МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СПОР МЕЗОФИЛЫ1ЫХ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
Издание официальное
ИПК ИЗДАТЕЛЬСТВО СТАНДАРТОВ Москва
УДК 637.12.04.576.8:006.354 Группа 1119
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МОЛОКОМ МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ
Методы определения содержания спор мсюфильныч анаэробных бактерий
Milk and milk products.
Methods for determination of the spores content of mcsophilic anaerobic bacteria.
M КС 07.100.30 67.100.10 ОКСТУ 9209
Дата введения 01.07.91
Настоящий стандарт распространяется на сырое и подвергнутое тепловой обработке молоко, сыры и устанавливает методы определения в них содержания спор мезофильных анаэробных бактерий.
Методы основаны на высеве определенного количества прогретых при температуре (75±1) 1 2С в течение (30±3) мин проб молока или сыре» в плотные или жидкие питательные среды, культивировании посевов в течение 72 ч при температуре (37± I) 2С. регистрации видимых признаков роста микроорганизмов. определении их наиболее вероятного чиста.
1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ
1.1. Отбор проб и подготовка их к анализу — по ГОСТ 13928. ГОСТ 9225. ГОСТ 26809.
2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА СПОР МЕЗОФИЛЬНЫХ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
Метод основан на способности мезофильных анаэробных бактерий, содержащихся в образцах молока и сыра, размножаться и давать видимые признаки роста в питательных средах.
2.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Анализатор потенциометрический, класс точности 1,5 по ГОСТ 19881.
Баня водяная.
Весы лабораторные 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г и пределом допускаемой погрешности ±15 мг по ГОСТ 241042.
Вссмдтя статического взвешивания среднего класса точности с наибольшим пределом взвешивания 10 кг по ГОСТ 29329.
Допускается применение других весов с метрологическими характеристиками не ниже указанных.
Воронки лабораторные по ГОСТ 25336.
Кастрюли разные по ГОСГ 17151.
Колбы плоскодонные исполнения I или 2, вместимостью 50, 100. 250, 500, 1000, 2000 см2 но ГОСТ 25336.
Пипетки 1-го или 2-го классов точности исполнения I. вместимостью 1.2 см’, исполнения 4. 5. 6, 7, вместимостью 1, 2. 5, 10 см1 по ГОСТ 29169.
Плитка электрическая по ГОСТ 14919.
Пробирки типов П1, 112 диаметром 16 мм, высотой 150 мм и диаметром 21 мм, высотой 200 мм по ГОСТ 25336.
Пробки корковые по Г ОСГ 5541.
Пробки резиновые конусные но ТУ 38 1051835.
• С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.
ГОСТ 25102-90 С. 2
Секундомер механический и часы по нормативно-технической документации.
Скальпели и ножи медицинские по ГОСТ 21240.
Спиртовки лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336 или горелки газовые.
Стаканчики для взвешивания типов СВ и СМ по ГОСТ 25336.
Стерилизатор воздушный по ГОСТ 22649.
Стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ 195693 или аналогичный стерилизатор, обеспечивающий требуемые технологические режимы.
Термометры стеклянные жидкостные (нертутные) с диапазоном измерения 0—100 ‘С и иеной деления I 3С по ГОСТ 28498.
Термостат, позволяющий поддерживать температуру от 25 до 55 ’С с отклонением от заданной температуры ± I ’С.
Цилиндры исполнения I или 2. вместимостью 10. 25. 100 и 1000 см’ по ГОСТ 1770.
Чашки Петри по ГОСТ 25336.
Шпатели.
Штатив для пробирок.
Автолнзат дрожжевой сухой по ТУ 6—09—3979.
Агар микробиологический по ГОСТ 17206.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Вода питьевая по ГОСТ 28744.
Глюкоза кристаллическая гндратная по ГОСТ 975.
Дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСГ 171.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.
Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Молоко сухое обезжиренное по ГОСТ 10970.
Среда агаровая модифицированная для определения споровых анаэробных бактерий в молоке и молочных продуктах по ТУ 49 513.
