Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

18 страниц

396.00 ₽

Купить ГОСТ Р 52337-2005 — официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на фуражное зерно (пшеницу, кукурузу, овес, ячмень) и продукты его переработки (муку, крупу, отруби, лузгу, жмыхи, шроты); растительные корма (сено, солому, травяную муку); комбикорма для продуктивных и нерподуктивных животных (в том числе консервы) и сырье для их производства (корма животного происхождения; продукты микробиологического синтеза; сухое молоко; концентрированные кормовые добавки). Стандарт устанавливает методы определения их общей токсичности: экспресс-методы и основные методы.

  Скачать PDF

Переиздание (март 2011 г.)

Рекомендуется использовать вместо ГОСТ 29136-91 (ИУС 11-2006), ГОСТ 13496.7-97 (ИУС 11-2006)

Действие завершено 15.02.2015

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Термины и определения

4 Отбор проб

5 Экспресс-методы определения общей токсичности биотестированием кормов на стилонихиях и колподах

6 Основные методы определения общей токсичности кормов биотестированием на кроликах и мышах

7 Требования безопасности

Приложение А (справочное) Схемы биотестирования исследуемых кормов

Приложение Б (обязательное) Оформление и хранение проб исследуемых кормов

Библиография

Показать даты введения Admin

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

ГОСТР

52337-

2005

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Методы определения общей токсичности

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2011

Предисловие

Задачи, основные принципы и правила проведения работ по национальной стандартизации в Российской Федерации установлены ГОСТ Р 1.0-92* «Государственная система стандартизации Российской Федерации. Основные положения» и ГОСТ Р 1.2-92** «Государственная система стандартизации Российской Федерации. Порядок разработки государственных стандартов»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным Государственным учреждением Ленинградской межобластной ветеринарной лаборатории (ФГУ ЛМВЛ); Санкт-Петербургской Государственной Академией ветеринарной медицины (СПб ГАВМ); Комитетом по сельскому хозяйству Ленинградской области; Федеральным Государственным учреждением Всероссийским государственным НИИ контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов — Центром качества ветеринарных препаратов и кормов (ФГУ ВГНКИ): ОАО Всероссийским НИИ Комбикормовой промышленности (ВНИИКП); Всероссийским НИИ Морского рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО); Санкт-Петербургским Государственным технологическим институтом (техническим университетом); Отделом ветеринарно-санитарной экспертизы и лабораторной диагностики Департамента ветеринарии МСХ РФ

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Корма, комбикорма, БВД, премиксы»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 мая 2005 г. № 107-ст

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Март 2011 г.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе «Национальные стандарты». а текст этих изменений — в информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты»

* С 1 июля 2005 г. действует ГОСТ Р 1.0-2004. ** С 1 июля 2005 г. действует ГОСТ Р 1.2-2004.

© Стандартинформ, 2005 © СТАНДАРТИНФОРМ, 2011

II

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

68

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Методы определения общей токсичности

Feeds, compound feeds, material for compound feeds. Methods for the determination of common toxicity

Дата введения — 2006—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на фуражное зерно (пшеницу, кукурузу, овес, ячмень) и продукты его переработки (муку, крупу, отруби, лузгу, жмыхи, шроты); растительные корма (сено, солому, травяную муку); комбикорма для продуктивных и непродуктивных животных (в том числе консервы) и сырье для их производства (корма животного происхождения; продукты микробиологического синтеза; сухое молоко; концентрированные кормовые добавки). Стандарт устанавливает методы определения их общей токсичности: экспресс-методы и основные методы. Методы биотестирования являются качественными. Они дают возможность оценить общую токсичность корма.

Экспресс-методы (ускоренные и предварительные) позволяют за 1.5—3 ч провести биотестирование кормов на инфузориях: стилонихиях и колподах. Корма, отнесенные к нетоксичным, используют по назначению.

