Биологиялык; каушсп.пк Шиюзат жэне тамак; ошмдер1

0С1МД1К TEKTI ГЕНЕТИКАЛЬЩ ТУРЛЕНД1Р1ЛГЕН К03ДЕРД1 (ГТК) Б1РДЕЙЛЕНД1РУ ЭД1С1

ЦР СТ 1346-2005

(Р ГОСТ 521 73-2003, MOD)

Ресми басылым

Казаксзан Республикасы Индустрия жэне сауда министрлптнщ Техникалык; реттеу жэне метрология жоншдеН комитет! (Мемстандарт)

Астана

ЦР СТ 1346-2005

Алгысез

1    Техникальщ реттеу жэне метрология жешндеп комитетшщ «Казахстан стандарттау жэне сертификаттау институты» республикалык мемлекеттж кэсшорны Э31РЛЕП ЕНГ13Д1

2    Казахстан Республикасы Индустрия жэне сауда министрлшшц

Техникалык реттеу жэне метрология женшдеп комитетшщ 2005 жылдыц 1 кыркуйепндеп №    237    буйрыгымен    БЕК1Т1Л1П КОЛДАНЫСКА

ЕНГ131ЛД1

3 Б1Р1НШ1 ТЕКСЕРУ MEP3IMI    2010 жыл

ТЕКСЕРУ КЕЗЕЦД1Л1Г1    5 жыл

4    Осы стандарт «Тамак ешмдершщ сапасы жэне каушслздш туралы» Казахстан Республикасы зацына сэйкес Р ГОСТ 52173-2003 ко л даны л тан терминологияны келпру жолымен, сонымен катар КР СТ 1.5-2004 К,азакстан Республикасыныц мемлекеттж техникалык реттеу жуйес1. Стандарттардыц курылуына, баяндалуына, рес1мделу1не жэне мазмунына койылатын жалпы талаптарта сэйкес стандарттыц жэне оныц мазмуныныц курылымдьщ элементтер1 iniiHapa езгеру1мен ГОСТ Р 52173-2003 Шшазат жэне тамак ен1мдер1. Ос1мд1к теки генетикалык турленд1р1лген коз дер д1 (ГТК) б1рдейленд1ру эд1с1не катысты турленд1р1лген болып табылады. Мэтш бойынша керсетшген езгертулер келбеу каршпен белгшенген.

5    Осы стандартта «Техникалык реттеу туралы», «Казакстан Республикасында денсаулык сактау туралы», Санитарлык-эпидемиологиялык саульщ туралы, Тамак ешмдершщ сапасы жэне каутслздт туралы, Тутынушылардыц кукытын кортау туралы Казакстан Республикасы зацы жузеге асырылды

6    АЛЕАШ РЕТ ЕНГ131ЛД1

Осы стандарт Казакстан Республикасыныц Индустрия жэне сауда министрлт Техникалык реттеу жэне метрология женшдеп комитетшщ руксатынсыз ресми басылым рет1нде тольщтай немесе белшектеп басылып шыгарыла, кебейтше жэне таратыла алмайды

KP СТ 1346-2005

6.2.7 бойынша дайындалган ДНК ертщцсш ПЦР журпзу унпн тжелей кол даны лады немесе тоцазыткыш камерада мерз1м1 6ip жылга дешн минус 20 °С температурада сактайды.

6.3 № 1 жэне № 2 реакциялык коспаларды дайындау

6.3.1    Бес сынамага № 1 реакциялык коспаларды дайындау

Музбен кюветке салынтан сыйымдылыты (1,5 ±0,1) см³, микро центрифугалы тутжке (312,5±0,1) мм³ иондалматан суды, 52,5 мм³ 10 магний хлорид! бар ПЦР уттли буферлерд1 4.38 бойынша, [17], (26±0,1) мм³ 6.1.9, бойынша дайындалган нуклеотид коспаларын (13 ±0,1) мм³ праймер1 35S-1 (концентрациясы 20 мкмоль/дм³) 4.44 бойынша, [26], (13 ±0,1) мм³ праймepi 35S-2 (концентрациясы 20 мкмоль/дм³) 4.44 бойынша, [26], (2,5±0,1) мм³ Taq-полимераза ферменпмен (концентрациясы 5 ед/мм³) 4.37 бойынша, [16], (52,5 ±0,1) мм³ 6.1.8 бойынша дайындалган БСА ертщцш енпзедт Цоспаны сшкуге арналган аппаратта кеб1ктер немесе кеб1кшелер пайда болдырмай 5 с араластырады.

6.3.2    № 2 Бес сынамаларга реакциялык коспаларды дайындау

Музы бар кюветке салынган сыйымдылыгы 1,5 см³ микро центрифугалы тутжке 312,5 мм³ иондалмаган суды, 52,5 мм³ 10 хлорид магнит! бар ПЦР арналган буфердц 26 мм³ 6.1.9, 13 мм³ бойынша дайындалган нуклеотидтер коспасын nos-1 терминатор праймерш (концентрациясы 20 мкмоль/дм³) 4.45, [27], 13 мм³ nos-2 (концентрациясы терминатор праймерш 20 мкмоль/дм³) 4.45, [27] бойынша, (концентрациясы 5 ед/мм³) 2,5 мм³ Taq-полимераза фермент!, 6.1.8 бойынша дайындалган 52,5 мм³ БСА ертщцсш енпзедт Коспаны cm куге арналган аппаратта кебжтер немесе кебжшелер пайда болдырмай 5 с араластырады.

6.3.3    6.3.1 жэне 6.3.2дайындалган № 1 жэне № 2 реакциялык коспаларды, 30 с айналым жишп 3000 мин"¹ устел шагынцентрифугада центрифугалайды. № 1 реакциялык коспаларды сыйымдылыгы 0,2 см³ (немесе 0,5 см³ пайдаланылатын амплификатор турпатына байланысты) 90 мм³ нан бес микроцентрифугалык тутжке ПЦР журпзу унпн куядьт. № 2 реакциялык коспаларды сыйымдылыгы 0,2 см³ (немесе 0,5 см³ пайдаланылатын амплификатор турпатына байланысты) 90 мм³ нан бес микроцентрифугалык тутжке ПЦР журпзу унпн куядьт. № 1 жэне № 2 реакциялык коспаларды тжелей ПЦР журпзу алдында дайындайды.

