ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ

УТВЕРЖДАЮ

Директор ФБУ «Федеральный центр анализа и оценки техногенного

МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ КОЛИЧЕСТВА Daphnia magna Straus ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ПИТЬЕВЫХ, ПРЕСНЫХ ПРИРОДНЫХ И СТОЧНЫХ ВОД, ВОДНЫХ ВЫТЯЖЕК из ГРУНТОВ, ПОЧВ, ОСАДКОВ СТОЧНЫХ ВОД,

ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА и ПОТРЕБЛЕНИЯ МЕТОДОМ ПРЯМОГО СЧЕТА

ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.12-06 Т 16.1:2:2.3:3.9-06

Методика допущена для целей государственного экологического контроля

МОСКВА (издание 2014 г.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

1.    Принцип методики...............................................................................................2

2.    Метрологические характеристики методики......................................................3

3.    Оборудование, материалы, реактивы..................................................................3

3.1.    Средства измерений................................................................. 3

3.2.    Вспомогательное оборудование...................................................4

3.3.    Тест-культура, материалы и реактивы.......................................... 5

4.    Условия безопасного проведения работ.............................................................5

5.    Требование к квалификации лиц, проводящих биотестирование.....................6

6.    Условия проведения биотестирования...............................................................6

7.    Подготовка к проведению биотестирования......................................................6

7.1.    Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования............7

7.2.    Подготовка проб к биотестированию............................................................7

73. Подготовка культивационной воды................................................................17

7.4.    Содержание и подготовка культуры дафний к биотестированию.............18

8.    Процедура биотестирования..............................................................................20

9.    Оценка результатов токсикологического анализа...........................................22

10.    Контроль чувствительности тест-организмов к модельному токсиканту ....24

11.    Обработка и оформление результатов токсикологического анализа............25

Библиография.........................................................................................................27

Приложение 1.........................................................................................................29

Приложение 2.........................................................................................................30

Приложение 3.........................................................................................................31

Приложение 4.........................................................................................................32

Приложение 5.........................................................................................................35

Приложение 6.........................................................................................................37

Приложение 7.........................................................................................................38

ПНДФТ 14.1:2:3.4.12-06 Т 16.1:2:2.3:3.9-06

НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДИКИ

Настоящий документ устанавливает методику определения острой токсичности проб вод (поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных) и водных вытяжек из грунтов, почв, осадков сточных вод, отходов производства и потребления по смертности тест-объекта Daphnia magna Straus в лабораторных условиях.

1. ПРИНЦИП МЕТОДИКИ

Методика основана на определении смертности дафний (Daphnia magna Straus) при воздействии токсических веществ, присутствующих в исследуемой пробе, по сравнению с контрольной культурой в среде, не содержащей токсических веществ. Количество живых и мертвых дафний определяется методом прямого счета.

Острое токсическое действие исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов на дафний устанавливается по их смертности (летальности) за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности служит гибель 50 % и более дафний за 48 часов в исследуемой пробе при условии, что в контрольном эксперименте все рачки сохраняют свою жизнеспособность.

В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают:

-    среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод или водных вытяжек из почв, грунтов, осадков сточных вод и отходов), вызывающую гибель 50 % и более тест-организмов за 48-часовую экспозицию (ЛК₅₀.48, ЛКР₅<м8);

-    безвредную кратность разбавления вод, водных вытяжек, вызывающую гибель не более 10 % тест-объектов за 48-часовую экспозицию (БКРцмв).

2

ПНДФТ 14.1:2:3:4.12-06 Т 16.1:2:2.3:3.9-06

2. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ

Настоящая методика обеспечивает получение результатов анализов с погрешностями, не превышающими значений, приведенных в таблице 1.

Диапазоны измерений определяемой характеристики, значения показателей повторяемости и воспроизводимости

Таблица 1

Диапазон измерений количества дафний, шт. Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), о, % Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), OfL% Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между тремя результатами параллельных определений), г,% Предел воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами, полученными в двух лабораториях), R, % От 0 до 7 включ. 18 20 60 55 Св. 7 до 10 включ. 10 13 33 36

3. ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Для проведения исследований по данной методике необходимы следующие средства измерений, материалы и реактивы:

3.1 Средства измерений

-    весы лабораторные общего назначения (ГОСТ Р 53228-2008);

-    гири (ГОСТ OIML R 111-1-2009);

-    pH-метр электронный любого типа, например, pH-420,

ТУ 4215-008-81696414-2007;

-    люксметр Ю116 (ГОСТ 8.014-72);

-    фотоэлектроколориметр ИПС-03, ТУ 4437-003-26218570-2006;

-    термометр цифровой «Замер-1» ТУ 4215-002-13245171-01;

-    цилиндры вместимостью 25, 50, 100, 1000 см³ второго класса точности (ГОСТ 1770-74);

-    колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2 (ГОСТ 1770-74);

-    пипетки градуированные вместимостью 1,2, 5, 10 см³ с ценой деления 0,1

з

ПНДФТ 14.1:2:3:4.12-06 Т 16.1:2.2.3:3.9-06

см³ (ГОСТ 29227-91);

-    пипетки автоматические (дозаторы) любого типа вместимостью 0,1 см³ и 0,2 см³.

