Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

17 страниц

396.00 ₽

Купить ГОСТ 27318-87 — официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Настоящий стандарт устанавливает бактериоскопический, культуральный, биохимический, биологический и серологический методы идентификации атипичных микобактерий.

Стандарт пременяют при идентификации атипичных микобактерий в ветеринарных лабораториях научно-исследовательских учреждений и республиканских производственных ветеринарных лабораториях

  Скачать PDF

Ограничение срока действия снято: Протокол № 2-92 МГС от 05.10.92 (ИУС 2-93)

Оглавление

1 Бактериоскопический метод

2 Бактериологический метод

3 Биохимический метод

4 Биологический метод для дифференциации М. avium от М. intracellulare

5 Серологический метод

Приложение Основные свойства видов или комплексов микобактерий

Показать даты введения Admin

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ стандарт

СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ АТИПИЧНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ

ГОСТ 27318-87 (СТ СЭВ 5627-86)

Издание официальное

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ

Москва

УДК 636:576.8.07:006.354    Группа    С79

ГОСТ

27318-87

tCT СЭВ 5627—86)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

Методы идентификации атипичных микобактерий

Agricultural animals.

Methods of identification of non-typical microbacteria

ОКСТУ 9809

Срок действия с 01.01.88 до 01.01.93

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт устанавливает бактериоскопический, культуральный, биохимический, биологический и серологический методы идентификации атипичных микобактерий.

Стандарт применяют при идентификации атипичных микобактерий в ветеринарных лабораториях научно-исследовательских учреждений и республиканских производственных ветеринарных лабораториях.

1. БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД

1.1.    Сущность метода заключается в способности микобактерий, окрашенных фуксином, удерживать краситель после длительного обесцвечивания в соляно-кислом спирте.

1.2.    Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют;

микроскопы биологические марки МПИ или МРП по ГОСТ 8284-78;

осветитель;

горелку газовую или спиртовую;

стекла предметные;

часы песочные на 5 мин;

петли бактериологические;

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

пинцет;

Издание официальное

бумагу фильтровальную;

Перепечатка воспрещена

© Издательство стандартов, 1987

С. 10 ГОСТ 27318-87

среду Левенштейна-Иенсена по п. 2.2; воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

3.7.2.    Проведение испытания

К 100 см3 питательной среды Левенштейна-Иенсена прибавляют 5 г хлористого натрия и хорошо смешивают перед свертыванием среды. Затем питательную среду разливают по 3—3,5 см3 в бактериологические пробирки. Подобным способом готовят и контрольные пробирки со средой, не содержащей хлористого натрия.

На питательную среду, содержащую хлористый натрий, и на среду без него высевают по 0,2 см3 исследуемой культуры плотностью 2—3 мг/см3.

Культуру сначала инкубируют при 35°С с ослабленной пробкой до испарения влаги с поверхности питательной среды, затем пробирки плотно закрывают и продолжают инкубацию в течение 6 недель.

3.7.3.    Оценка результатов

Если в течение указанного времени появляется более 50 колоний на питательной среде, содержащей хлористый натрий, культуру считают толерантной, если менее 50 колоний — резистентной к содержанию хлористого натрия.

В контрольных пробирках должен быть хороший рост культур в виде множественных сливающихся колоний.

4. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ

М. avium от М. intracellulare

4.1.    Сущность метода заключается в воспроизведении туберкулеза при введении кроликам и курам культур М. avium.

