Сертификация: тел. +7 (495) 175-92-77
Стр. 1
 

8 страниц

244.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Устанавливает метод определения доступного лизина в кормах, содержащих белки животного или растительного происхождения

стандарт принят с правом досрочного введения

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Определение

4 Сущность метода

5 Реактивы

6 Средства контроля

7 Отбор проб

8 Проведение испытания

9 Обработка результатов

10 Оформление результатов измерений

Приложение А (справочное) Библиография

Показать даты введения Admin

Страница 1

ГОСТ Р 51416-99 (ИСО 5510-84)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Определение массовой доли доступного лизина

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Страница 2

ГОСТ Р 51416-99

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Временным творческим коллективом, образованным в рамках договора № М98 42 002 Е 4075 между ЛФНОР и ВНИИЦСМВ с участием членов Технического комитета по стандартизации ТК4 «Комбикорма, БВД. премиксы»

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК4 <■ Комбикорма, БВД, премиксы*

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. № 571-ст

3    Настоящий стандарт за исключением 2, 6.6, 6.7, 6.К и 7 представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 5510—S4 «Корма для животных. Определение доступного лизина»

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2003 г.

© ИГ1К Издательство стандартов, 2000 © ИНК Издательство стандартов. 2003

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Российской Федерации без разрешения Госстандарта России

II

Страница 3

ГОСТ Р 51416-99 (ИСО 5510-84)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ Определение массовой доли доступного лизина

Feeds, mixed feeds and raw material. Determination of available lysine massfraction

Дата введения 2001—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения доступного лизина в кормах, содержащих белки животного или растительного происхождения.

Лизин кормов считается усвояемым в том случае, если в нем не связана конечная аминогруппа (аминогруппа е). Определяют эту фракцию лизина, используя способность связанных конечных аминогрупп соединяться с 2,4-динитрофторбензолом.

Однако данный метод по сравнению с биологическим завышает содержание доступного лизина, поэтому следует быть осторожным при интерпретации полученных результатов.

2    Нормативные ссылки

ГОСТ 13496.0-80* Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ Р 51417-99 (ИСО 5983—97) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение массовой доли азота и вычисление массовой доли сырого протеина. Метод Кьелыаля

ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498—98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб

3    Определение

В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

доступный лизин: Масса лизина, представляющая разницу между массами общего и недоступного лизина, определяемыми при условиях, установленных настоящим стандартом. Результат выражают в процентах в испытуемом продукте.

4    Сущность метода

Измельченную навеску пробы гидролизуют хлористоводородной кислотой, общий лизин выделяют при помощи хроматографии на колонке и измеряют его содержание на спектрометре при длине волны 570 нм.

Вторую навеску измельченной пробы обрабатывают спиртовым раствором 2,4-динитрофгор-бензола в щелочной среде, очищают, гидролизуют хлористоводородной кислотой, выделяют недоступный лизин при помощи хроматографии на колонке и измеряют его содержание на спектрофотометре при 570 нм.

5    Реактивы

Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а. Вода должна быть дистиллированной.

* Действует да введения ГОСТ Р. разработанного на основе ИСО 6497 111.

Издание официальное

I

Страница 4

ГОСТ Р 51416-99

5.1    Диэтиловый эфир, свободный от перекисей.

5.2    Кислый углекислый натрий, раствор массовой концентрации SO г/дм1.

5.3    Спиртовый раствор 2,4-диннтрофторбензола (ДНФБ)

В 12 см' 95 %-ного (по объему) этилового спирта растворяют 0.15 см' ДНФБ.

Раствор готовят перед использованием.

5.4    Раствор хлористоводородной кислоты молярной концентрации 6 моль/дм5.

Один объем хлористоводородной кислоты плотностью 1,19 г/см3 смешивают с 1 объемом дистиллированной воды.