Кислота аскорбиновая пищевая по ГФ СССР, X, ст. 6.
Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199. ч. д. а.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233, ч. д. а.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.
Панкреатин медицинский активностью 50 ед. в I г по ТУ 49.619.
Хлороформ технический по ГОСТ 20015.
Цистеин солянокислый по ТУ 6—09—3251.
2.2. Подготовка к анализу
2.2.1. Подготовка аппаратуры и материалов — по ГОСТ 9225.
2.2.2. Приготовление сред
2.2.2.1. Приготовление раствора хлористого натрия
В 1 дм’ питьевой воды растворяют 8.5 г хлористого натрия, затем раствор рахливают в чистые стеклянные пробирки диаметром 21 мм по 10 см\ а в колбы по 93 см\ емкости хакрывают ватной пробкой и стерилизуют при температуре (121 ±2) °С в течение (20±5) мин. После стерилизации должно остаться в пробирках около 9 см\ а в колбах около 90 см' раствора хлористого натрия.
2.2.2.2. Приготовление дрожжевого а в т о л и з а т а
I кг хлебопекарных дрожжей разводят в I дм’ питьевой волы и помешают в термостат при температуре (55±1) °С на 72 ч. Полученную суспензию переносят в стерилизатор и выдерживают при температуре (115±2) 3С 15 мин. Автолизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Осадок промывают таким количеством питьевой воды, чтобы общее количество фильтрата составило 4 дм’.
Фильтрат нейтрализуют раствором с массовой долей гидроокиси натрия 20% до pH (6,8±0.1). рахливают в пробирки диаметром 21 мм по (32±3) см', хлкрывают ватной пробкой и стерилизуют при температуре (121 ±2) 3С втеченне (20±5) мин.
2.2.2.3. Приготовление гидролизованного молока
Готовят восстановленное обезжиренное молоко с массовой долей сухих веществ 10%, для чего 100 г сухого обезжиренного молока растворяют в 900 см' подогретой до температуры (45± I) 3С дне-
тиллированной волы. pH (7,6±0,2) восстановленного обезжиренного молока, подогретого до температуры (45±1) *С. устанавливают раствором с массовой долей гидроокиси натрии 20%. К подготовленному молоку добавляют от 0,5 до 1.0 г панкреатина, предварительно разведенного в 20—30 см' дистиллированной воды температурой (45±1)*С. Через 3—5 мин к молоку с панкреатином добавляют 5 см* хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживаю! в термостате при температуре (40± I) ’С в течение 18—24 ч. В течение первых 3 ч молоко несколько раз перемешивают (пробку после встряхивания приоткрывают для удаления паров хлороформа). Через указанное время колбу вынимают из термостата, гидролизованнос молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят питьевой водой, добавляя к 1 части гидролизованного молока 2 части воды, уста пакт ши ют pH (7,1 ±0,1) и стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в течение (20±5) мин.
2.2.2.4. Приготовление питательной среды для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий
К I дм’ дистиллированной воды добавляют (40.0±0.5) г модифицированной агаровой среды для определения споровых анаэробных бактерий. Смесь перемешивают. на1ревают до полного растворения агара (при наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр), устанавливают pH (7,1 ±0.1). Разливают в пробирки по (10±2) см’, закрывают ватными или ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2) 'С в течение (20±5) мин.
Допускается приготовление среды для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий из отдельных ингредиентов. Для этого в I дм’ гидролизованного молока, приготовленного по п. 2.2.2.3, вносят 15 г микробиологического агара, 0,5 г солянокислого цистеина или 1,0 г аскорбиновой кислоты, 1,0 г растворимого крахмала и 5,0 г уксуснокислого натрия. Растворяют добавленные компоненты, нагревая смесь в текучем пару. Добавляют 5,0 г глюкозы и 20 см’дрожжевого автолизата, приготовленного по п. 2.2.2.2. или 4,0 г сухого дрожжевого антолизата. Устанавливают pH (7,1 ±0,1), разливают среду в пробирки по (10±2) см', закрывают ватными или ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при температуре (115±2) *С в течение (20±5) мин.