7 Талдау журпзу

7.1 № 1 реакциялык коспалары бар алгашкы ею тутжке жэне № 2 реакциялык коспалары бар алгашкы ею тутжке ДНК, 6.2.1.1—6.2.1.7 дайынша дайындалган, эркайсысына 2 мм³ талданатын ешмнен белшген ДНК ертнд!сш автоматты шагын дозатормен косады.

№ 1 реакциялык коспалары бар уппнпп тутжке жэне № 2 реакциялык коспалары бар уппнпп тутжке эр 6ipiHe оамдж текл тамакка генетикалык турленд1р1лмеген курамныц стандарттык улпсшен белшген (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0), no 2 мм³ ДНК ертщцсш автоматты шагын дозатормен косады.

№ 1 реакциялык коспалары бар тертшпп тутжке жэне № 2 реакциялык коспалары бар тертшпп тутжке эр 6ipiHe eci мд1 к текл тамакка генетикалык турленд1ршген курамныц стандарттык улпсшен белшген (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5), no 2 мм³ ДНК ертндосш автоматты шатын дозатормен косады.

№ 1 реакциялык коспалары бар бесшпп тутжке жэне № 2 реакциялык коспалары бар бесшпп тутжке автоматты шатын дозатормен эр 6ipiHe 2 мм³ иондалматан суды косады — бос тэж1рибе.

7.2    Крспалары бар эр тутжке 7.1 бойынша 6ip тамшыдан (20-40) мм³ вазелин майын ГОСТ 3164 бойынша косады.

7.3    7.2 бойынша дайындалтан коспалары бар тутжл ПЦР журпзу утттш амплификатор салады. 35S /сарауга праймерлер ymiH амплификациясы батдарламасы 1 кестеде, терминаторта nos — 2 кестеде келлршген.

Жесте — 35S карауга арналтан амплификация шарттары

Сатысы Амплификатор ту эпаты Crocodile ТТ Gene Amp 2.400 Progene Trio Терцик МС-7 Денатурация 2 мин/98 °С 3 мин/94 °С 3 мин/95 °С 2 мин/96 °С 3 мин/94 °С Амплификация 8 с/95 °С 30 с/54 °С 40 с/72 °С 20 с/94 °С 40 с/54 °С 60 с/72 °С 36 с/95 °С 72 с/54 °С 84 с/72 °С 30 с/95 °С 40 с/54 °С 40 с/72 °С 20 с/94 °С 40 с/54 °С 60 с/72 °С Кезецдер саны 40 40 40 40 40 Соцгы узарту 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С Кату фазасы 1 мин/30 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 Кыздыру жылдамдыты 1 °С/с 0,77 °С/с 1,5 °С/с 1 °С/с 0,77 °С/с Кату 1 °С/с 3,15°С/с о о o' 1 °С/с 3,15°С/с

2 Кесте — nos терминаторта арналтан амплификация шарттары

Сатысы Амплификатор турпаты Crocodile II Gene Amp 2400 Progene Trio Терцик MC-2

ЦР СТ 1346-2005

Денатурация 3 мин/95 °С 3 мин/94 °С 3 мин/95 °С 2 мин/98 °С 3 мин/94 °С Амплифика ция 20 с/95 °С 40 с/54 °С 40 с/72 °С 20 с/94 °С 40 с/54 °С 60 с/72 °С 36 с/95 °С 72 с/54 °С 84 с/72 °С 30 с/95 °С 40 с/54 °С 40 с/72 °С 20 с/94 °С 40 с/54 °С 60 с/72 °С Кезецдер 40 40 40 40 40 Соцлы 3 мин/72 °С 3 мин/72 3 мин/72 °С 3 мин/72 3 мин/72 °С Цату фазасы 1 мин/30 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С Цыздыру 1 °С/с 0,77 °С/с 1,5 °С/с 1 °С/с 0,77 °С/с Цату 1 °С/с 3,15°С/с 1,5 °С/с 1 °С/с 3,15°С/с

7.4    ПЦР аякталлан соц эр шалынцентрифугалык туыктен мукият вазелин майыныц кабалы нан 8 мм³ коспадан ipiKTerUi жэне 6.1.12бойынша дайындаллан гельд1 жеке калтала аударады.

7.5    Гель дщ жеке калтасына 8 мм³ молекулярлык коспаныц мар Kepi н масса ДНК 4.40, бойынша ештзедД19].

7.6Гельд1 1- ТВЕ буфер1мен толтырыллан келденец электрофорезд1 жург1зу уппн 4.2 бойынша, [2] курал камерасына салады.

Электрофорезд1 65 мин. шшде кернеу турактану жалдайларында 6 В/см гельд1 электр толы кернеу кезшде журпзедт

7.7    Электрофорезден кешн ПЦР ешмдерш кезбен шолуды 4.4, [4] бойынша видео жуйе кемел1мен жузеле асырады.

7.8    Файл-телкужат туршде б1рдейлещцру нэтижесл катты магниты тасымалдауышта сакталады жэне видеомониторла немесе принтерле шыларыладьл Бейнелер уллшер1 А жэне Б косымшаларында келтлршген.

8 Талдау нэтижелерш оцдеу

8.1    0слмд1к тектл тамакка ленетикалык турленд1р1ллен курамнын, стандартты улг1слнен белшген ГМИ [ДНК стандарты бар сынамада (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5), 35S карауы бар] , ешм олтттем!' ПЦР-бояллан тшк болу Tnic, осы тшкН калыптастыратын лель-электрофорелраммада, 195 сыцар нуклеотидтерд1 курайды (п.н.).