Основные методы (подтверждающие и окончательные) предусматривают исследования кожной биопробы на кроликах и биопробы на мышах, которые за 3—5 сут позволяют дать окончательное заключение о токсичности корма. Эти методы применяют как для всех испытуемых кормов, так и для кормов, определенных экспресс-методами как токсичные, а также при возникших разногласиях (в качестве арбитражных методов).

Схемы биотестирования кормов представлены в приложении А (рисунки А.1 и А.2).

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты;

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.030-81 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Защитное заземление, зануление

ГОСТ 166-89 (ИСО 3599—76) Штангенциркули. Технические условия ГОСТ 171-81 Дрожжи хлебопекарные прессованные. Технические условия ГОСТ Р 52465-2005 Масло подсолнечное. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 4165-78 Реактивы. Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия

ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4523-77 Реактивы. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8756.0-70 Продукты пищевые консервированные. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 13979.0-86 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ 17299-78 Спирт этиловый технический. Технические условия ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Технические условия

ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования1

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26312.1-84 Крупа. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Методы отбора проб ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой. Технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 51848-2001 Продукция кормовая. Термины и определения

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Термины и определения

В настоящем стандарте использованы термины и определения, регламентируемые ГОСТ Р 51848.

4    Отбор проб

Отбор проб проводят по ГОСТ 8756.0, ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13979.0, ГОСТ 26312.1, ГОСТ 26809, ГОСТ 27262, ГОСТ 27668.

Правила оформления и хранения проб кормов, направляемых на испытание, даны в приложении Б.

5    Экспресс-методы определения общей токсичности биотестированием кормов на стилонихиях и колподах

5.1 Биотестирование кормов на стилонихиях (Stylonychia mytilus)

Метод основан на извлечении из исследуемых кормов различных фракций токсических веществ параллельно ацетоном и водой с последующим воздействием этих экстрактов на стилонихий. Оценку результату биотеста дают по реакции гибели инфузорий. Безопасным в этом случае следует считать корм, определенный как нетоксичный при одновременном параллельном исследовании как ацетонового, так и водного экстракта.

С учетом времени подготовки пробы корма к биотесту определение общей токсичности одной пробы занимает 3,5—4 ч; десяти проб — 4,5—5 ч.

2

ГОСТ Р 52337-2005

5.1.1    Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

Шкаф вытяжной с электроснабжением 220В/50Гц/10А.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более = 0,0001 г.

Штангенциркуль по ГОСТ 166.

Мельница лабораторная, обеспечивающая крупность помола 0,1 мм.

Микроскоп бинокулярный стереоскопический с увеличением 3.6—100,1 марки МБС. изготовленный по [1].

Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима при 220 ®С с погрешностью = 2 °С.

Термостат суховоздушный с диапазоном измерения температур от 15 °С до 55 °С и погрешностью регулирования температуры г 0,5 °С.

Аппарат для встряхивания жидкостей по (2).

Аквадистиллятор с электропроводностью 1,6 или 2,3 мкСм/см, кроме моделей с медными или латунными испарителями или конденсаторами.

Центрифуга с частотой вращения 1000 об./мин.

Блок микроаквариумов луночных размером 15 х 8.5 х 1,3 см, изготовленный из оргстекла.

Стекла предметные 25 х 75 мм с полированной лункой объемом 0,2 см3.

Колбы конические исполнения 2 (с пришлифованными пробками) вместимостью 50 или 100 см3 по ГОСТ 1770.

Стаканы химические вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336.

Пипетки по ГОСТ 29169 и по ГОСТ 29227.

Пробирки исполнения 2 (с пришлифованными пробками) вместимостью 25 см3 по ГОСТ 1770.

Дозаторы пипеточные (автодозаторы) на 20. 200 и 500 мкл по [3].

Чашки Петри (биологические) по ГОСТ 23932.

Штатив для пробирок.

Часы песочные или таймер на 2 мин.

Дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Карандаш по стеклу.

Сито лабораторное с отверстиями диаметром 1 мм по (4).

Тест-культура стилонихии. идентифицированная по морфологическим признакам согласно определителю простейших и протестированная на активность с помощью модельного токсиканта.

Ацетон по ГОСТ 2603, ч.д.а., ос.ч.