При длительном хранении среды (более 20 сут) посте охлаждения пробирок со средой ватные пробки в стерильных условиях заменяют на стерильные резиновые.
Приготовленную среду хранят в темном месте при температуре (8±2) *С не более 3 мес.
2.2.2.5. Приготовление водного агара
В I дм’ питьевой воды вносит 15 г мелко измельченного агара и нагревают до кипения. После расплавлении агара раствор в горячем состоянии фильтруют через ватный фильтр, разливают в пробирки по 15 см’ или в колбы по 50—100 см\ закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в течение (20±5) мин.
2.2.3. Подготовка образцов молока и сыра к аназизу
2.2.3.1. Образны молока по 15 см' переносят пипеткой в стерильные пробирки, которые закрывают ватными пробками. I]ри этом необходимо оедить. чтобы капельки молока не оставались на стенках пробирок.
Подготовленные пробирки с исследуемыми образцами молока вместе с контрольной пробиркой, в которой находятся 10 см' молока и термометр, помещают в водяную баню (уровень воды в водяной бане должен быть выше уровня молока на 10—15 мм) и выдерживают при температуре (75±1) *С в течение (30±3) мин. затем быстро охлаждают до комнатной температуры, погружая их в холодную воду.
В зависимости от обсемененности исследуемого молока спорами мезофильных анаэробных бактерий из прогретых проб готовят десятикратные разведения в растворе хлористого натрия, приготовлеи-ном по п. 2.2.2.1, по ГОСТ 9225.
2.2.3.2. Подготовка проб сыра к анализу и приготоаление разведений продукта для посева — по ГОСТ 9225.
Подготовленные пробирки с разведениями проб сыра вместе с контрольной пробиркой, в которой находятся термометр и 10 см' раствора хлористого натрия, при готовленного по п. 2.2.2.1. помешают в водяную баню и выдерживают по режимам, указанным в п. 2.2.3.1.
2.3. Проведение анализа
Для определения количества спор мезофильных анаэробных бактерий в молоке и сырах проводят посев I см' исследуемого образца (для молока — нулевое, первое и второе, а для сыра — первое и второе разведения) в пробирку с (10±2) см’ питьевой среды, приготовленной по п. 2.2.2.4, выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 мин и охлажденной до температуры (40±1) *С.
ГОСТ 25102-90 С. 4
Каждый образен исследуемых молока и сыра выбранных разведений засевают в две пробирки с питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания среды и не выдувая посевной материал.
Сверху посевы заливают слоем предварительно расплавленного и охлажденного до температуры (45±1) *С водного агара, приготовленного по и. 2.2.2.S. Высота слоя водного агара должна быть не менее (20±5) мм.
Пробирки с посевом помешают в термостат при температуре (37± 1) *С на 72 ч.
2.4. Обработка результатов
2.4.1. Наличие спор мезофильных анаэробных бактерий в засеянных объемах исследуемого образна молока или сыра определяют по появлению разрывов агарового столбика, образуемых при росте этих бактерий газами.
2.4.2. Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе молока определяют по числу пробирок, в которых они дали рост (см. таблицу).
Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе сыра определяют по числу пробирок, в которых они дали рост с посевом 0.1 и 0.01 см' (см. таблицу).