GciMfliK теки тамакка ленетикалык турленд1р1лмеген курамнын, стандарттык улНс1нен бел1нген ГМИ [ДНК стандарт сынамасында жэне бос тэж1рибеде бояллан Нл1к болмау Tnic (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0)] жэне лель-электрофорелраммада осы тшкл калыптастыратын ПЦР - ешмшщ шттттемл' 195 нуклеотидтер сыцарын курады (п.н.).

8.2    GciMfliK TeKTi тамакка ленетикалык турленд1р1лмеген курамныц стандарттык улг1с1нен белшген ГМИ [ДНК стандарттарыныц сынамасында

11

(Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5), терминаторы бар nos\ боялтан тшк болу тшс, гель-электрофореграммада осы тшкП калыптастыратын ПЦР- ешмшщ олтттем1 180 п.н.курады. 00мдж текы тамакка генетикалык турленд1ршмеген курамнын стандарттык улпсшен белшген ГМИ [ДНК стандарт сынамасында (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0)] жэне бос тэж1рибеде боялтан тшк болмау тшс, гель-электрофореграммада осы тшки калыптастыратын ПЦР- ешмшщ олтттем1 180 п.н.курады.

8.3 Нэтижелерд1 интерпретациялау

8.3.10лшем1 195 п.н. жэне 180 п.н. ПЦР-ешмшщ талданатын сынамада жоктыты талданатын ошмде генетикалык турлевдршмеген кездер болуы туралы куэландырады.

8.3.2    0лшем1 195 п.н. жэне 180 п.н. ПЦР-ешмшщ немесе оныц 6ipi талданатын сынамада болуы ошмде генетикалык турлевдршен кездер болуы туралы куэландырады.

8.3.3    ПЦР-ешмшщ сынамалары косарлас талданатын сынамалардыц б1ршде болтан жэне баска косарлас талданатын сынамаларда жок болтан жатдайда талданатын ешмшц таты 6ip шмесш талдауды кайталау кажет.

8.3.4    ПЦР-продуктов олтттем1 195 п.н. жэне 180 п.н. ПЦР-ешмшщ жатымсыз бакылауында болуын табу жатымсыз нэтижелер1 туралы куэландырады. Бул ГМИ-мен жабдьщтыц жэне (немесе) реактивтердщ юрлену кезшде мумюн. Бул жатдайда зертханалык устелдерд1 н жэне дозаторлардыц беттерш туз кышкылы ертгшслмен (1 моль/дм³) ецдеу, реактивтерд1 жаца шскендерге ауыстыру, амплификацияны кайталау керек.

8.3.5    ПЦР-продуктов олтттем1 195 п.н. жэне 180 п.н. ПЦР-ешмдерш жатымды бакылау жоктыты жагымсыз н эти же л ерш алу туралы куэландырады. Бул ПЦР арналган реакциялык коспалар компоненттершщ 6ipi бшсендшжы жогалткан кезде мумюн. Бул жагдайда жаца дайындалган реактивтерге ауыстыру жэне амплификацияны кайталау керек.

9 bip ieiLieii iipy нэтижелерш бакылау

Б1рдейленд1ру нэтижелерш бакылауда есшдж текп тамакка генетикалык турленд1ршген курамныц стандарттык улпсшен белшген ДНК ертщцсш -жагымды бакылауды (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5), жэне еамдж TeKTi тамакка генетикалык турлегшршмеген коз дер дш стандарттык улпсшен (Certified Reference Material IRMM № 41 OR 8В-0)белшген ДНК ертщцсш жэне бос тэж1рибеш ею жатымсыз бакылауды колданылады.

KP СТ 1346-2005

10    тал day нэтижелерт рэстдеу

Отмбегз генетикалъщ турленд1ршген квздердщ к) рамын талдау нэтижелерт рэстдеу ) aeici В цосымшасында келт1ртген хаттамамен peciMdeaedi.

11    Ь^аупнлздж талаптары

11.1    Жумыстарды орындауда ГОСТ 12.1.007 бойынша химиялык реактивтермен жумыс icTey кез1нде каутслздж талаптарын сактау керек. Бромды этидий жэне боялган гель ертнд1с1мен жумыс icTey кез1нде резецке колгаппен жумыс icTey кажет.

11.2    Жумыс журпзшетш белмелер ГОСТ 12.4.021 бойынша Kipy-copy желдетк1ш1мен жабдыкталуы ти1с. Жумыс аумагы ауасындагы зиянды заттар курамы ГОСТ 12.1.005 белгшенген нормалардан аспау керек.

11.3    Электр кондыргылармен жумыс icTey кез1нде электр каутслздж ГОСТ 12.1.019 талаптарына сэйкес. Зертхана белмелер1 ГОСТ 12.1.004 бойынша орт каушЫздт талаптарына сэйкес болу тшс жэне ГОСТ 12.4.009 бойынша орт сещцру кур ал дары болу тшс.

11.4    УФ-сэлеленумен жумыс icTey кез1нде коргау экранын жэне коргау кез1лд1р1ктер1н колдану керек.

11.5    Бацылау кезтде цолданылатын каутпи материалдармен жэне реактивтермен жумыс icmey кезтде [28], сонымен цатар нормативтж ку.жхиптармеп ескершген каутаздж талаптарын сацтау керек.

13

KP СТ 1346-2005

А косымшасы

(мтдетпи)

Генетикальщ турленд1ршген кездерд1 б1рдейленд1ру унпн электрофорез нэтижелерш суретке тарту улпск рекомбинантты ДНК (промотор 35S)

1,2 — талданатын сынамалар; 3 — молекулярлык масанын, мар Kepi 100 п.н.; 4— ес1мд1к теки тамакка генетикалык турленд1р1лген курамнын стандарттык улпс1; 5 — еслмдж тект! тамакка генетикалык турленд1р1лмеген курамнын, стандарттык улпск 6 — бос тэж1рибе

14

КР СТ 1346-2005

Б косымшасы

(линдетпи)

Генетикалык турленд1ршген кездерд1 б1рдейленд1ру унпн электрофорез нэтижелерш суретке тарту улпск рекомбинантты ДНК (терминатор nos)

1 — молекулярлык масаныц мар Kepi 100 п. н.; 2, 3 — талданатын сынамалар; 4 — еслмдж тект1 тамакка генетикалык турленд1р1лген курамнын, стандарттык улпск 5 — еслмдж теки тамакка генетикалык турленд1р1лмеген курамныц стандарттык улпсц 6 — бос тэжзрибе

15

KP СТ 1346-2005

В косымшасы

(усыпыяатып)

Сынау хаттамаларын рэамдеу улгш¹

0шм атауы (сынау зертханалары)

Сынау хаттамалары №_«_»_ 200_ж.