4.2.    Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

микроскопы биологические марки МБИ или МРБ по ГОСТ 8284-78; осветитель;

горелку газовую или спиртовую;

часы песочные по 5 мин;

шприцы вместимостью 1—2 см3;

иглы инъекционные;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

флаконы стеклянные вместимостью 10 см3;

петли бактериологические;

бумагу фильтровальную;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77 „ч.д.а., раствор с массовой долей 0,85%;

ГОСТ 27318-87 С. 11

туберкулин для птиц; культуры микобактерий; фенол по ГОСТ 6417-72;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;

фуксин карболовый по п. 1.2;

масло иммерсионное по ГОСТ 13739-79;

ксилол по ГОСТ 9410-78 или бензин авиационный;

метиленовую синь;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

4.3.    Подготовка к испытанию

Приготавливают взвесь из культуры микобактерий, ранее отнесенной по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам к комплексу avium-intracellulare. Бактерийную массу в количестве 8—10 мг снимают шпателем с поверхности плотной питательной среды и переносят в стерильный флакон с резиновой пробкой, предварительно взвешенный на аналитических весах. Затем флакон вновь взвешивают и по разности между первой и второй массой флакона определяют массу взятой культуры. Во флаконы добавляют раствор хлористого натрия с массовой долей 0,85% из расчета 1 см3 на 1 мг бактерийной массы.

4.4.    Проведение испытания

Для постановки биологической пробы берут двух кроликов массой 2000 г и двух кур в возрасте 5 мес, не реагирующих на введение туберкулина.

Взвесь культуры в дозе 1 см3 вводят кроликам в краевую вену уха, курам — в подкрыльцовую вену.

За лабораторными животными, которым введена испытуемая культура, устанавливают наблюдение в течение 90 сут.

При развитии туберкулезного процесса у кроликов и кур после введения им взвеси культуры наблюдается истощение, снижение аппетита. В случае отсутствия падежа животных убивают через 90 сут. Павших или убитых животных вскрывают и проводят осмотр внутренних органов. Из органов готовят мазки по п. 1.3. Просмотр мазков проводят с помощью иммерсионной системы микроскопа.

4.5.    Оценка результатов

Микобактерии птичьего вида у кроликов вызывают сепсис (тип Йенсена), характеризующийся резким увеличением селезенки. При этом гибель животного наступает через 13—30 сут.

М. avium при внутривенном заражении кур вызывают в большинстве случаев гибель их в течение 30 сут. Иногда куры выживают от 10 до 90 сут. На вскрытии павших или убитых кур обнаруживают много серо-желтых бугорков в печени и селезенке, а в мазках из них — значительное количество микобактерий туберкулеза.

С. 12 ГОСТ 27318-07

5. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

5.1.    Сущность метода заключается в определении сероваров М. avium и М. intracellulare в реакции прямой агглютинации (РА) по методу Шефера с гипериммунными сыворотками, дающими положительные результаты с гомологичными антигенами.

5.2.    Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют: пластинки плексиглазовые с лунками; штативы;

пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 5 и 10 см3 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74; рН-метр 340;

раствор буферный фосфатный, pH 7,1;

гипериммунные кроличьи сыворотки* комплекса avium-intracel-lulare различных сероваров;

фенол по ГОСТ 6417-72, водный раствор с массовой долей 0,5%;

антигены — живые культуры микобактерий; воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72,

5.3.    Подготовка к испытанию

Для серологической реакции используют культуры микобактерий, выросших в S форме.

В качестве антигена для реакции агглютинации применяют бактерийную массу культур микобактерий, выращенную на питательной среде в течение 21 сут.

Антиген готовят на фосфатном буферном растворе накануне проведения испытания в концентрации 0,3 мг/см3 с добавлением 0,5%-ного водного раствора фенола. Гипериммунные сыворотки разводят в рабочем разведении на том же растворе.

5.4.    Проведение испытания

Для каждой культуры микобактерий берут по две разные сыворотки одинакового серовара. Разведенные сыворотки сероваров микобактерий комплекса avium-intracellulare в рабочем титре разливают в дозе 0,5 см3 в лунки вертикального ряда, за исключением последней лунки, которая служит для контроля. В горизонтальные ряды гнезд разливают по 0,5 см3 взвеси определяемых культур микобактерий.

В контрольные лунки наливают по 0,5 см3 фосфатного буфера и по 0,5 см3 взвеси микобактерий.