Количество пробирок с положительными результатами при посевах |
Наиболее вероятное число спор в |
Количество пробирок с положительными результатами при посевах |
Наиболее вероятное число спор в 1 см’, UTT. |
1 см* |
0.1 см’ |
0.01 см' |
1 см', шт. |
1 см' |
0.1 см' |
0.01 см' |
0 |
0 |
0 |
0.0 |
1 |
1 |
2 |
_ |
0 |
0 |
1 |
0.5 |
1 |
2 |
0 |
2.0 |
0 |
0 |
2 |
— |
1 |
2 |
1 |
3.0 |
0 |
1 |
0 |
0.5 |
1 |
2 |
2 |
— |
0 |
1 |
1 |
0.9 |
2 |
0 |
0 |
2.5 |
0 |
| |
2 |
— |
2 |
0 |
1 |
5.0 |
0 |
2 |
0 |
0.9 |
2 |
0 |
2 |
— |
0 |
2 |
1 |
— |
2 |
1 |
0 |
6.0 |
0 |
2 |
2 |
— |
2 |
1 |
1 |
13.0 |
1 |
0 |
0 |
0.6 |
2 |
1 |
2 |
20.0 |
1 |
0 |
1 |
1.2 |
2 |
2 |
0 |
25.0 |
1 |
0 |
2 |
— |
2 |
2 |
1 |
70.0 |
1 |
1 |
0 |
1.3 |
2 |
2 |
2 |
110.0 |
1 |
1 |
1 |
2.0 |
|
|
|
и более |
Результаты, в которых количество пробирок с видимыми признаками роста мезофильных анаэробных бактерий при посевах 1; 0.1 и 0.01 см’ молока или сыра соответственно равно 002. 012, 021, 022, 102. 112, 122, 202, нс могут быть использованы для расчета, так как в 95 % случаев они вызваны несовершенной техникой приготоаления разведений или присутствием антибактериальных веществ. В данных случаях исследования повторяют.
3. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА СПОР МЕЗОФИЛЬНЫХ ЛАКТАТСБРАЖИВАЮЩИХ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
Метод основан на способности мезофильных лактатсбраживаюших анаэробных бактерий, содержащихся в образцах молока и сыра, размножаться и давать характерные видимые признаки роста в селективных питательных средах.
3.1. Аппаратура, материалы, реактивы — по п. 2.1 с дополнениями, указанными ниже.
Мясорубка по ГОСТ 4025.
Мясо говяжье.
Гидролизат казеина.
Железо треххлористое 6-водное по ГОСТ 4147. ч. д а.
Индикатор нейтральный красный (нейтральрот) по ТУ 6—09—4120.
Кальиий молочнокислый по ТУ 6—09—3839.
Кислота молочная пишевая по ГОСТ 490.
С. 5 ГОСТ 25102-90
Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199. ч. д. а.
Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201, ч. д. а.
Пептон бактериологический по ГОСТ 13805.
Среда сухая лактатно-апетатиая для селективного учета анаэробов (ЛАССА-Углич) по ТУ 49 1039.
3.2. Подготовка к анализу
3.2.1. Подготовка аппаратуры и материалов — по ГОСТ 9225.
3.2.2. Приготов.чение сред
3.2.2.1. Раствор хлористого натрия, дрожжевой автолизат и водный агар готовят по пп. 2.2.2.1.
2.2.2.2, 2.2.2.S.
3.2.2.2. Приготовление мясо пен тонного бульона
Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю; заливают двойным количеством питьевой воды, отмечают первоначальный объем и остлатяют на 18—24 ч при температуре (511) °С. После этого для ускорения процесса экстракции питательных веществ из мяса содержимое кастрюли подогревают до температуры (50±5) *С и выдерживают в течение 60 мин и затем кипятят 30—40 мин. Посте кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный фильтр. Фильтрат доводят питьевой водой до первоначального объема, добавляют к нему (1,0±0,1) % массовой доли бактериологического пептона и (0.5±0,1) % массовой доли хлористого натрия и устанавливают с помощью раствора с массовой долей гидроокиси натрия 20% pH (7,3±0,1). Подготовленный бульон стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в течение (20±5) мин.
3.2.2.3. Приготовление питательной среды для определения количества спор м е зо ф ильных л а к т а т с бр а ж и в а ю щ и х анаэробных бактерий
К I дм' питьевой воды добавляют (50.010.5) г сухой лактатноанетатной среды для селективного учета анаэробов. Смесь перемешивают, нагревают до полного растворения агара и кипятят (411) мин, не допуская пригорания. Полученную среду в горячем состоянии фильтруют через ватно-марлевый фильтр, рахливают в пробирки но (1012) см’, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (12112) *С в течение (2015) мин.