Этиловый спирт по ГОСТ 17299.

Дистиллированная вода по ГОСТ 6709.

Соли для приготовления раствора Лозина-Лозинского:

натрий хлористый по ГОСТ 4233;

калий хлористый по ГОСТ 4234;

кальций хлористый 2-водный по [5];

магний хлористый 6-водный по ГОСТ 4523;

натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201.

Все соли должны быть марки х.ч. или ч.д.а.

Медь сернокислая 5-водная (II) по ГОСТ 4165 для приготовления модельного токсиканта.

Допускается применение других средств измерения, оборудования и реактивов по метрологическим, техническим характеристикам и качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

5.1.2    Подготовка к проведению испытаний

5.1.2.1    Изготовление блока луночных микроаквариумов (рисунок 1)

Блок луночных микроаквариумов изготовляют из пластины органического стекла размером 15 х 8,5 х 1,3 см. В пластине высверливают с последующей полировкой 5 рядов по 9 лунок. Диаметр каждой лунки 1,2 см — верхний и 0,8 см — нижний, глубина — 0,7 см. Рабочий объем каждой лунки — 0,4 см3. Вместо блока микроаквариумов можно использовать микробиологические предметные стекла с отшлифованной лункой вместимостью 0,2 см3 (по 5 шт. на пробу).

5.1.2.2    Порядок обработки посуды для проведения испытаний

3

Вся посуда и блоки микроаквариумов, необходимые для биотестирования, должны быть химически чистыми и использоваться только для данного анализа. В качестве моющего средства допускается к применению только хозяйственное мыло и мыльный раствор.

71

Чашки Петри и колбы для приготовления раствора Лозина-Лозинского прокаливают в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре 120 °С—150 °С. Блоки из органического стекла сушат только на воздухе. Дистилляцию воды для биотестирования необходимо проводить в химически чистом помещении.

5.1.2.3    Приготовление рабочего раствора питательной среды для культивирования стилонихий и разбавления ацетоновых экстрактов образцов кормов.

Средой для культивирования инфузорий и разбавления ацетоновых экстрактов кормов служит раствор Лозина-Лозинского следующего состава: NaCL — 0,01 %, KCL — 0,001 %, СаС^-вод-ный — 0.001%. МдСЦ 6-водный — 0.001 %. NaHC03 — 0,002 %.

Для удобства сначала готовят 10-кратный концентрированный раствор. Для этого в дистиллированной воде растворяют 1,0 г хлористого натрия; 0.1 г хлористого калия; 0,1 г 7-водного хлористого магния; 0,1 г 2-водного хлористого кальция; 0,2 г кислого углекислого натрия и доводят объем до 1 дм3. Полученный раствор хранят не более одного месяца в холодильнике в стерильной колбе под ватно-марлевой пробкой.

Рабочий раствор Лозина-Лозинского готовят путем разбавления в 10 раз (1:9) концентрированной среды дистиллированной водой. Рабочий раствор хранят не более двух недель при комнатной температуре.

5.1.2.4    Приготовление модельного токсиканта и его рабочих концентраций

Для приготовления модельного токсиканта берут 10 мг 5-водной сернокислой меди, растворяют ее в дистиллированной воде и доводят объем до 1 дм3. Срок хранения раствора — не более семи суток в холодильнике в стерильной колбе.

Рабочие концентрации модельного токсиканта готовят последовательным 10-кратным его разбавлением в день проведения анализа. Сначала до концентрации 1 мг/дм3 раствор разбавляют дистиллированной водой, а затем до концентрации 0,1 мг/дм3 — раствором Лозина-Лозинского.


4

Рабочая концентрация — 0.1 мг/дм3. Рабочий раствор используют только свежеприготовленным.

72

ГОСТ Р 52337-2005

5.1.2.5    Приготовление корма для стилонихий

Свежие хлебопекарные дрожжи предварительно тестируют на общую токсичность. Затем навеску массой 50 г измельчают и высушивают в сушильном шкафу при температуре 50 °С—55 °С в течение двух суток.