Пластинки без встряхивания помещают в термостат и инкубируют при 37°С в течение 20 ч.

Учет реакции проводят через 4 и 20 ч.

5.5.    Оценка результатов Результаты реакции оценивают в крестах:

ГОСТ 17318-87 С. 13

4 креста — все агглютинационные частицы в виде зонтика осаждены на дно лунки, а надоеадочная жидкость совершенно прозрачна;

3 креста — на дне лунки образовался агглютинационный зонтик, а в надосадочной жидкости наблюдается некоторая опалесценция;

2 креста — агглютинационные частицы находятся в жидкости;

1 крест — имеются следы агглютинации;

контроль— агглютинация отсутствует.

Положительной реакцией считают агглютинацию, выраженную в 4 или 3 креста, сомнительной — 2 или 1 крест и отрицательной — отсутствие агглютинации.

Схема изучения микобактерий и основные свойства видов или комплексов микобактерий приведены в приложении.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Обязательное


п


Таблица I

Основные свойстве видов или комплексов микобактерий

Наименование показателя

Наименование видов и комплексов микобактерий

М. tuberculosis

м

>

о

d

М. kansasll

М. marinum

eg

I

00

d

В

3

О»

о

£

Ч--

О

w

О)

со

d

М. gordonae

— -

М. xenopl

М. avlum-lntra-cellulare

М. nonchromoge-nlcum

■*-

ф

«в

d

M. vaccae

s

3

3

w

О

d

M. cheloncl

M. flavescens

w

О

ai

x:

Q.

О

c

H

eg

JH

•«-»

'd

M. phlei

M. dlernhoferi

M, smegmatis

1. Скорость роста

21-60

42—70

10-30

10—30

10—20

о

L

О

10-20

1C—20

11-30

10-30

10—20

2—7

3-7

3-7

3—7

3—7

3—7

3-7

3-

-7

2. Рост на среде Левен-

штейна-Йенсена:

при 25°С

__

+

±

+

+

+

-f

4

+

4

4-

4-

4-

4-

4

4

при 37°С

+

+

4~

4-

+

+

4-

4

4-

+

4-

+

4

+

при 45°С

±

4

4

3. Форма колоний

R

R

R

R

R

S

S

R

S

R

s

s

R

R

S

S

R

S

S

4. Рост на ЛШБ при 37°С

+

+

+

+

+

+

+

+

+

4-

4-

4-

4

4-

4-

+

4-

5. Окраска

Ф

Ф

Ф

С

С

С

Ф/С

c

c

6. Редукция нитратов

4-

4

+

+

±

4

4-

4

±

4

7. Аккумуляция железа

+

4-

4-

4-

4

8. Рост на среде с 5% хло-

=F

4-

+

+

4

4-

ристого натрия

9. Активность каталазы

+

+

4-

+

±

+

+

4-

+

4-

Примечание. Буквы означают: Ф — фотохромоген ная окраска (пигмент); С — скотохромогенная окраска (пигмент); R — шероховатая форма колоний; S — гладкая форма колоний.

Знак «+» означает показатель положительный; «—»— отрицательный;    — преимущественно отрицатель

ный; «±» — преимущественно положительный,



Таблица 2

Схема изучения микобактерий

Атипичные микобактерии (группы по Раньону)

W

О

I

II

III

IV

Наименование показателя

3

CJ

ь.

0)

а

5

£

М. bovis

м.

kansasii

М.

marinum

М.

serofula-

сешп

М.

gordonae

Комплекс

avium

Intracellulare

Комплекс

nonchromo-

genicum

Быстро

растущие

микобактерии

(Кислотоустойчивые

палочки)

1. Бактериоскопия

+

+

+

+

+

+

Н™

+

+

2. Рост на среде Левен-

+

+

+

±

±

+

штейна-Иенсена: при 25°С

при 37°С

+

+

+

±

+

+

+

+

+

при 45°С

■—

±

н-

3. Рост на МПБ: придонный

...