5.5    Лимоннокислый натрий, буферный раствор pH 2,2

Последовательно растворяют в дистиллированной воде 21 г лимонной кислоты; 8 г гидроокиси натрия; 16 см' хлористоводородной кислоты плотностью 1,19 г/см5; 0,1 см3 октиловой (каприловой) кислоты; 20 см3 тнодигликоля; 3 cmj 30 %-ного (по объему) водного раствора додецилового эфира полнокснэтилена с приблизительно 23 молекулами оксиэтилена. Объем раствора доводят до 1000 см5 дистиллированной водой.

5.6    Лимоннокислый натрий, буферный раствор pH 5.28

Последовательно растворяют в дистиллированной воле 24,5 г одноводиой лимонной кислоты; 14 г гидроокиси натрия; 6,8 см3 хлористоводородной кислоты плотностью 1,19 г/см3; 0.1 см5 октиловой (каприловой) кислоты; 3 см3 30 %-ного (по объему) водного раствора додецилового эфира поднэтоксила с приблизительно 23 молекулами оксиэтилена. Объем раствора доводят до 1000 см3 дистиллированной водой. Устанавливают pH 5.28 ± 0,02, используя хлористоводородную кислоту плотностью 1.19 г/см5 или раствор гидроокиси натрия массовой долей 50 %.

5.7    Нингидриновый реактив

5.7.1    Пропноновокислый натрий, буферный раствор pH 5,5 ± 0,1

В приблизительно 400 см3 дистиллированной воды растворяют I6S г гидроокиси натрия. Охлаждают, затем при встряхивании добавляют 498 см3 пропноновой кислоты. Объем раствора доводят до 1000 см’ дистиллированной водой.

5.7.2    Приготовление реактива

Нингидриновый реактив готовят в атмосфере азота и в темноте. В колбу вместимостью 2000 см3 помещают 1000 см3 свободного от перекисей монометнлового эфира этиленгликоля, 1000 см3 буферного раствора пропионовокислого натрия и 40 г нингидрина. Встряхивают до полного растворения. затем добавляют 1,33 г 2-водного хлористого олова (И) (SnCl, 2Н,0). Перемешивают встряхиванием до полного растворения. (См. примечание).

Реактив устойчив в течение 1 мес при хранении при 4 *С под небольшим давлением в атмосфере азота и в темноте.

Примечание — Если наблюдается выпадение осадка хлористого олова (II). его заменяют 7,5 см3 раствора хлористого титана массовой концентрации 150 г/дм5 или 1.5 г пир и плати на на 1 дм5 реактива.

5.8    Лизин, стандартный раствор молярной концентрации с 1 мкмоль/дм3

В 100 см3 раствора хлористоводородной кислоты молярной концентрации с (НО) = 0,1 маль/дм3 растворяют 182,5 мг моногидрохлорида лизина. Отбирают точно 10 см3 этого раствора и разбавляют его до 100 см3 буферным раствором лимоннокислого натрия pH 2,2 (5.5). I см3 этого раствора содержит 1 мкмоль лизина.

6 Средства контроля

Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1—6.8.

6.1    Колбы плоскодонные вместимостью 250 и 1000 см3, короткогорлые с притертым коническим шлифом и обратные холодильники, подходящие к колбам.

6.2    Тигли с фильтрующей пористой стеклянной пластинкой Р16 (размер пор от 10 до 16 мк).

6.3    Масляная баня температурой, обеспечивающей обратную конденсацию (от 120 до 130 "С).

6.4    Ротационный испаритель.

6.5    Автоанализатор аминокислот или система для хроматографии вручную, включающая;

а)    хроматографическую колонку длиной около 250 мм и внутренним диаметром 6 мм, термо-статнруемая при 55 ’С при помощи водяной рубашки с циркулирующей водой и заполненная до высоты 200 мм 8 %-ной сильнокислой катионобменной смолой с поперечными связями и функциональными сульфогруппами, размер частиц (13 ± 2) мк;

б)    небольшой поршневой насос, обеспечивающий скорость потока 50 см3/ч;

в)    коллектор фракций;

г)    кипящую водяную баню;

д)    спектрометр со спектральной областью, включающей 570 нм. с кюветами толщиной 10 мм.