Кундерг сынау га тускен «_»_200_ж.

Сынаулар соцы«_»_200_ж.

0шм: Жаца шскен кызанактар

Шиюзатты немесе ешмдо ещцрунп_«Туран» ЖШС_.

0шмд1 немесе шиюзатты усы ну_«Ляззат»    сауда yni_.

Сынамаларды ipiKTey журпзшд1_КРСТРГОСТ    15810-2004

(ти1ст1 б1ркелю шиюзат немесе ешм тобыныц нормативы к кужаттарына сэйкес)

Сынамаларды ipiKTey акыЫ жэне сынауга тех ни калы к тапсырма № 8 01.07.04 ж

Сынаулар КР СТ¹ талаптар непзшде журпзшдт

Улп HOMipi    1/2004. 2/2004. 3/2004 и 4/2004

Сыналатын улпнщ сипаттамасы (тацбалау, Typi жэне орама жагдайы,

заттацба, сызыктау) _-

Тацбалау_-

_дей1н жарамды Сызыкшалы коды_.

Сынау нэтижелер1

Улп HOMipi Трансгещц ызбектшк 35S nos 1/2004 жок жок; 2/2004 бар жок; 3/2004 жок жок; 4/2004 бар бар

KP СТ 1346-2005

Талдау нэтижелерг 2/2004 жэне 4/2004 улплерде келесл трансгещц компоненттер табылды:

№ 2/2004 улпде 35S промоторлар табылды^

№ 4/2004 улпде 35S жэне nos табылды. № 2/2004 жэне 3/2004 улплерде трансгенд1 компоненттер табылмады. № 2/2004, 3/2004 жэне 4/2004 улплерде ГМИ ешмдер1 туралы хабарлайтын каптамадагы тацбалау жок, ал № 1/2004 улпде бар.

К^осымша

(анъщтамалъщ)

Библиография

[1] ТШ 9642-001-4648062-98 «Терцик МС-2» амплификатор [2] «Био-Рад зертханасы», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 170-4406 Электрофорезге арналган камера«М1т Sub Cell GT System» [3] «Био-Рад зертханасы», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 900-7980 «Power Рас 300» Кернеу K03i [4] «Био-Рад зертханасы», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 170-86-16 «Gel Doc 2000™ Gell Documentation System» видеожуйес1 [5] ТШ 9452-007-18240041-00 Эппендорф «ТЭТА», 12000-1 тур патты устел микроцентрифугасы [6] ТШ 9452-001-18240041-99 Термостат «TERMO 24-15» [V] ТШ 46-22-603-75 Электр немесе от жылытуымен су моншасы [8] ТШ 113-04-146-84 Этилендиаминтетра cipKe кышкылы (ЭДТА) [9] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Sigma»), кат. № Н 5882 L ексадецилтриметиламмониум бромид1 [Ci9H42NBr] [10] ТШ 6-09-402-85 Изопропилен спиры [СН3СНОН СН3] [П] ССТ11.029.003-80 Иондалмаган су [12] ТШ6-09-4292-76 Трис (оксиметил) аминометан [NH2C(CH2OH)3] [13] ТШ6-09-08-1024-81 2-меркаптоэтанол [C2H6OS] [14] 18 ТШ 6-09-13-452-75 Бромды этидий [C2]H20N3Br]

КАЗАХСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫЦ МЕМЛЕКЕТТ1К СТАНДАРТЫ

Биологиялык; i<a\ iiici i iiiv

Шишзат жэне тамак; ошмдер1

0С1МД1К TEKTI ГЕНЕТИКАЛЬЩ ТУРЛЕНД1Р1ЛГЕН К03ДЕРД1 (ГТК) Б1РДЕЙЛЕНД1РУ ЭД1С1

Енпзшген куш 2006-07-01

1    Колданылу саласы

Осы стандарт шиюзатка жэне тамак; ешмдерше (будан api карай - ешм) таралады жэне Ослмдж тектл генетикалык турленд1ршген кездерд1 (ГТК) б1рдейлещцру эдюш белгшейдт

Эд1с тшст1 праймерлермен полимераздьщ тлзбектл эсерде (ПТЭ) непзделген.

2    Нормативтпс сштемелер

Осы стандартта келесл стандарттарта сллтемелер пайдаланылтан:

КР СТ* Биологиялык каутслздж. Шиьазат жэне тамак ешмт Биологиялык микрочип колданып еслмдж тектл генетикалык турленд1ршген коз дер д1 (ГТК) б1рдейленд1ру эдлст.

КР СТ Р ГОСТ 51810-2004 Тутынушыларта сататын жаца шскен кызанактар. Техникальщ шарттар.

ГОСТ 12.1.004-91 Ецбек каушЫздтнщ стандарттар жуйес1. Орт каутслздт. Жалпы талаптар.

ГОСТ 12.1.005-88 Ецбек каушЫздтнщ стандарттар жуйес1. Жумыстык ауасы ауматына койылатын жалпы санитарлык-гигиеналык талаптар.

ЕОСТ 12.1.007-76 Ецбек каушЫздтнщ стандарттар жуйест Зиянды заттар. Ж1ктеу жэне жалпы каушЫздж талаптары.

ЕОСТ 12.1.019-79 Ецбек каушЫздтнщ стандарттар жуйес1. Электр каушслздт. Ж1ктеу жэне каутслздж Жалпы талаптар жэне кортау турлер1н1ц номенклатурасы.