+

+

нь

поверхностный

Т

+

■—

4. Пигментообразование; на свету

_

+

+

+

±

в темноте

+

+

+

-—

5. Редукция нитратой

+

+

■—

+

■—

+

6. Активность каталазы

+

+

+

±

+

Примечание. Знак «+> означает показатель положительный;    «—»— отрицательный; «=Р»— преиму

щественно с^трицательный; — преимущественно положительный.

С. 16 ГОСТ 27318-87

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Госагропромом СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

Н. П. Овдиенко, канд. вет. наук (руководитель темы); А. М. Кадочкин, канд. вет. наук; В. И. Косенко, канд. вет. наук; В. А. Шаров, канд. вет. наук; А. Н. Шаров, канд. вет. наук; В. С. Тырина, канд. биол. наук; Б. И. Антонов; Э. С. Плотников; А. В. Ткаченко-Кузьмин, канд. вет. наук

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 02.06.87 № 1797.

3.    СРОК ПРОВЕРКИ — 1992 г.

ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПРОВЕРКИ — 5 ЛЕТ

4.    СТАНДАРТ ПОЛНОСТЬЮ СООТВЕТСТВУЕТ СТ СЭВ 5627—86

5.    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

Номер пункта, подпункта, 'Перечисления, приложения

I

ГОСТ 429-76

3.6.2

ГОСТ 1770-74

2.2, 3.3.2, 3.4.2, 3.6.2. 3.7.1

ГОСТ 3118-77

1.2, 3.3.2

ГОСТ 4198-75

2.2, 3.3.2

ГОСТ 4233—?7

2.2, 3.7.1, 4.2

ГОСТ 4328-77

1.2, 3.6.2

ГОСТ 4530-76

3.6.2

ГОСТ 5962-67

1.2, 2.2, 4.2

ГОСТ 6259-75

1.2, 2.2

ГОСТ 6417-72

1.2, 3.6.2, 4.2, 5.2

ГОСТ 6709-72

1.2, 2.2, 3.3.2, 3.4.2, 3.6.2, 3.7.1, 4.2,

5.2

ГОСТ 8284-78

1.2, 4.2

ГОСТ 9284-75

4.2

ГОСТ 9410-78

1.2, 4.2

ГОСТ 11773-76

3.3.2

ГОСТ 13739-78

1.2, 4.2

ГОСТ 20292-74

2.2, 3.4.2, 3.7.1, 5.2

ГОСТ 23683-79

2.2

ГОСТ 24104-80

1.2, 2.2, 3.6.2, 3.7.1, 4.2

ГОСТ 24204-80

3.3.2, 3.6.2

ГОСТ 24363-80

1.2

Редактор А. А. Зимовнова

Технический редактор О. Н. Никитина

Корректор Е.

И. Евтеева

Сдало в наб 25.06.87 Подп. к печ. 03.09,87 1,0 уел. п. л. l,13i уел. кр.-отт. 1,05 уч.-изд. л.

Тир. 4000

Цена 5 коп.

Ордена «Знак Почета» Издательство стандартов, 123840, Москва ГСП, Новопресненский пер., 3 Тип. «Московский печатник» Москва, Лялин пер., 6. Зак. 883

С. 2 ГОСТ 27*18—87

фенол по ГОСТ 6417-72;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67; кислоту соляную концентрированную по ГОСТ 3118-77, х.ч. или ч.д.а;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а.; калия гидроокись по ГОСТ 24363-80, ч.д.а.; фуксин основной; глицерин по ГОСТ 6259-75; масло иммерсионное по ГОСТ 13739-78; ксилол по ГОСТ 9410-78 или бензин авиационный; фуксин Циля карболовый, раствор; готовят следующим образом: 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и ОД см3 этилового спирта. После растирания краски прибавляют при постоянном помешивании 90 см3 дистиллированной воды. Раствор краски через 24 ч фильтруют через бумажный фильтр.