2

Страница 5

ГОСТ Р 51416-99

6.6    Градуировочные пипетки вместимостью 1,5 и 10 см3 с допускаемой относительной погрешностью ± I %.

6.7    Мерные колбы вместимостью 10, 20 и 100 см5 с допускаемой относительной погрешностью

± 0,2 %.

6.8    Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

7    Отбор проб

7.1    Отбор проб по ГОСТ 13496.0.

8    Проведение испытания

8.1    Подготовка проб по ГОСТ Р 51419.

8.2    Взятие навески

Две навески, взятые на весах 2-го класса точности, массой, содержащей около 100 мг сырого протеина, помешают в две колбы (6.1). Содержание сырого протеина определяют по ГОСТ Р 51417.

8.3    Общий лизин

8.3.1    Гидролиз хлористоводородной кислотой

В колбу вместимостью 1000 см3 к навеске добавляют 500 см3 хлористоводородной кислоты молярной концентрации с(НС1) = 6 моль/дм1. 'Закрывают колбу обратным холодильником и помещают в масляную баню, предварительно нагретую до 120—130 "С.

После медленного кипячения в течение 24 ч колбу охлаждают и содержимое фильтруют через тигель. Фильтрат выпаривают при температуре не выше 40 'С на ротационном испарителе. К остатку добаатяют дистиллированную воду и снова выпаривают. Эту операцию повторяют до тех пор. пока не будет удалена хлористоводородная кислота: для этого обычно достаточно четыре обработки, используя каждый раз по 30 см3 дистиллированной воды. Остаток растворяют в буферном растворе pH 2,2 и количественно переносят в мерную каабу вместимостью 100 см3. Объем раствора доводят до метки буферным раствором pH 2.2. Фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

8.3.2    Заключительная подготовка колонки и хроматография гидролнзата

Насос анализатора присоединяют к емкости, содержащей буферный раствор лимоннокислого натрия с pH 5.28 (5.6). Затем его регулируют, чтобы обеспечить скорость потока жидкости 50 см3/ч. Насос присоединяют в колонке со смолой, нагретой предварительно до 55 *С, и в течение 20 мин через колонку пропускают буферный раствор, чтобы установилось равновесие. Насос отсоединяют. Удаляют большую часть жидкости над смолой, следя при этом, чтобы поверхность смолы все время была покрыта жидкостью.

При помощи пипетки 0,5 см3 гидролизата (или 1 см3, если ручная система) наносят на колонку и пропускают его через колонку под небольшим давлением азота. Стенки колонки обмывают 0,5 см* буферного раствора pH 5,28 и пропускают через колонку. Колонку доверху заполняют буферным раствором и присоединяют к насосу.

8.3.3    Определение

8.3.3.1    Автоматизированная система

Включают анализатор. Прибор градуируют по 8.3.2, используя 0,25 мкмоль лизина (0,25 см3 стандартного раствора лизина) или массу лизина, установленную в инструкции к анализатору.

8.3.3.2    Ручная система

8.3.3.2.1    Локализация лизина

Фракцию элюата. содержащую лизин, определяют, используя раствор лизина известной концентрации, например, I мкмоль/см3. Для этого отбрасывают первые 25—30 см3 элюата и затем собирают в пробирки фракции по I см3 до тех пор. пока не получат 50 фракиню. считая с начала элюирования. К каждой фракции между 30 и 50 фракциями добавляют по I см3 нингидринового реактива. Перемешивают, переносят в кипящую водяную баню и оставляют на 15 мин. Охлаждают и разбаатяют путем добавления 10 см3 буферного раствора pH 5.28

Примечание — Исключительно для информации: при описанных условиях лизин обычно элюируется между 39 и 45 фракциями.

8.3.3.2.2    Определение

Если лизин элюировался между 39 и 45 фракциями, отбрасывают первые 38 см* элюата, собирают и смешивают фракции (от 39 до 45), соответствующие пику лизина, и высушивают на ротационном испарителе.