ЕОСТ 12.4.009-83 Ецбек каушЫздтнщ стандарттар жуйес1. Объект1лерд1 кортаута арналтан орт техникасы. Heri3ri турлер1. Орналастыру жэне кызмет корсету.

Стандарт эз1рленуде

Ресми басылым

[15] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Sigma»), кат. № В 4287	Бука сарысуыныц кургак альбумин!
[ 16] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Sigma»), кат. № Д 1806	Фермент Taq-полимераза
[17] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Sigma»), кат. № Р 2192	ПЦР бар буфер MgCl2
[18] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Sigma»), кат. № А 6877	Электрофорезге арналган агароза
[ 19] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Sigma»), кат. № Р 1473	ПЦР маркер 100 и.и.
[20] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Fluka»), кат. № 53198	0амдж теки тамакка генетикалык турленд1ршген кездердщ стандарттьщ ynrici (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0)
[21] К «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Fluka»), кат. № 44386	0амдж TeKTi тамакка генетикалык турленд!ртген кездердщ стандарттьщ ynrici (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5)
[22] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Sigma»), кат. № Д 4788	2'-дезоксиаденозин-5' трифосфор кышкылы тетранатрий тузы, тригидрат (АТФ)
[23] «Сигма Алдрич» Корпорациясы («Sigma»), кат. № Д 4913	2'-дезоксицитидин-5' трифосфор кышкылы тетранатрий тузы, тригидрат (ЦТФ)

19

ГОСТ 12.4.021-75 Ецбек каушЫздтнщ стандарттар жуйест Желдетюш жуйелер. Жалпы талаптар.

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Олшеупп зертханалык шыны ыдыстар. Цилиндрлер, мензуркалар, колбалар, шыны тут1ктер. Жалпы тех ни калы к шарттар.

ГОСТ 3118-77 Туз кышкылы. Техникалык шарттар.

ГОСТ 3164-78 Медициналык вазелин майы. Техникалык шарттар.

ГОСТ 4233-77 Хлорлы натрий. Техникалык шарттар.

ГОСТ 4328-77 Натрий гидрототыты. Техникалык шарттар.

ГОСТ 9656-75 Бор кышкылы. Техникалык шарттар.

ГОСТ 6709-72 Тазартылтан су. Техникалык шарттар.

ГОСТ 9805-84 Изокрил спиртт Техникалык шарттар.

ГОСТ 12026-76 Сузпш зертханалык катаз. Техникалык шарттар.

ГОСТ 12738-77 Градуирленген мойыны бар шыны колбалар. Техникалык шарттар.

ГОСТ 14919-83 Электроплиталар, электроплиткалар жэне турмыстык куыратын электр шкафтар. Жалпы техникалык шарттар.

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Техникалык шарттар.

ГОСТ 21400-75 Химия - зертханалык эйнек. Техникалык талаптар. Сынау эдштерт

ГОСТ 24104-2001 Зертханалык таразылар. Жалпы техникалык талаптар.

ГОСТ 25336-82 Зертханалык шыны ыдыстар жэне жабдыктар. Турпаттар, непзп параметрлер жэне елшемдер.

ГОСТ 26678-85 Турмыстык электр компрессЕ параметрлж катардаты тоцазыткыштар жэне муздаткыштар. Жалпы техникалык шарттар.

ГОСТ Р 51652-2000 Тамак шиюзатынан жасалтан тазартылтан этил спиртт Техникалык шарттар.

3 Терминдер, аньщтамалар жэне кыскартулар

3.1    Осы стандартта КР СТ* сэйкес терминдер мен аньщтамалар колданылады.

Оларта косымша осы стандартта мына терминдер колданылады:

Тамара генетикалык; турленд1ршген кездер:    генетикалык

турленд1р1лген организмдерден алынтан табити немесе ецделген тур1нде адам тамакка колданылатын тамак ен1мдер1 (компоненттер);

3.2    Осы стандартта келеО цысцартулар цолданылады:

-    ПТЭ - полимеразды mi36eKmi эсер;

-    БСА - б) ка сарсуыныц цурзац алъбумиш;

-    ГМИ- генетикалъщ т\ рлеп()1р1лгеп кездер.

KP СТ 1346-2005

4 Аппаратура, материалдар жэне реактивтер

4.1    Сыйымдылыгы 0,2;    0,5;    1,5    см²    белсещц элемента

кызыту/салкындату жылдамдыгы 1,5 °С/с [1] кем емес Эппендорф тур патты микроцентрифугты тут1ктер уш1н «Терцик МС-2» турпатты амплификатор.

4.2    Кювет жэне адырлар жинатымен «Mini-Sub Cell GT System» турпатты келденец электрофорезге арналтан курал [2].

4.3    РеттелеН н кернеудщ аукымы (50-300) «Power Рас 300» турпатты кернеу K03i [3].

4.4    Видеосистема типа «Gel Doc 2000™», Бромды этидиймен боялтан, гельдеп ДНК люминисцирлейтш пдершщ бейнелерш талдау жэне кужаттау: сэулелену аукымы (300-400) нм, сез1мталдыты — 10 нг ДНК кем емес ( бромды этидий бойынша) [4].

4.5    Турмыстьщ электр тоцазыткыш ГОСТ 26678 бойынша.

4.6    Минус 20°С температураны камтамасыз етеы н ± 0,5 °С кателжпен муздататын камера.

4.7    Эппендорф турпатты устелге коятын микроцентрифуга (айналу жишп 12000 мин^-1кем емес) [5].

4.8    Сыйымдылыгы 0,5 жэне 1,5 см², температура аукымы 15 °С тан 120 °С дешн, уя саны - эр турпатты 20 кем емес, температураны устау дэлдш -0,2 °С, Kepmi уялар арасындагы айырмашылык 0,5 °С коп емес Эппендорф турпатты микроцентрифуга уттпн «TERMO 24-15» турпатты термостат [6].