3.2 Вспомогательное оборудование

-    климатостат Р-2 (ТУ 4211-004-26218570-2006) или климатостат ВЗ (ТУ 4211-008-26218570-2009), позволяющие поддерживать освещение лампами дневного света или светодиодами (1200-2500) лк, фотопериод (12+12 часов) и температуру окружающего воздуха (20 ± 1) °С;

-    устройство    для    экспонирования    рачков    УЭР-03

(ТУ 3615-006-26218570-2009) в комплекте со стеклянными пробирками объемом 100 см³;

-    культиватор КВ-05 для культивирования водорослей (ТУ 3615-006-26218570-2007);

-    центрифуга лабораторная с комплектом пробирок 50-100 см³, скорость вращения ротора 4000-5000 об/мин;

-    аппарат для встряхивания жидкости АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78;

-    холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-20 ± 1) °С и хранение проб (от +2 до +4) °С;

-    пипетки стеклянные объемом 2 cm^j с отрезанным и оплавленным концом для пересадки рачков (ГОСТ 29227-91);

-    воронки лабораторные (ГОСТ 25336-82);

-    воронка Бюхнера (ГОСТ 9147-80);

-    стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 150, 200, 250, 1000 см³ (ГОСТ 25336-82):

-    сита почвенные (ТУ 46-47-885-73);

-    шпатели металлические (ГОСТ 19126-2007);

-    пробоотборник объемом 500-700 см³ (ГОСТ 6859-72);

-    буры почвенные (ГОСТ 27753.1 -88);

-    батометр-бутылка на штанге тип ГР-16М (ТУ 25-04-1749);

- щупы    винтообразные    с продольным    вырезом, поршневые

(ГОСТ 2517-2012);

-    ножи почвенные (ГОСТ 23707-95);

-    лопаты (ГОСТ 19596-87);

-    склянки и банки стеклянные с винтовым горлом, с прокладкой и крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб вместимостью 500, 1000, 2000, 5000 см³ (ТУ 6-19-6-70);

- флаконы    и банки    цилиндрические    полиэтиленовые или

политетрафторэтановые с навинчивающимися крышками для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 100, 250, 500, 1000,2000 см³ (ТУ 6-19-45).

4

ПНДФТ 14.1:2:3 4.12-06 Т 16.1:2:23:3.9-06

3.3 Тест-культура, материалы и реактивы

-    тест-культура Daphnia magna Straus;

-    культура зеленой водоросли Chlorella vulgaris Beijer;

-    дрожжи хлебопекарные ГОСТ Р 54845-2011;

-    вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72);

-    вода питьевая (ГОСТ Р 51232-98);

-    калий двухромовокислый ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4220-75);

-    калий азотнокислый ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4217-77);

-    калий фосфорнокислый однозамещенный ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4198-75);

-    магний сернокислый 7-водный ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4523-77);

-    железо лимоннокислое Ч (ТУ 6-09-2562-77);

-    кислота борная ХЧ (ГОСТ 9656-75);

-    аммоний ванадиевокислый мета Ч или ЧДА (ГОСТ 9336-75);

-    марганец хлористый Ч или ЧДА (ГОСТ 612-75);

-    молибдена окись Ч (ТУ 6-09-4471-77);

-    цинка сульфат 7-водный ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4174-77);

-    кислота соляная ХЧ или ЧДА (ГОСТ 3118-77);

-    кислота азотная 10-%ный раствор (ГОСТ 4461-77);

-    натрия гидроокись ХЧ или ЧДА (ГОСТ 4328-77);

-    ткани шелковые (для муки и крахмала - мельничный газ) № 25-43 (ГОСТ 4403-91);

-    фильтры бумажные обеззоленные «белая лента» (ТУ 6-09-1678-77, ГОСТ 12026-76);

-    фильтры мембранные с диаметром пор 0,45; 3,5 мкм «Владипор» марки МФАС-ОС-2 (ТУ 6-55-221-1029-89), МФАС-П-4 (ТУ 6-55-221-903-88) или аналогичные зарубежного производства;

-    вата хлопковая медицинская гигроскопическая (ГОСТ 5556-81);

-    бинт марлевый медицинский (ГОСТ 1172-93).

Примечание. Допускается использование средств измерений, вспомогательного оборудования, реактивов и материалов другого типа, имеющих аналогичные метрологические и технические характеристики.