Хранят готовые дрожжи в стерильной банке с притертой крышкой в сухом прохладном месте не более 12 мес, избегая попадания прямых солнечных лучей и насыщения дрожжей атмосферной влагой.

5.1.2.6    Культивирование стилонихий

Культивирование стилонихий и тестирование кормов проводят в отдельном помещении, изолированном от химических токсичных реактивов (особенно от летучих соединений, хорошо растворимых в воде). В стерильную чашку Петри вносят 25 см3 рабочего раствора Лозина-Лозинского, затем пипеткой переносят в нее массу стилонихий. При этом кончик пипетки, заполненный культурой стилонихии. нужно предварительно погрузить в чашку Петри с рабочим раствором Лозина-Лозинского. Туда же в качестве корма для стилонихий на кончике иглы, продезинфицированной 70 %-ным раствором этилового спирта, вносят 0,003 г высушенных дрожжей (2-3 крошки диаметром 1—2 мм). Чашку Петри помещают в термостат для культивирования стилонихий при температуре 22 °С—24 °С. Пересев культуры для хранения проводят 2 раза в неделю.

Допускается культивирование стилонихий вне термостата при температуре 18 °С—24 вС. В этом случае для поддержания постоянной температуры используют лампу дневного света, установленную на определенном расстоянии от чашек Петри, обеспечивающем заданную температуру. Лампу вместе с чашками накрывают полиэтиленовой пленкой, создав подобие теплички, где температура должна быть постоянной. Во избежание попадания прямых солнечных лучей чашки Петри накрывают бумагой.

Необходимо учитывать, что культура стилонихий не обладает генетической стабильностью. Приблизительно через год—полтора работы с культурой она стареет, теряет однородность, жизнеспособность, подвижность, неадекватно реагирует на токсиканты. В этом случае необходимо раз в год подсаживать свежий клон стилонихий к старой культуре или полностью заменять ее на новую. С целью замедления процесса вырождения культуры стилонихий при пересадке на свежую среду необходимо отбирать не только из предыдущей чашки Петри суточную культуру, но и из двух резервных чашек Петри с 2-, 3-суточными культурами, в которых инфузории имеют наибольшую подвижность и плотность.

5.1.2.7    Подготовка тест-организмов

Для биотестирования используют только суточную культуру стилонихий. находящуюся в фазе экспоненциального (активного) роста. С этой целью за сутки до анализа массу стилонихий пересаживают в новую питательную среду с кормом и помещают в термостат при оптимальной температуре 22 °С—24 °С. При этом стилонихии активно размножаются и концентрируются вокруг корма.

Не допускается использовать культуру стилонихий, зараженную другими видами простейших, микроскопическими грибами или бактериями, что может произойти при использовании нестерильной посуды, плохо подсушенных или просроченных дрожжей.

Для получения достоверных результатов биотестирования необходимо регулярно проверять состояние стилонихий. их подвижность, а раз в месяц — реакцию культуры на действие модельного токсиканта (5.1.2.4), для чего каплю со стилонихиями помещают в лунку предметного стекла и после подсчета их количества заливают 0,2 см3 раствора модельного токсиканта рабочей концентрации 0,1 мг/дм3. Через 30 мин подсчитывают количество оставшихся живыми стилонихий. Результат считают удовлетворительным, если выживают не менее 50 % стилонихий.

5.1.2.8    Подготовка исследуемого корма

Среднюю пробу исследуемого корма измельчают и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

5.1.2.9    Приготовление водного раствора ацетонового экстракта

Навеску исследуемого корма массой (10 ± 0,1) г помещают в пробирку с пришлифованной пробкой вместимостью 25 см3 или в коническую колбу со шлифом вместимостью 50 или 100 см3 и заливают определенным количеством ацетона в зависимости от вида исследуемого корма.

Для получения ацетонового экстракта пробирку или колбу энергично встряхивают не менее 2 мин. а затем отстаивают в течение не менее 10 мин и не более 15 мин.