Карболовый раствор фуксина хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой, метиленовую синь; культуры микобактерий;

соляно-кислый спирт, раствор с массовой концентрацией соляной кислоты 3%; готовят следующим образом: 3 см3 концентрированной соляной кислоты добавляют к 97 см3 96%-ного этилового спирта;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

1.3. Проведение испытаний

Из отдельной колонии изучаемой культуры готовят тонкий мазок на предметном стекле, который высушивают при комнатной температуре и фиксируют над пламенем. На фиксированный препарат кладут узкую полоску фильтровальной бумаги, закрывающую мазок полностью.

На полоску фильтровальной бумаги наливают карбол фуксина Циля и нагревают до появления паров (два-три раза) в течение 5 мин (не доводя краску до кипения). Раствор краски при этом каждый раз добавляют. Дают препарату остыть, удаляют пинцетом бумагу, сливают избыток красителя и препарат промывают проточной водой.

Для обесцвечивания на предметное стекло наливают раствор соляно-кислого спирта до тех пор, пока он без окрашивания будет стекать с предметного стекла.

После обесцвечивания препарат тщательно промывают водой и окрашивают метиленовой синью в течение 3—5 мин. Затем препарат промывают водой, высушивают на воздухе и просматривают в световом микроскопе с иммерсией.

ГОСТ 27318-87 С. 3

1.4. Оценка результатов

Нахождение в поле зрения микроскопа кислотоустойчивых микобактерий и отсутствие посторонних микроорганизмов является показателем чистоты испытуемой культуры.

У быстрорастущих культур микобактерий IV группы по Раньону наряду с кислотоустойчивыми встречаются и некислотоустойчивые формы микобактерий.

2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

2.1.    Сущность метода заключается в получении при пересевах единичных колоний, определении морфологии и характера роста микобактерий на питательных средах.

2.2.    Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80; горелку газовую или спиртовую; петли бактериологические;

термостат с автоматическим регулированием температуры; автоклав электрический с рабочим давлением 0,15 МПа (1,5 кгс/см2);

шкаф сушильный электрический для стерилизации лабораторного стекла с диапазоном изменения температуры от 50 до 220°С;

аппарат Коха для стерилизации питательных сред текучим паром;

рН-метр 340;

аппарат для встряхивания;

центрифугу лабораторную с частотой вращения 3000 мин”1; лупу с увеличением 3х и 5х;

штативы металлические для пробирок диаметром 16 мм; пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74; пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74; палочки стеклянные; пробки ватно-марлевые;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, ч.д.а, раствор с массовой долей 0,85%;

магний лимоннокислый, ч.д.а.;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, ч.д.а.;

магний сернокислый, ч.д.а.; парафин по ГОСТ 23683-79;

L-аспарагин;

глицерин по ГОСТ 6259-75;

малахитовая зелень, раствор с массовой долей 2%; спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67 с массовой долей 96 и 70%;

С. 4 ГОСТ 27318-87

среду Левенштейна-Иенсена; готовят следующим образом: 2,4 г однозамещенного фосфорнокислого калия, 0,24 г магния сернокислого, 0,6 г магния лимоннокислого, 3,6 г L-аспарагина, 12 смглицерина растворяют в указанной последовательности в 600 смводы при слабом подогревании и стерилизуют в течение 2 ч текучим паром. К раствору добавляют 100 см3 яичной массы. Смесь фильтруют через марлевый фильтр, добавляют 200 см3 стерильного 2%-ного раствора малахитовой зелени и разливают в пробирки приблизительно по 5 см3. Свертывание проводят при 85°С в течение 45 мин.

Яичную массу готовят из свежих диетических яиц, вымытых проточной теплой водой щеткой с мылом. Вымытые яйца погружают на 30 мин в 70%-ный спирт, а затем над спиртовкой в боксе разбивают стерильным пинцетом в колбу со стеклянными шариками и хорошо перемешивают;

бульон мясо-пептонный (МПБ);

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

Примечания:

I. Для контроля стерильности указанные среды помещают в термостат с температурой 37—38°С на 2 сут.

2 При посевах используют среды, приготовленные не более чем за 14 сут. до испытания.

