических работ. В зонах неблагополучных по бруцеллезу сотрудники должны быть вакцинированы против бруцеллеза.

4.2 Требования безопасности

4.2.1    Общие требования безопасности при проведении работ с микроорганизмами — согласно ГОСТ 12.1.008

4.2.2    Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12 4 011.

4.2.3    Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.

4.2.4    Обучение персонала безопасности труда — в соответствии с ГОСТ 12.0 004

4.2.5    Обеззараживание материала после исследований, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т. д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 2 атм (0.2) МПа и температуре (132 ± 2) °С.

5    Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные

При проведении исследований используют следующие средства измерений, оборудование, материалы. реактивы и животных:

-    pH-метр с точностью калибровки ± 0.1 ед. pH при температуре от 20 °С до 55 вС;

-    спектрофотометр с диапазоном длины волны от 198 до 1000 нм. разрешением 1 нм и точностью ± 2 нм;

-    пипетки градуированные выдувные вместимостью от 1 до 10 см3 по ГОСТ 29230;

-    колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности;

-    центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000—3000 об/мин;

-    автоклав лабораторный;

-    термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 °С до 50 "С;

-    баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100 °С;

-    холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0 X до 10 °С по ГОСТ 16317;

-    насос вакуумный;

-    иглы препаровальные;

-    штамп для формирования лунок в агаре;

-    осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0—360 и источником света — лампой В/Ватт-8/20;

-    чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;

-    чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147;

-    комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:

1)    шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;

2)    пипетка-капельница для дозирования антигена;

3)    ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;

4)    аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;

-    пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);

-    штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского;

-    групповые дозаторы Флоринского;

-    пробирки серологические Флоринского.

-    микропипетки вместимостью от 0.1 до 0.5 см3;

-    дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;

-    наконечники для дозаторов вместимостью 0.2; 0,5; 1.0 см3;

-    фильтры бумажные из бумаги фильтровальной по ГОСТ 12026;

-    бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

-    салфетки марлевые;

-    спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;

-    вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

-    кислота соляная по ГОСТ 3118 х. ч;

-    фенол по ГОСТ 23519 — 5 %-ный раствор;

-    формалин по ГОСТ 1625 — 1 %-ный и 10 %-ный растворы;

-    натрий хлористый по ГОСТ 4233;

-    кислота борная по ГОСТ 18704 — 3 %-ный раствор;

-    натрия бихромат по ГОСТ 2651;

-    калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;

-    кислота серная по ГОСТ 4204;

-    натрия гидроокись по ГОСТ 4328;

-    сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445;

-    комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446;

-    кровь барана-донора;

-    свинки морские массой 300—400 г;

-    сыворотки крови животных;

-    набор для ИФА. содержащий в своем составе:

1)    планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella:

2)    флакон № 1 — ФСБ-Т объемом 26 см3;

3)    флакон № 2 — РБР-С объемом 12 см3;

4)    флакон № 3 — PKr-G объемом 12 см3;

5)    флакон № 4 — К+ объемом 1,5 см3;

6)    флакон № 5 — К- объемом 2.5 см3;

7)    флакон № 6 — ТМБ-субстрат;

8)    флакон № 7 — стол-реагент объемом 6 см3;

-    тест-система для определения антител к ЛПС антигену В abortus и 8 melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА. содержащая в своем составе компоненты;

1)    К, — иммунохроматографические тест-полоски, нитроцеллюлозные мембраны на полимерной основе белого цвета, ламинированные защитными этикетками с обозначениями разного цвета: в нижней части — стрелки, указывающие направления погружения полоски в тестируемую пробу; в верхней части — название рода и вида возбудителя исключаемой болезни;

2)    К2 — буферный раствор для разведения проб объемом 0.8 см3;

-    негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных),

-    антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК);

-    роз бенгал антиген для РБП;

-    антиген бруцеллезный для КР с молоком;

-    0.85 %-ный раствор хлористого натрия;

-    0.85 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;

-    5 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;

-    10 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;

-    раствор хлорамина 5 %-ный;

-    взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

-    молоко от здоровой коровы (буйволицы);

-    набор для РИД. содержащий в своем составе:

1) О-ПС бруцеллезный антиген:

4

ГОСТ 34105-2017

2)    натрий хлористый по ГОСТ 4233;

3)    микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;

-    набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:

1)    антиген бруцеллезный эритроцитарный для РИГА;

2)    взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

3)    сыворотку бруцеллезную;

4)    сыворотку негативную

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.