5

При высокой набухаемости (гигроскопичности) исследуемого корма допускается увеличивать количество ацетона на 5—10 см3 таким образом, чтобы толщина слоя ацетона над кормом была не менее 2 мм. Раствор вновь взбалтывают в течение 2 мин. После повторного отстаивания в течение 10 мин осто-

73

рожно отбирают автоматической пипеткой или шприцем с длинной иглой 0,5 см3 полученной надосадоч-ной жидкости экстрактов и переносят ее в химический стакан или колбу с водным раствором Лозина-Лозинского.

Все параметры приготовления водного раствора ацетонового экстракта в зависимости от вида исследуемого корма представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Приготовление водного раствора ацетонового экстракта

В кп исследуемого корма

Навеска корма, г

Количество ацетона.см3

Приготовление водного раствора ацетонового экстракта

Ацетоновый экстракт, см1

Рабочий раствор Лозина-Лозинского.

см5

Комбикорма для рыб

10

14

0.5

50

Комбикорма для сельскохозяйственных животных, птиц и непродуктивных животных, в том числе консервы

10

15

0.5

40

Зернофураж:

ячмень, овес, пшеница, кукуруза, отруби, лузга

10

15

0.5

40

Шроты, жмыхи

10

15

0.5

40

Мука пшеничная, крупа

10

15

0.5

40

Мука травяная

10

20

0.5

40

Мука рыбная, крилевая

10

10

0.5

80

Мука костная, мясокостная, мясная, перьевая

10

10

0.5

80

Мука кровяная

10

15

0.5

80

Молоко сухое

10

15

0.5

80

Дрожжи кормовые, гидролизные

10

15

0.5

50

Сено, солома

10

20

0.5

50

Остальные концентрированные компоненты комбикормов и кормовые добавки (БВК, премиксы, минеральные и витаминные добавки) анализируют по схеме биотестирования комбикормов (приложение А). Предварительно такие добавки вносят согласно рецептам или зоотехническим нормам в размолотую пробу проверенного биотестированием нетоксичного на 100 % зерна пшеницы (наполнитель). Пробу пшеницы размалывают и тестируют в день проведения анализа и не хранят.

5.1.2.10 Приготовление водного экстракта исследуемого корма

Навеску массой (10 = 0,1) г вносят в колбу вместимостью 250 см3 и заливают 100 см3 дистиллированной воды. Колбы с содержимым встряхивают на аппарате в течение 20 мин. после чего смесь фильтруют через бумажный фильтр или центрифугируют с частотой вращения 1000 об /мин в течение 5 мин и отделяют надосадочную жидкость.

5.1.3 Проведение испытания

Каждую пробу корма исследуют пять раз (в пяти повторностях). Пересадку и подсчет стилонихий проводят под микроскопом при увеличении 2x8 или 2 х 14.

Автоматической пипеткой отбирают по 20 мкл среды со стилонихиями и помещают в каждый из пяти микроаквариумов или лунок предметного стекла. Наконечник пипетки, используемый для пересадки стилонихий в микроаквариумы или лунки, должен быть отдельным. Затем туда же автоматической пипеткой с новым наконечником вносят по 20 мкл водного раствора ацетонового экстракта исследуемого корма, подготовленного для биотестирования (5.1.2.9), или водного экстракта исследуемого корма, подготовленного для биотестирования (5.1.2.10).

Через 2 мин в каждом микроаквариуме или лунке подсчитывают количество стилонихий. Оптимальное количество — 10—20 шт.. при этом травмированные клетки стилонихий (неподвижные, округлой формы) не учитывают. Полученные данные заносят в журнал.

6

После подсчета стилонихий в каждый микроаквариум или лунку другой автоматической пипеткой вносят по 200 мкл водного раствора ацетонового экстракта (5.1.2.9) или водного экстракта исследуемого корма (5.1.2.10) и засекают время.

74

ГОСТ Р 52337-2005

Перед каждым внесением раствора экстракта анализируемой пробы в микроаквариум или лунку наконечник пипетки следует вытирать ватой во избежание попадания в них жира с наружной стороны пипетки.