2Г3. Проведение испытания

С целью получения единичных колоний и учета скорости роста при разных температурных режимах, а также характера роста на мясо-пептонном бульоне с поверхности отдельной колонии берут 2—5 мг испытуемой культуры микобактерий и помещают в стерильную пробирку с 1—2 см3 раствора хлористого натрия с массовой долей 0,85%.

Взятую массу микобактерий растирают стеклянной палочкой по стенке пробирки и добавляют раствор хлористого натрия до концентрации 1 мг/см3.

Взвесь культуры микобактерий высевают с помощью пипетки диаметром 3—4 мм в пять пробирок со средой Левенштейна-Иенсена и в две пробирки с мясо-пептонным бульоном. Обе пробирки с мясо-пептонным бульоном и одну пробирку со средой Левенштейна-Иенсена инкубируют при 37—38°С. По одной пробирке со средой Левенштейна-Иенсена инкубируют при 25 и 45°С. Две оставшиеся пробирки со средой Левенштейна-Иенсена ставят в термостат при 37—38°С для изучения пигментообразования.

Учет роста при различных температурах оценивают, разместив пробирки с питательными средами, инкубированными при различных температурах, рядом друг с другом, и сопоставив развитие отдельных колоний.

При оценке регистрируют, на какой питательной среде и в какой срок появляется колония бактерий, и какова ее пигментнро-ванность.

ГОСТ 27318-87 С. 5

2.4. Оценка результатов

Колонии, выросшие на среде Левенштейна-Йенсена до 7 сут, а также образовавшие в течение этого срока на мясо-пептонном бульоне кольцо или пленку относят к группе IV по Раньону.

Колонии, развившиеся в сроки свыше 7 сут, относят к группам I, II и III по Раньону.

Культуры М. bovis или М. tuberculosis растут медленнее (от 21 до 70 сут).

Медленно растущие скотохромогенные микобактерии и микобактерии комплекса aviurn-intracellulare образуют придонный рост, а микобактерии комплекса nonehromogenicum преимущественно образуют кольцо или пленку на поверхности среды в более поздние сроки.

3. БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД

3.1.    Сущность метода заключается в определении вида культуры или отдельного комплекса микобактерий на основании изучения их биохимических свойств путем применения отдельных тестов.

3.2.    Тест — пигментообразование

3.2.1.    Сущность теста заключается в образовании культурой пигмента в различных условиях: в темноте и на свету.

Исследованию подвергаются только медленно растущие культуры.

3.2.2.    Средства испытаний

Для проведения испытаний применяют:

лампу электрическую мощностью 100 Вт;

термостат с автоматическим регулированием температуры;

бумагу светонепроницаемую;

культуры микобактерий;

среду Левенштейна-Иенсена по п. 2.2;

бульон мясо-пептонный.

3.2.3.    Проведение испытания

Микробную массу в разведении соответственно 10-4,    10~5 и

10*^ вносят в две пробирки питательных сред. Одну пробирку с питательной средой инкубируют, завернув ее в светонепроницаемую бумагу, при полном отсутствии света при температуре 25, 37 и 45°С в течение трех недель. Другую пробирку подвергают освещению в течение 1 ч на расстоянии 1 м от источника света мощностью 100 Вт и инкубируют в течение 7 и 12 сут при тех же температурных режимах и сроках.

По истечении трех недель регистрируют выросшие на двух питательных средах колонии и их пигментированность.

3.2.4. Оценка результатов

Если колонии за время инкубирования выделили пигмент, то культуру относят к группе I по Раньону (фотохромогенная группа). Если культура образовала пигмент при полном отсутствии света, то ее относят к группе II по Раньону (скотохромогенная).

Если культура не выделила пигмента, то ее относят к группе III по Раньону (нефотохромогенная группа).