4.9    «Вортекс» турпатты сшкуге арналган аппарат, айналым жылдамдыгы (250—3000) мин^-1.

4.10    Микротолкынды пеш (куаты 400 Вт кем емес).

4.11    Ец коп елшеу nieri 200 г дэлджтщ жогары сыныбыныц (шарттык 6enrici II) жалпыга арналган зертханалык таразылары ЕОСТ 24104 бойынша.

4.12Су моншасы [7].

4.13    кателш ±0,1 pH электродтар жинагымен рН-метр.

4.14    Мелшерлеудщ ауыспалы келемшен дозаторлар:

-    (0,2—2,0) мм², кадамы 0,01 мм², дэлдш +1,2 %;

-    (0,5—10,0) мм², кадамы 0,01 мм², дэлдш ±0,8;

-    (2—20) мм², кадамы 0,01 мм², дэлдш ±0,8 %;

-    (20—200) мм², кадамы 0,1 мм², дэлдш ±0,6 %;

-    (100—1000) мм², кадамы 1 мм², дэлдш ±3 %;

-    (2—10) см², кадамы 0,1 см², дэлдш ±0,5 %.

4.15    Сыйымдылыгы 0,2; 0,5 жэне 1,5 см² Эппендорф турпатты микроцентрифугалык туЕктер

4.16    Мелшерлеудщ ауыспалы келем1 10; 20; 200; 1000 мм²дешн; 10 см² дозаторларга арналган сузпнп бар уштар

4.17    Сыйымдылыгы 25; 50; 100; 200 дешн; 1000 см³ елшеупп Ty6i жал пак конусты шыны тупктер ГОСТ 12738 бойынша.

4.18    25; 100; 1000 см³ зертханалык елшеуш шыны цилиндрлер ГОСТ 1770 бойынша.

4.19    Сыйымдылыгы 1,5 см³ м и кро це нтр и фу гал ы к тупктщ олтттемше ГОСТ 21400 бойынша тефлонды пестик немесе шыны таящна

4.20    Зертханальщ сузпш цагаз ГОСТ 12026 бойынша.

4.21    Туз кыпщылы ГОСТ 3118 бойынша, х. ч.

4.22    Бор кыпщылы ГОСТ 9656 бойынша, х. ч.

4.23    Этилендиаминтетра Ырке кышкылы (ЭДТА), х. ч. [8].

4.24    Гексадецилтриметиламмониум бромид [9].

4.25    Натрий гидрототыгы ГОСТ 4328 бойынша, х. ч.

4.26    Хлорлы натрий ГОСТ 4233 бойынша, х. ч.

4.27    Тазартылган этил спирт! ГОСТ Р 51652 бойынша, х. ч.

4.28    Изопропилещц спирт, х. ч. [10].

4.29    Медицин алътк вазелин майы ГОСТ 3164 бойынша.

4.30    Хлороформ ГОСТ 20015 бойынша, х. ч.

4.31    Тазартылган су ГОСТ 6709 бойынша.

4.32    Иондалмаган су [11].

4.33    Трис (оксиметил) аминометан, х. ч. [12].

4.34    2-меркаптоэтанол, х. ч. [13].

4.35    Бромды этидий, х. ч. [14].

4.36    Буца сарсуыныц кургак альбумин! (БСА) [15].

4.37    Термотур акты фермент Taq-полимераза, (70 - 72) °С саласындагы жумыс оптимумы [16].

4.38ПЦР буфер [17].

4.39    Электрофорезге арналган агароза (тип II) [18].

4.40    ДНК салмагыныц молекулярлык маркер! [19].

4.41    Оамдж тект! тамактып генетикалык турленд!ршген кездер! (ГТК) курамыныц стандартты улг!с! (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0) [20].

4.42    Оамдж тект! тамактып генетикалык турленд!ршген кездер! (ГТК) курамыныи стандартты улпа (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5) [21].

4.43    Нуклеотидтер:

ушфосфорлы кышкылдын 2'-дезоксиаденозин-5' тетранатрийл! тузы, тригидрат (АТФ) [22];

ушфосфорлы кышкылдын 2'-дезоксицитидин-5' тетранатрийл! тузы тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ) [23];

ушфосфорлы кышкылдын 2'-дезоксигуанозин-5' тетранатрийл! тузы, тригидрат (ГТФ) [24];

KP СТ 1346-2005

ушфосфорлы кышкылдыц 2'-дезокситимидин-5' тетранатрийл1 тузы, тригидрат (ТТФ) [25];

4.44 Промоторта праймерлер 35S [26]:

-    35S-15'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС А 3';

-    35S-25'GAT AGT GGG ATT GTGCGT САЗ'.

4.45Терминатор nos праймерлер [27]:

-    nos- 15'GAA ТСС TGT TGC CGG TCT TG 3';

-    nos-25' TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'.

Жотарыда керсетшгендерге уксас тех ни калы к сипаттамаларымен метрологиялык сипаттамалары жэне жабдьщтары бар баска елшеу кур ал дар ын, сонымен катар уксас бакылау нэтижелерш алуды жэне сынау журпзумен айналысатын персонал каутслздтн камтамасыз ететш сынау кезшде колданылатын реахтивтерд1 жэне материалды колданута руксат етшедт

5    Сынамаларды тацдау

Сынамаларды ipixTeyfli тамак шиьазаттарынын, жэне тамак ешмдершщ б1рхелх1 ешм топтарына арналтан сынамаларды ipiKTey тэрыбш белплейтш техникальщ реттеу саласындаты нормативах кукьщтьщ актшер, стандарттар жэне баска нормативах кужаттар бойынша журпзедт

6    Талдау жургтзуге дайындау

6.1    KpiriiuLiep.u дайындау

6.1.1    Концентрациясы с (Трис-НС1)=1 моль/дм³ ертндщ ер д1 дайындау.