Через 1 ч экспозиции при анализе водного раствора ацетонового экстракта исследуемого корма или через 3 ч при анализе водного экстракта исследуемого корма вторично подсчитывают численность стилонихий. В контрольных тестах все стилонихии должны оставаться живыми. Для того, чтобы за время экспозиции растворы в лунках не подсохли, под блок микроаквариумов или предметные стекла подкладывают смоченную водой фильтровальную бумагу и накрывают их стеклянным колпаком.

Параллельно с биотестированием пробы корма, с целью определения качества ацетона и минерального раствора Лозина-Лозинского проводят контрольные тесты. Для этого в микроаквариумы или лунки (в трех повторностях) помещают вышеуказанным способом стилонихии и заливают их:

а)    200 мкл 1%-ного раствора ацетона — 0.1 см3 (100 мкл) ацетона на 10 см3 раствора Лозина-Лозинского:

б)    200 мкл минерального раствора Лозина-Лозинского.

Качество ацетона проверяют каждый раз в начале использования новой партии реактива, а качество раствора Лозина-Лозинского — при приготовлении новой порции.

В случае токсичности исследуемого корма стилонихии:

а)    изменяют свою обычную вытянуто-овальную форму на округлую, а движение — на беспорядочное с поворотом вокруг своей поперечной оси;

б)    прекращают движение и (или) подвергаются распаду — лизису (количество лизированных клеток зависит от степени токсичности кормов). Токсичность исследуемого корма определяют по выживаемости стилонихий через 1 ч (при экстракции ацетоном) и 3 ч (при экстракции водой) экспозиции.

5.1.4 Обработка результатов

Выживаемость стилонихий N. %. вычисляют по формуле

N = Л/2: Л/,100.    (1)

где N? — среднеарифметическое (из пяти испытаний) значение количества стилонихий в конце опыта через 1 ч экспозиции, шт.;

N^ — среднеарифметическое (из пяти испытаний) значение количества стилонихий в начале опыта, шт.;

100 — перевод результата в проценты.

Вычисления проводят с точностью до первого десятичного знака, а окончательный результат испытания регистрируют в протоколе с округлением до целого числа. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 1 %.

Токсичность исследуемого корма определяют из расчета:

а)    комбикорма для свиней:

80 % — 100 % выживаемости стилонихий — корм нетоксичный;

40 % — 79 % выживаемости стилонихий — корм слаботоксичный;

0 % — 39 % выживаемости стилонихий — корм токсичный.

б)    комбикорма для других видов продуктивных и непродуктивных животных, птиц и рыб; фуражное зерно и продукты его переработки, концентрированные компоненты комбикормов:

70 % — 100 % выживаемости стилонихий — корм нетоксичный;

40 % — 69 % выживаемости стилонихий — корм слаботоксичный;

0 % — 39 % выживаемости стилонихий — корм токсичный.

5.1.5 Оформление результатов

Результаты испытаний заносят в журнал и оформляют акт экспертизы или протокол испытаний, где указывают наличие или отсутствие токсичности корма и возможность его использования.

Нетоксичным следует считать образец корма, определенный нетоксичным при параплельном биотестировании как водного раствора ацетонового экстракта, так и водного раствора испытуемого корма.

Нетоксичный корм дальнейшему исследованию не подлежит и используется по назначению без ограничений.

7

Слаботоксичные и токсичные корма (хотя бы по одному из исследованных экстрактов) направляют на биотестирование основными методами, а также на микологические, химико-токсикологические и бактериологические исследования.

75

5.2 Биотестирование кормов на колподах (Colpoda steinii)

Метод основан на извлечении из исследуемых кормов фракций токсичных веществ параллельно ацетоном и водой с последующим воздействием этих веществ на колподы. Время полного анализа одной пробы — 3,5 — 4 ч. десяти проб — 4,5 — 5 ч.

Данный метод предполагает использование сухой культуры колподы в лабораториях, не имеющих возможности постоянно поддерживать в активном физиологическом состоянии стилонихии.

5.2.1    Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы — по 5.1.1.