3.3. Тест — редукция нитратов

3.3.1.    Сущность теста заключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного из нитрата нитрита, определении микобактерий по изменению окраски.

3.3.2.    Средства испытаний Для проведения испытаний применяют: лопатку платиновую;

термостат с автоматическим регулированием температуры; автоклав электрический с рабочим давлением 0,15 МПа (1,5 кгс/см2);

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24204-80; рН-метр 340;

пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74; натрий фосфорнокислый двухзамещенный по ГОСТ 11773-76, ч.д.а.;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, ч.д.а.;

парадиметиламинобензальдегид, раствор с массовой долей 2% в растворе соляной кислоты с массовой концентрацией 10%;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, х.ч. или ч.д.а.; раствор с массовой концентрацией соляной кислоты 10%; воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

3.3.3.    Подготовка к испытанию

Готовят фосфатный буферный раствор следующим образом: растворяют 9,47 г двухзамещенного фосфорно-кислого натрия в 1 дм3 воды (раствор 1);

растворяют 9,05 г однозамещенного фосфорно-кислого калия в 1 дм3 воды (раствор 2).

Для получения 100 см3 фосфатного буфера к 61,1 см3 раствора 1 добавляют 38,9 см3 раствора 2 (pH 7,0). Полученный раствор разливают по 4 см3 в пробирки и при 120°С автоклавируют в течение 15 мин. Раствор помещают в термостат при 37°С на 24 ч, после чего проверяют на стерильность.

3.3.4.    Проведение испытания

В 1 см3 фосфатного буфера суспензируют 10 мг (одна платиновая лопатка) испытуемой культуры и инкубируют при 37—38°С в течение 15—16 ч.

ГОСТ 27318-87 С. 7

Образование нитрата проверяют добавлением 2 капель раствора парадиметиламинобензальдегида.

3.3.5. Оценка результатов

Появление желтой окраски свидетельствует о положительной реакции. Для контроля используют виды микобактерий, дающие положительную и отрицательную реакцию на редукцию нитратов. 3.4. Тест — активность каталазы

3.4.1.    Сущность теста заключается в способности клеток микобактерий образовывать в процессе роста фермент каталазу, количество которой различно у разных видов микобактерий. Каталаза разлагает перекись водорода на воду и молекулярный водород.

3.4.2.    Средства испытаний Для проведения испытаний применяют: линейку измерительную;

пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 5 см3 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74; петлю бактериологическую;

пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;

культуры микобактерий;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

3.4.3.    Проведение испытания

В пробирку с культурой, выращенной на среде Левенштейна-Иенсена при 37°С и имеющей не менее 10 мг бактериальной массы, вносят разбавленную в соотношении 1 : 1 водой перекись водорода в таком количестве, чтобы при наклонном положении она полностью покрывала культуру микобактерий. Имеющееся в пробирке до внесения раствора незначительное количество конденсационной жидкости не удаляют.

Оценку реакций проводят по интенсивности образования пузырьков кислорода, образующихся в течение 5 мин после добавления раствора к культуре, и измеряют высоту столбика пены в миллиметрах при вертикальном положении пробирки.

3.4.4.    Оценка результатов

Положительной реакция считается, если образуется столбик пены высотой 45 мм и более, отрицательный—если высота столбика пены менее 45 мм или если не происходит образования пузырьков кислорода в течение 5 мин.

3.5. Тест — аккумуляция железа

3.5.1.    Сущность теста заключается в способности испытуемых культур изменять свой цвет при воздействии лимонно-аммиачного железа.

3.5.2.    Средства испытаний Для проведения испытаний применяют:

термостат с автоматическим регулированием температуры; петлю бактериологическую; железо лимонно-аммиачное;

культуры микобактерий;

среду Левенштейна-Йенсена по п. 2.2.