Пр и м с ч а и и е — После получения фракций, содержащих лизин, через колонку пропускают ешс около 200 ем3 буферного раствора, чтобы удалить нежелательные компоненты, которые могут остаться.

3

Страница 6

ГОСТ Р 51416-99

Остаток растворяют в 5 см’ буферного раствора pH 5.28 и добавляют 5 см ' нингидринового реактива. Перемешивают, переносят в кипящую водяную баню и оставляют па 15 мин. Охлаждают и разбавляют буферным раствором pH 5,28. чтобы концентрация лизина в измеряемом растворе составляла приблизительно 0.02 мкмоль/см3. (Пусть К, — объем полученного таким образом измеряемого раствора).

Измеряют поглощение на спектрометре при 570 нм против жидкости, представляющей смесь одного объема буферного раствора и одного объема нингидринового реактива, которую предварительно помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, и после охлаждения разбавляют до объема У,.

8.3.3.2.3 Г радуировка спектрометра

Отбирают точно 5 см' стандартного раствора лизина, прибавляют 5 см1 нингидринового реактива. Перемешивают, ставят на 15 мин в кипящую водяную баню. Охлаждают и разбавляют до 100 см5 буферным раствором pH 5.28.

Измеряют поглощение на спектрометре при тех же условиях, как в 8.3.3.2.2.

8.4 Недоступный лизин

8.4.1    Реакция диннтрофенилирования

В колбу вместимостью 250 см1, где находится вторая навеска испытуемой пробы (см.8.2), при помощи пипетки переносят 8 см3 раствора кислого углекислого натрия. Оставляют приблизительно на 10 мин, помешивая время от времени. Затем добавляют раствор ДНФБ, колбу закрывают, содержимое перемешивают, следя затем, чтобы не осталось частичек, прилипших к стенкам колбы. Смесь оставляют на ночь при комнатной температу ре в темном месте.

8.4.2    Очистка

Жидкость выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре ниже 40 *С. Затем в колбу добавляют 75 см1 диэтилового эфира, перемешивают и дают отстояться. Выливают большую часть диэтилового эфира с предосторожностями, чтобы не удалить при этом твердые частички. Эту операцию повторяют еше два раза, используя каждый раз по 50 см} диэтилового эфира. Оставшиеся следы диэтилового эфира удаляют путем нагревания на ротационном испарителе.

8.4.3    Гидролиз хлористоводородной кислотой

В колбу вносят 150 см3 хлористоводородной кислоты и выполняют процедуры по 8.3.1. но гидролизат, растворенный в буферном растворе pH 2,2, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 20 см3 (или 10 см3 при использовании ручной системы).

8.4.4    Хроматография гидролизата и определение по 8.3.2 и 8.3.3.

В ручном варианте измерение на спектрофотометре можно проводить после разбавления смеси лизин плюс реактив до 20 см' буферным раствором pH 5.28. (Пусть V, — объем полученного таким образом измеряемого раствора)

8.5 Количество определений

Проводят два параллельных определения, используя две разные пары навесок испытуемой пробы. 9 Обработка результатов

9.1    Метод вычисления общего лизина

9.1.1    Определение на автоанализаторе

Массовую долю обшего лизина в испытуемой пробе Х„ %. вычисляют по формуле „    0.25 - 0.146- 100- 100 - 5,

V -... В I I w w v t---М),    (1)

где 0,25 — объем стандартного раствора лизина, нанесенный на колонку, см3;

0.146 — массовая концентрация стандартного раствора лизина, мг/см5;

100 — объем гидролизата пробы, см3;

100 — коэффициент пересчета в проценты;

S, — площадь пика общего лизина, определяемого по 8.3.3.1, мм2;

Л'(| — площадь пика лизина массой 0,25 мкмоль, мм2;

т, — масса навески, взятой для определения общего лизина в первую колбу, г;

V„ — объем гидролнзата, перенесенного на колонку (обычно У„ = 0,5 см3), cmj; 1000 — коэффициент пересчета мг в г.