5.2.2    Подготовка к проведению испытаний

5.2.2.1    Изготовление блока луночных микроаквариумов и порядок обработки посуды — по 5.1.2.1 и 5.1.2.2.

5.2.2.2    Приготовление модельного токсиканта — по 5.1.2.4.

5.2.2.3    Приготовление рабочего раствора питательной среды для разбавления ацетонового экстракта исследуемого корма

Средой для разбавления ацетонового экстракта является раствор Лозина-Лозинского (5.1.2.3).

5.2.2.4    Подготовка тест-организмов

Сухая культура колподы для эколого-токсикологических исследований (6) по внешнему виду представляет собой округлые цисты покоя, прикрепленные к кусочку целлофановой пленки и стенке флакона, видимые при увеличении в 80 — 150 раз.

Культуру колподы выпускают во флаконах или ампулах. Каждый флакон (ампула) рассчитан на получение 2 см активной культуры с концентрацией не менее 5000 клеток в 1 cmj. В качестве источника питания для колпод используют споры бактерий Bacillus subtilis, прикрепленные к кусочку целлофана вместе со спорами колпод. К каждым двум упаковкам культуры прилагается флакон (ампула) с питательной средой.

Срок годности культуры — один год от даты выпуска препарата. Препарат хранят при комнатной температуре 8 защищенном от света месте. Для проведения исследований не позднее чем за 24 ч до использования вскрывают два флакона с культурой колподы и один флакон с питательной средой (один набор). В каждый флакон с культурой колподы наливают по 2 cmj питательной среды, затыкают ватно-марлевыми пробками и ставят в термостат при температуре 26 °С — 28 °С на 24 ч. За это время происходит массовое эксцистирование спор. При этом полученная культура колподы находится в физиологически активном состоянии, оптимальном для постановки биотеста в течение трех суток после экс-цистирования.

Непосредственно перед применением необходимо убедиться в активности культуры колподы. Для этого каплю культуры исследуют под микроскопом (увеличение 2 х 14). Колподы в количестве не менее 50 клеток в поле зрения должны активно двигаться. Кроме этого необходимо проверять активность культуры (новой партии) на модельном токсиканте (4.1.2.4). Для этого смешать на предметном стекле каплю культуры с такой же по объему каплей рабочего раствора сульфата меди (0,1 мг/дм3). В течение 30 мин должны оставаться живыми и подвижными не менее 50 % колпод.

5.2.2.5    Подготовка исследуемого корма

Среднюю пробу исследуемого корма измельчают до прохода через сито с ячейками диаметром 1 мм. Полученный таким образом однородный образец корма готовят параллельно двумя способами: 1) экстракцией токсичных соединений из образца ацетоном с последующим разведением ацетонового экстракта водным минеральным раствором Лозина-Лозинского: 2) экстракцией токсических соединений из образца водным минеральным раствором Лозина-Лозинского для дополнительного обнаружения водорастворимых токсинов.

Концентрированные компоненты комбикормов и кормовые добавки анализируют по схеме биотестирования комбикормов, предварительно введя эти вещества в количестве, определенном рецептом или зоотехническими нормами, в размолотый образец проверенного биотестированием нетоксичного на 100 % зерна пшеницы.

5.2.2.6    Приготовление водного раствора ацетонового экстракта испытуемого корма — по 5.1.2.9.

5.2.2.7    Приготовление водного экстракта испытуемого корма — по 5.1.2.10.

5.2.3 Проведение испытания

Из флакона отбирают 20 мкл питательной среды с колподами и помещают в микроаквариум или в лунку предметного стекла. Туда же приливают либо 200 мкл водного раствора ацетонового экстракта, либо 200 мкл водного экстракта исследуемого корма.

В контрольных тестах (проводят в трех повторностях при смене партии свежеприготовленного раствора Лозина-Лозинского) к 20 мкл раствора с инфузориями приливают 200 мкл минерального раствора Лозина-Лозинского. а для проверки качества ацетона — к 20 мкл раствора с инфузориями приливают

76

1

На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

70