0лшеу1ш холбата ГОСТ 12738 бойынша сыйымдылыты 100 см³ (12,11 ±

0,01) г. Трис (охсиметил) аминометанды 4.33 бойынша салады, [12] 4.32, [11] бойынша 80 см³ иондалматан суда ер1тед1. Мацыздандырылган туз кышкылын ГОСТ 3118 бойынша pH ертщцш 7,5 дешн жетх1зед1, сосын иондалматан судыц белг1с1не дешн жетх1зш араластырады. Тоцазыткышта сактау мерз1м1 ГОСТ 26678 бойынша 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 6 айдан хеп емес.

6.1.2    Концентрациясы с (NaCl) ертщцш дайындау = 5 моль/дм³

Сыйымдылыты 100 см³ елшеу1ш холбага (29.22± 0.01) г хлорлы

натрийд1 ГОСТ 4233 бойынша салады, иондалматан судыц 80 см³ шамасында ерыедц иондалматан судыц белпсше дей1н жетх1з1п араластырады. Сактау мерз1м1 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 6 айдан хеп емес.

6.1.3    Концентрациясы с (NaOH) = 30 % ертндш1 дайындау

Сыйымдылыты 50 см³ холбага ГОСТ 1770 бойынша (3± 0,01) г натрий

гидрототыгын салады, ГОСТ 4328 бойынша, 7 см³ иондалмаган суда ерыедт Сактау мерз1м1 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 6 айдан хеп емес.

5

KP СТ 1346-2005

6.1.4    Концентрациясы с (ЭДТА) = 0,5 моль/дм³ ертщцш дайындау Сыйымдылыгы 100 см³ кол бага (14,62± 0,01) г этилендиаминтетра cipice

кьппкьтльтн по 4.23, [8] салады, иондалмаган судыц 80 см³ шамасында ер1тед1.

6.1.3 бойынша дайындалган натрий гидрототыгыныц ертщцЫмен, pH ертщцсш 8,0 дешн иондалмаган сумей белпге дешн жетюзш араластырады. Сактау мерз1м1 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 6 айдан коп емес.

6.1.5    Лизирлейтш буферд1 дайындау

Сыйымдылыгы 25 см³ елшеуш колбага ГОСТ 1770 бойынша (0,5±0,001) г гексадецилтриме-тиламмония бромидш салады, 10 см³ иондалмаган суда ер1тед1, автоматты микродозатормен 6.1.1 дайындалган 2,5 см³ Трис-НС1 ертщцш косады, 6.1.2, 1 см³ бойынша дайындалган 7 см³ хлорлы натрий ертщцсш, 6.1.4 бойынша дайындалган ЭДТА ертщцсш иондалмаган сумей белпге дешн жеткглп араластырады.

Сактау мерз1м1 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 6 айдан коп емес. Сактау кез1нде жауын-шашын болган кезде ер1т1нд1н1 белме температурасында устайды немесе термостатта 4.8 бойынша, [6] 65 °С температурада толы к ершенге дей1н жылытады.

Т1келей пайдалану алдында дайындалган ер1т1нд1ге автоматты микродозатормен меркаптоэтанолды 4.34 бойынша, [13] 1 см³ лизирлететш буферге 4 мм³ есеб1нен косады жэне араластырады.

6.1.6    Сумей каныккан хлороформды дайындау

Сыйымдылыгы 200 см³ колбага цилиндрмен ГОСТ 1770 бойынша (100±0,1) см³ хлороформды ГОСТ 20015 бойынша енпзедц 20 см³ иондалмаган суды ГОСТ 6709 косады, мукият араластырады жэне каныгу уш1н 24 с калдырады.

Сактау мерз1м1 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 6 айдан коп емес.

6.1.7    70 %-ды тазартылган этил спиртт1ц ертщцсш дайындау Сыйымдылыгы 200 см³ колбага (70 ±0,1) см³ цилиндрмен 96 %-ды

тазартылган этил спирт!н по ГОСТ Р 51652 бойынша, 26 см³ иондалмаган суды косып араластырады. Сактау мерз1\п 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 6 айдан коп емес.

6.1.8    Концентрациясы с (БСА) = 20 мкг/см³ертщцш дайындау Сыйымдылыгы 1,5 см³ Эппендорф турпатты тупкке (0,002±0,01) г

кургак БСА 4.36, [15] бойынша салады, 1 см³ иондалмаган суды косады, толык ершенше араластырады. 10 мм³ дайындалган ертщцш ipiKTefifli жэне сыйымдылыгы 1,5 см³ Эппендорф турпатты тутжке тасымалдайды, 1 см³ иондалмаган суды косып араластырады.

Сактау мерз1м1 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 6 айдан коп емес.

6.1.9    Концентрациясы с = 4 ммоль/дм³ нуклеотидтер коспасын дайындау Сыйымдылыгы 0,2 см³ микро центрифугалы тупкке (1 ±0,01) мм³ АТФ

(концентрациясы 100 ммоль/дм³) 4.43, [22] бойынша, (1 ±0,01) мм³ ГТФ (концентрациясы 100 ммоль/дм³) 4.43 бойынша, [24], (1 ±0,01) 1 мм³ ЦТФ

KP СТ 1346-2005

(концентрациясы 100 ммоль/дм³) 4.43 бойынша, [23], (1 ±0,01) мм³ ТТФ (концентрациясы 100 ммоль/дм³) 4.43 бойынша, [25]    (96±0,1)    мм³

иондалмаган суды енг1зед1, коспаны араластырады.

Сактау мерз1м1 минус 20 °С температурада — 6ip жылдан коп емес.

6.1.10    Электрофорезге арналган буферд11-ТВЕ дайындау

Сыйымдылыгы 1000 см³ елшеупн колбага (10,8 ±0,01) г Трис

(оксиметил) аминометанды, 5,5 г бор кышкылын ГОСТ 9656 бойынша жэне (0,92±0,01) г этилендиаминтетра cipice кыттткылын енпзедц иондалмаган сумей белпсше дей1н жетюзед1 толык ершенше араластырады.

Сактау мерз1м1 белме температурасында — 1 айдан коп емес.