9.1.2 Определение вручную

Массовую долю общего лизина в испытуемой пробе Л”,, %. вычисляют по формуле

V. ■ 0.73 - А.

х'*ф-шгг 100

(2)

4

Страница 7

ГОСТ Р 51416-99

где Лу — оптическая плотность, определяемая по 8.3.2.2;

V, — объем измеряемого раствора, см3;

100 — коэффициент пересчета и проценты:

0,73 — масса лизина в 5 см' стандартного раствора лизина, мг;

Ап — оптическая плотность стандартного раствора лизина,    определяемая    по    8.3.3.2.3;

У0 — объем перенесенного на колонку гидролизата (обычно    V„    =    I    см1),    см3;

т, — масса навески, помешенной в первую колбу, г;

1000 — коэффициент пересчета мг в г.

9.2 Недоступный лизин

9.2.1 Определение на автоаналнзаторе

Массовую долю недоступного лизина в испытуемой пробе Х2, %, вычисляют по формуле

(3)

где S2 — площадь пика, соответствующего недоступному лизину, определяемому по 8.4.4, мм2;

\ — плошадь пика, соответствующего 0.25 ммоль лизина, мм2; т, — масса навески, помещенной во вторую колбу, г;

К) — объем перенесенного на колонку гидролизата (обычно V,, = 0.5 см3), см1.

9.2.2 Определение вручную

Массовую долю недоступного лизина в испытуемой пробе. Х2, %. вычисляют по формуле

„ К -0.0073 А}

х: =——Г---г,    (4)

т2ш 'о    А>

где А, — оптическая плотность, определяемая по 8.4.4;

Vj — объем измеряемого раствора (обычно У2 = 20 см3), см3;

Л„ — оптическая плотность стандартного раствора лизина, определяемая по 8.3.3.2.3:

У0 — объем перенесенного на колонку гидролизата (обычно = I см3), см3; т2 — масса навески, помещенной во вторую колбу, г.

9.3    Доступный лизин

Массовую долю доступного лизина в испытуемой пробе Xs, %. вычисляют по формуле

Х}=    — Х2,    (5)

где X, — массовая доля общего лизина (см. 9.1);

Х2 — массовая доля недоступного лизина (см. 9.2).

Примечание — Массовую долю доступного лизина в обшем лизине. вычисляют по формуле

^Д-.ОО.    (6)

9.4    Сходимость

Расхождение результатов двух параллельных определений не должно превышать 10 % от их среднего арифметического значения.

9.5    Воспроизводимость

Расхождение результатов двух определений, выполненных при различных условиях, не должно превышать 20 % от их среднего арифметического значения.

10 Оформление результатов измерений

В отчете об испытании должны быть указаны;

-    используемый метод;

-    полученные результаты;

-    любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касаюшнеся подробностей, которые могли повлиять на результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.

5

Страница 8

ГОСТ Р 51416-99

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное)

Библиография

(1| ИС'О 6497 Корма для животных. Методы отбора проб

УДК 636.085.3 :006.354    ОКС    65.120    С19    ОКСТУ 9209

Ключевые слова: корма, сырой протеин, лизин, общий лизин, недоступный лизин, динитрофтор-бензол. нингидрин, анализатор аминокислот, спектрометр

Редактор Т.П.Шашипа Технический редактор Л.А.Гу сева Корректор В.Ч.Кануркика Коипыокрная верстка А. И. Зо./отарелои

Им. лиц. JSit 02354 or 14.07.2001). Подписано и печать 14.05.2003. Усл.печ.л. 0.93. Уч.-иад.л. 0.67. Тираж 62 акт. С 10634. Зак. 132.

ИПК Иматслыпяо стандартов. 107076 Москва. Колоиехнмй пер.. 14. hup; //wn-w.slantlardx.ni    e-mail: infotlManUards.ru

Набрано и отпечатано в ИПК И дательстпо стандартов