4. УСЛОВИЯ БЕЗОПАСНОГО ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ

При работе с химическими веществами, загрязненными грунтами, почвами, осадками сточных вод, отходами и сточными водами соблюдают требования техники безопасности по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.008-76.

При пробоподготовке загрязненных грунтов, почв, осадков сточных вод и отходов пользуются средствами индивидуальной защиты по ГОСТ 12.4.016-83, ГОСТ 12.4.020-82, ГОСТ 12.4.034-2001.

5

ПНДФТ 14.1:2:3:4.12-06 Т 16.1:2:2.3:3.9-06

К воздуху производственных помещений предъявляют санитарно-гигиенические требования по ГОСТ 12.1.005-88.

Безопасность при работе с электроустановками обеспечивают по ГОСТ Р 12.1.019-2009 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91* СНиП 21-01-97.

Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. После завершения работ проводится влажная уборка рабочих поверхностей.

Работающий персонал должен пройти обучение безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

5. ТРЕБОВАНИЕ К КВАЛИФИКАЦИИ ЛИЦ* ПРОВОДЯЩИХ БИОТЕСТИРОВАНИЕ

К биотестированию допускаются специалисты, имеющие опыт работы в лаборатории, освоившие методические приемы водной токсикологии и уложившиеся в нормативы контроля при освоении методики.

6. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ БИОТЕСТИРОВАНИЯ

Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях* помещение не должно содержать токсичных паров и газов.

Температура окружающего воздуха в лаборатории (17 - 27) °С. Атмосферное давление (84 - 106) кПа (630 - 800 мм рт. ст.). Освещение помещения может быть естественным или искусственным и не ограничено особыми требованиями.

Температура в климатостате Р2 (ВЗ) для биотестирования (20 ± 1) °С.

Освещение в климатостате Р2 или ВЗ обеспечивается лампами дневного света или светодиодами. Освещенность для дафний составляет (1200-2500) лк при фотопериоде (день/ночь) 12+12 часов.

7. ПОДГОТОВКА К ПРОВЕДЕНИЮ БИОТЕСТИРОВАНИЯ

Для проведения биотестирования предварительно разрабатывают программу отбора проб, готовят посуду, оборудование для отбора проб и проведения биотестирования, пробоотборники, места хранения отобранных проб, а также рабочие места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключать попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ из окружающей среды в исследуемую воду или в водные вытяжки из почв, грунтов, осадков сточных вод и отходов.

6

Редакция 2014 г.    ПНД    ФТ    14.1:2:3:4.12-06

Т 16.1:2:2:3:3.9-06

7.1.    Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования

Отбор проб воды обычно производится в посуду из пластика, а если в воде содержаться нефтепродукты, моющие средства и пестициды, то в банки из темного стекла. Отбор проб почв, осадков сточных вод и отходов следует производить в банки из темного стекла.

Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Ее промывают 10 %-ным раствором азотной кислоты. Стенки посуды сначала смачивают этим раствором, после этого оставляют на 2-3 часа и затем тщательно промывают водопроводной водой. Возможные остатки кислоты нейтрализуют раствором пищевой соды и в заключении посуду 3-4 раза промывают дистиллированной водой. Сильно загрязненную посуду, а также новую посуду промывают водой, затем заполняют 10 % раствором азотной кислоты и выдерживают не менее суток. После этого ее промывают раствором соды, водопроводной и несколько раз дистиллированной водой. Не следует использовать для мытья посуды хромовую смесь, синтетические поверхностноактивные вещества и органические растворители. Для сушки и стерилизации посуду, кроме мерной, помещают на один час в сушильный шкаф при 160±5 °С. Если емкости могут разрушаться при температуре 160 °С, то их стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121 ± 2 °С (10⁵ Па) в течение 20 мин.

7.2.    Подготовка проб к биотестированию

7.2.1. Отбор, транспортировка и хранение водных проб

Общие процедуры отбора проб вод, а также требования к устройствам для пробоотбора определены в следующих нормативных документах:

-    ГОСТ 17.1.5.04-81 «Охрана природы. Гидросфера. Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и хранения проб природных вод. Общие технические условия»;

-    ГОСТ 17.1.5.05-85 «Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков»;

-    ГОСТ 31861-2012 «Вода. Общие требования к отбору проб»;

-    ГОСТ 31862-2012 «Вода питьевая. Отбор проб»;

-    ПНД Ф 12.15.1-08 «Методические указания по отбору проб для анализа сточных вод»;

-    Р 52.24.353-2012 «Отбор проб поверхностных вод суши и очищенных сточных вод»;

Место отбора проб и периодичность отбора устанавливают в соответствии с программой исследования в зависимости от водного объекта (ГОСТ 31861-2012).