3.5.3.    Проведение испытания

К питательной среде Левенштейна-Йенсена добавляют лимонно-аммиачное железо в таком количестве, чтобы конечная концентрация его составляла 2%. На эту среду высевают испытуемые культуры и выдерживают в течение 7 сут при температуре 37°С.

3.5.4.    Оценка результатов

Реакция считается положительной, если культуры окрашиваются в коричневый цвет, отрицательной — если культура остается прежнего цвета.

3.6. Тест — амидазная активность

3.6.1. Сущность теста основана на дезаминировании амидов и выделении аммиака, определяемого специальными реактивами.

3.5.4.    Оценка результатов

Для проведения испытаний применяют: автоклав;

культуры микобактерий; петлю бактериологическую;

пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74; аппарат Коха;

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80; фильтр Зейтца;

марганец сернокислый по ГОСТ 429-76, ч.д.а.; фенол по ГОСТ 6417-72;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., раствор с массовой долей 0,5%;

гипохлорит кальция, ч.д.а., раствор с массовой долей 1%; кальций углекислый по ГОСТ 4530-76, ч.д.а., раствор с массовой долей 20%;

реактив Русселя, состоящий из трех компонентов (раствора сульфата марганца, фенолового раствора и раствора гипохлорита кальция). Компоненты готовят следующим образом:

раствор сульфата марганца — 66,9 мг сульфата марганца растворяют в 100 см3 воды;

феноловый раствор—12,5 г фенола в 5 см3 воды взбалтывают и приливают 25 см3 раствора гидроокиси натрия с массовой долей 0,5%, взбалтывают до полного растворения фенола и доводят объем водой до 50 см3;

раствор гипохлорита — к 300 см3 нагретой до 90°С воды прибавляют 25 г гипохлорита кальция, взбалтывают и прибавляют 135 см3 раствора углекислого кальция с массовой долей 20%. Доводят до кипения на несколько минут, чтобы дать аммиаку улетучиться. Полученный раствор охлаждают и доводят объем водой до 500 см3.

ГОСТ 27318-87 С. 9

амидный ряд: ацетамид, бензамид, карбамид, изоникотинамид, никотинамид, пиразинамид, салициламид, аллантоин, сукцинамид, мелонамид;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

3.6.3.    Проведение испытания

Из каждого амида готовят раствор из расчета 400 мг/см3, стерилизуют в течение 20 мин при 100°С, а карбамид — фильтрацией через фильтр Зейтца.

0,5 см3 взвеси испытуемых микобактерий плотностью 20 мг/см3 разливают в три ряда стерильных пробирок (по 10 пробирок в каждом ряду).

10 пробирок из первого ряда в течение 20 мин выдерживают при 100°С для инактивации бактерий. Затем в три пробирки каждого вертикального ряда добавляют последовательно перечисленные амиды в количестве 0,5 см3. Пробирку инкубируют в течение 10 ч при 37°С, а затем в каждую пробирку вносят растворы реагентов в следующей последовательности:

а)    0,2 см3 сернокислого марганца;

б)    2,0 см3 раствора фенола;

в)    1,0 см3 раствора гипохлорита натрия с массовой долей 1%. После внесения растворов реагентов пробирки хорошо встряхивают и выдерживают в течение 20 мин при 100°С. Учет реакций проводят через 60 и 90 мин.

3.6.4.    Оценка результатов

Реакцию оценивают визуально и считают положительной, если в пробирке образуется сине-зеленое окрашивание.

3.7. Тест — рост на среде с содержанием хлористого натрия с массовой долей 5%

Сущность теста основана на способности атипичных быстрорастущих микобактерий (IV группа по Раньону) и М. triviale (III группа по Раньону) расти на среде, содержащей хлористый натрий.

3.7.1. Средства испытаний Для проведения испытаний применяют:

термостат с автоматическим регулированием температуры; горелку газовую или спиртовую;

весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;

пробирки бактериологические стеклянные вместимостью 10 см3 по ГОСТ 1770-74;

бактериологические петли;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, раствор с массовой долей 5%;