Допускается приготовление питательной среды ДАССА-Углич из отдельных ингредиентов. Для этого к 900 см’ мясопептонного бульона, приготовленного по п. 3.2.2.2, добаатяют 5 г молочнокислого кальция. 5 г уксуснокислого натрия. 0.8 г солянокислого цистеина или 1.0 г аскорбиновой кислоты. 40 см' дрожжевого автолизата. ириготоаленного по п. 2.2.2.2, или 4 г сухого дрожжевого автолизата и 20 г агара. Смесь нагревают до температуры (9512) *С, выдерживают при постоянном помешивании до расплааления агара и добааляют по 10 см’ водных растворов с массовой далей треххлористого железа и тетраборнокнелого натрия 0.01 %, 10 см' водного раствор;» с массовой далей кислого углекислого натрия I % и I см' водного раствора с массовой далей индикатора нейтрального красного 0.4 %. С помощью водного раствора с массовой далей молочной кислоты 20 % доводят pH (5.7010.05). Приго-тоалеиную среду разливают в пробирки по (1012) см\ закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (11512) *С в течение (2015) мин. Затем ватные пробки в стерильных условиях заменяют на стертьные резиновые.
Готовая среда должна иметь интенсивно розовый или красный цвет.
Допускается замена мясопептонного бульона гидролизатом казеина и пептоном. Для этого к I дм’ гидролизата казеина добавляют 10 г пептона, устанавливают pH (7,010.1), нагревают до кипения, фильтруют через бумажный фильтр в чистые колбы и стерилизуют при температуре (12112) *С в течение (2015) мин.
3.3. Проведение анализа
3.3.1. Подготовку образцов проводят по п. 2.2.3.
3.3.2. Посев образцов проводят по п. 2.2.3. используя лактатноацетатную питательную среду для селективного учета анаэробов.
Культивирование посевов проводят в термостате при температуре (3711) ’С в течение 72 ч.
3.4. Обработка результатов
3.4.1. Рост мезофильных лактатсбражнвающнх анаэробных спорообразуюших бактерий в посевах определяют по образованию разрывов сталбика агара и изменению цвета питательной среды с красного до соломенно-желтого.
3.4.2. Определение наиболее вероятного числа спор мезофильных лактатсбражнвающнх анаэробных бактерий проводят по п. 2.4.2.
ГОСТ 25102-90 С. 6
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Научно-производственным объединением маслодельной и сыродельной промышленности «Углич»
РАЗРАБОТЧИКИ
Ю. Я. Свирилеико. канд. биол. наук: Н. И. Крсчман. канд. техн. наук: Г. Д. Перфильев, канд. б иол. наук: Л. С. Матевосяи
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 12.06.90 № 1510
3. ВЗАМЕН ГОСТ 25102-82
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
5. Офаничение срока действия снято но протоколу № 5—94 Межгосударственною Совета но стандартизации, метролоши и сертификации (ИУС 11-12—94)
6. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Февраль 2003 г.
Редактор Т.П. Шашина Техническим редактор О Н. Riacoea Корректор А. С. Черноусова Компьютерная верстка С.В. Рябовой
Им. лиц. Nf 02354 от 14.07.2000. Подписано и печать 03.04.2003. Усл.печ.л. 0.93. Уч.-издл. 0.80.
Тираж 136 эю. С 10316. Зак. 344.
НИК Издательство стандартов, 107076 Москва. Колодезный пер., 14. http://www.standartK.fu e-mail: infoitKtandards.ru Набрано в Калужской типографии стандартов на ПЭВМ.
Филиал ИПК Издательство стандартов — тип. "Московский печатник", 105062 Москва. Лялин пер.. 6.
Плр № 080102
1
Издание официальное
2
3
На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51935-2002.
4
На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51232-98.