7

ПНДФТ 14.1:2:3:4 12-06 Т 16.1:2:2.3:3.9-06

В зависимости от задач исследования определяют тип пробы: точечная, составная или другая в соответствии с ГОСТ 31861-2012.

Для проведения острого токсикологического анализа надо отобрать не менее 500 см³ водной пробы.

Способы отбора, транспортировки, хранения, подготовки к выполнению биотестирования должны обеспечить неизменность состава проб в период между отбором проб и их анализом.

Пробы отбирают вручную специальными приспособлениями или с применением автоматических пробоотборников, при этом емкости для проб должны быть изготовлены из нетоксичного материала, легко выниматься из пробоотборника для очистки и мытья. При отборе пробы с поверхности водоема или водотока используют стеклянную или полиэтиленовую бутыль (Р 52.24.353-2012).

Для отбора глубинных проб воды из озер, водохранилищ, прудов и рек следует использовать батометры.

Отбор питьевых вод перед поступлением в распределительную сеть производят из кранов на водоводах, расположенных на входе в установку обеззараживания. Пробы воды распределительной сети отбирают в периоды наибольшего расхода воды (ГОСТ 31862-2012). Водопроводную воду отбирают из-под крана после интенсивного слива, многократно ополоснув его отбираемой водой. Кран антисептической обработке не подвергается.

Отбирать природные и сточные воды следует в местах наибольшего перемешивания. Отбор сточных вод необходимо производить в той части потока, где взвешенные частицы распределены более равномерно. Очищенные сточные воды необходимо отбирать до их хлорирования.

Для проведения анализа сточных вод на токсичность предпочтительно отбирать составную среднесуточную пробу, собирая ее порциями с периодичностью один час. Точечные (разовые) пробы допустимо использовать только в исключительных случаях.

Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.

Отобранные пробы наливают до краев в дважды промытые отбираемой водой банки или флаконы и закрывают без пузырьков воздуха пришлифованными стеклянными пробками или полиэтиленовыми крышками. Пробы упаковывают в деревянные ящики для переноски проб и прокладывают бумагой или ветошью. В жаркую погоду пробы для обеспечения лучшей сохранности рекомендуется транспортировать в контейнерах-холодильниках при пониженных положительных температурах. Зимой для предохранения проб от промерзания контейнеры должны бьггь оборудованы термоизолирующими прокладками. Следует избегать попадания прямого солнечного света на транспортируемые пробы.

При отборе пробы заполняют акт (см. Приложение 1), в котором отмечают:

- шифр пробы;

ПНДФТ 14.1:2:3:4.12-06 Т 16.1:2:2.3:3.9-06

-    цель пробоотбора;

-    дату;

-    время;

-    место отбора пробы;

-    температуру воды;

-    ФИО и подпись отбиравшего пробы.

На бутыли размещают этикетку с указанием шифра пробы. При отборе проб необходимо соблюдать технику безопасности.

Пробы, поступающие в лабораторию для исследования, должны быть зарегистрированы в журнале регистрации с обязательным указанием количества емкостей и номера акта, составленного при отборе проб.

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора. При невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают до (+2) - (+4) °С. В этих условиях пробы до анализа могут храниться не более суток. О продолжительности хранения проб воды делают отметку в протоколе биотестирования. В исключительных случаях, при отсутствии летучих органических веществ, допускается замораживание проб до (-20) °С ниже нуля и их хранение до двух недель. При этом следует иметь в виду, что после размораживания токсичность воды может измениться. Если пробы требуется отстаивать или фильтровать, то обе эти процедуры должны производиться до замораживания.

7.2.2. Подготовка проб воды к биотестированию

Если пробы были охлаждены или заморожены, то перед биотестированием их доводят до комнатной температуры. Крупнодисперсные включения, присутствующие в сточных водах, следует удалить фильтрацией пробы через пористый обеззоленный фильтр "белая лента". Нельзя использовать мелкопористый фильтр, например, "синяя лента", поскольку он может задерживать коллоидные вещества, что скажется на результатах биотестирования.

Природные воды фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 3-5 мкм или через пористый обеззоленный фильтр.

Используемый для обеззараживания питьевых и сточных вод активный хлор является токсическим веществом, поэтому перед биотестированием таких вод его необходимо удалить отстаиванием пробы в открытой емкости с широким горлом при температуре (+2) - (+4) °С в течение 3-5 часов.

Проба воды, подготовленная к биотестированию, должна иметь pH 7,0-8,5. Если pH пробы не укладывается в эти пределы, то устанавливается токсичность отдельно до и после коррекции кислотности пробы 10%-ным раствором HCI или 10 %-ным раствором NaOH. Коррекция pH не должна вызывать химической реакции с веществами пробы (выпадение осадка, комплексообразование) и увеличивать ее объем более, чем на 5 %. В протоколе