6 Отбор проб

6.1    Забор крови у животных для получения сыворотки проводят:

-    из яремной, ушной или хвостовой вены у свиней;

-    головной вены, вены предплечья или латеральной подколенной вены голени у собак;

-    из бедренной вены у лисиц и песцов;

-    путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста у норок.

Кровь берут в стерильные пробирки по 5—7 см3 (от пушных зверей — по 1—2 см3). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

6.1.1    Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 °С—38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8—10 ч. сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 °С—10 °С. Через 20—24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3—4 ч и повторно через 10—12 ч).

6.1.2    Консервирование сывороток проводят:

-    добавлением 0,05 см3 (1 капля) 5 %-ного раствора фенола на 1 см3 сыворотки при тщательном перемешивании;

-    сухой борной кислотой (3—4 % к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

-    путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2 °С до 8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут. замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.

6.2    Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут из каждой доли вымени одного удоя в одну бактериологическую пробирку в количестве 10—15 см3. При этом если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и др.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

6.2.1    Молоко исследуют свежее или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10 %-ного раствора формалина на 5 см3 молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2—3 сут. Перед исследованием молоко тщательно перемешивают для равномерного распределения сливок.

6.2.2    При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

6.2.3    Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т. к. антиген обесцвечивается.

6.3    На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.

5

7 Методы серологической диагностики бруцеллеза

7.1    Сущность методов заключается в выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.

7.2    Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)

7.2.1    Сущность метода

Сущность метода заклинается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.

7.2.2    Подготовка к исследованию

7.2.2.1    Приготовление 5 %-ного раствора хлорамина

Для приготовления 5 %-ного раствора хлорамина 5 г хлорамина растворяют в 100 см3 водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.

Примечание — Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним

7.22.2    Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.

Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30—40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.

Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18 °С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.

7.2.3    Проведение исследования

7.2.3.1    РБП применяют как экспресс-метод диагностики бруцеллеза у не иммунизированного про-тивобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота, овец, коз, верблюдов, лошадей, северных оленей (маралов), свиней и собак.

Для исследования применяют тест-системы, используемые для диагностики бруцеллеза животных в РБП.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 см3 (две капли) вносят на дно лунки при помощи шприца-полуавтомата. или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником.

7.2.3    2 После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным 0,85 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена, или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником вносят 0.03 ал3 антигена (две капли), а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов), свиней и собак — 0.015 с»л3 антигена (одну каплю). Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают 0.85 %-ным фенолизированным раствором хлористого натрия по 7 4 2 и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.

Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0.03 см3 0.85 %-ного фенолизированного раствора хлористого натрия добавляют 0.03 см3 роз бенгал антигена).

По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5 %-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37 °С—38 °С и используют повторно.

ГОСТ 34105-2017

7.2.4 Обработка результатов

Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).

При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП, исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК). или в РА и РИД. или в РИГА, или в ИФА, или в ИХА

7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком

Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.

КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.

Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.

7.3.1    Подготовка к исследованию

Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР), используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.

7.3.2    Проведение исследования

В пробирки вносят по 2 см3 молока пипеткой или дозатором. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теплой водопроводной водой. Антиген вносят по 0.1 см3 в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в пробирки одного ряда штатив энергично встряхивают и т. д. После внесения антигена во все пробирки штатив встряхивают дополнительно.

При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:

-    молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);

-    смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0.1 см3 сыворотки на 2 см3 молока).

Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37 *С—38 °С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.

Результаты реакции учитывают визуально через 30—40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:

«♦♦♦» (три креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

(два креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;

«♦» (один крест) — синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет:

«-» (минус) — столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок — белого или слегка желтоватого цвета.

7.3.3    Обработка результатов

Все пробы молока с оценкой в «♦++» (три креста) и е++» (два креста) считают положительными. «♦» (один крест) — сомнительными.

7

1

Группу патогенности устанавливают в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт

3