6.1.11    Концентрациясы с (С21Н₂с№Вг) = 10 мг/см³ ертндош дайындау

Сыйымдылыгы 100 см³ елшеуш колбага (1±0,01) г бромды этидийд1

4.35,бойынша салады [14], ер1тед1 жэне иондалган сумей белпге дешн жетюзедт

Сактау мерз1м1 4 °С тен 5 °С дешн температурада — 12 айдан коп емес.

6.1.12    2 %-ды агарозды гельд1 дайындау

6.1.12.1    Сыйымдылыгы 200 см³ кем мес Ty6i жалпак колбага (1±0,01) г агарозаны 4.39 бойынша салады, [18], 6.1.10 бойынша дайындалган 1-ТВЕ50 см³ косады, мукият сшкш араластырады. Коспасы бар колбаны микротолкынды пеште 4.10 бойынша немесе су моншасында 100 °С температурада кызытады жэне агароза толык ер1генше кайнатады.

6.1.12.2    6.1.12.1бойынша дайындалган, ертлген агарозаны 50 °С дешн белме температурасында салкындатады, автоматты микродозатормен 6.1.11 бойынша дайындалган 5 мм³ бромды этидий ертщцсш косады, мукият араластырады.

6.1.12.3    6.1.12.2 бойынша алынган б1ркелю коспаны электрофорезге

арналган    кюветтерге    куяды    жэне адыр    кемег1мен калталарга

калыптастырады. Гель салкындаганнан кей1н (15—30) мин соц адырды жояды.

6.1.10 бойынша дайындалган электрофорезге арналган буферде1-ТВЕ, тоцазыткыштарда 4 °С тен до 5 °С дей1н температурада — 7 тэулштен коп емес сактауга болады.

6.2 Сынамаларды дайындау

6.2.1 Талданатын ешмшц ею шнбесш, ес1мд1к теки тамакка генетикалык турленд1ршмеген кездер курамыныц стандартты улг1с1н1ц шнбесш (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0) no 4.41, [20] жэне еЫмдш текЛ тамакка генетикалык турленд1ршген кездер курамыныц стандартты улпсшщ шнбесш (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5) no 4.42, [21] эр 6ipimp салмагы 70 тен 80 мг дешн сыйымдылыгы 1,5 см³ Эппендорф турпатты терт микро центрифугалы тутжке салады. Дозатор кемепмен меркаптоэтанолом по 6 Л. 5 бойынша меркаптоэтанолонмен

7

лизирленетш буферд1 эр кайсысына 200 мм³ ден косуды, дереу тефлон былтауышпен коспаны б1ркелю косата дешн езедт Эр микроцентрифугалык тутжке 600 мм³ ден меркаптоэтанолонмен лизирленет^н буферд1 косады. Крспаны мукият тефлон былтауышпен тушн болмайтындай араластырады. Сосын коспаны «Вортекс» турпатты аппаратта сшку унпн 30 с птлнде араластырады.

6.2.2    6.2.1т. бойынша дайындалтан коспаны термостатка салады, 65 °С температурада (40—60) мин инкубациялайды, сосын кайтадан сшку унпн 30 с аппаратта араластырады жэне 7 мин Эппендорф турпатты устел шатын центрифугада 4.7 бойынша айналым жишп (12000-13000) мин^-1 центри-фугалайды, [5].

6.2.3    6.2.2 бойынша дайындалтан коспалардыц тунба бетшдеп суйыктыктарды тунбадан суспензия белштерш алмай сыйымдылыгы 1,5 см³терт таза микро центрифугалы тупике салады. Сосын эр микро центрифугалы тут1кке 6.1.6 бойынша дайындалтан 400 мм³ ден хлорофорды косады, сшку унпн суспензия болганша аппаратта 30 с сшкидт Алынган суспензияны айналым жишп 12000 мин"¹ 7 мин Эппендорф турпатты устел микроцентрифугада белме температурасында центрифугалайды.

6.2.4Терт туиктен 6.2.3 бойынша дайындалтан жогаргы кабаттарын (су фазаларын) хлороформ кабатын алмай сыйымдылыгы 1,5 см³ терт таза микроцентрифугалык тупктерге аударады. Хлороформмен экстракцияны жэне 6.2.3 бойынша центрифугалауды ею мэрте кайталайды. 6.2.4 бойынша дайындалган жогаргы кабаттарын сыйымдылыгы 1,5 см³ центрифугалык тупктерге аударады, эркайсысына минус 20 °С температурата дей1н алдын ала салкындатылтан муздаткыш камерата 600 мм³ ден изопропилен спирт!и 4.28 бойынша косады, [10 жэне 30 с. сшку унпн аппаратта араластырады

Алынтан коспаларды минус 20 °С муздаткыш камерата дезоксирибонуклеин кышкылыныц (ДНК) тунбасы пайда болуы унпн 30 мин кем емес салады.

Эсы кезецде минус 20 °С температурада тоцазыткыш камерада 12с дешн алынтан коспаларды сактауга руксат етшедг

6.2.6    Айналым жишп 12000 мин^-1 6.2.5 бойынша дайындалган коспаларды белме температурасында 6 мин центрифугалайды. Байкал тунба бет! идеи суйыктьщты алып тастайды. Эр тунбаны 6.1.7 бойынша дайындалтан, (15—20) с сшкуге арналтан аппаратта тунбаларды араластырып жэне айналым жишп 12000 мин^-1 шатын центрифугада 6 мин. центрифугалап (2—3) рет 200 мм³ 70 %-ды тазартылган этил спирт!мен жуады. Мукият (соцгы тамшыга дей!н) тунба бетшдеп суйыктыкты алып тастайды.

6.2.7    6.2.6 бойынша дайындалган тунбаларды (50—100) мм³ иондалматан суда ерпед! жэне ДНК ертндюш алады.

8

1

Орындаушылар:

теп, аты-жеш теп, аты-жен1

Сынау зертханалардыц басшысы: колы

Тужырымдама сынау га усынылган улпге таралады.

17

2