Федеральная служба по напору в сфере Никиты прав потребителей и благополучии человека
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств крезоксим-метила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методические указания МУК 4.1.3055—13
ББК51.23
060
060 Определение остаточных количеств крсэоксим-мстила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2013— 14 с.
1. Рачработаны сотрудниками ПГУ «Всероссийский НИИ чащиты растений» (В. И. Долженко. И. Л. Цибульская. Т. Д. Черменская. Л. С. Комарова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией но государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надчору в сфере чащиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надчору в сфере чащи ты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 5 июля 2013 г.
4. Введены впервые.
ББК 51.23
€> Росно требна. пор, 2013 © Федеральный центр гигиены н
эпидемиологии Росно требнад тора, 2013
МУК 4.1.3055—13
ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950—79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Отбор проб свеклы производится в соответствии с ГОСТ 1722-85 «Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая». Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температу рой -18 °С и хранят в герметично закрытой полиэтиленовой таре.
9. Проведение определения
9.1. Определение крезоксим-метила в зеленой массе, соломе и зерне зерновых колосовых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы
Навеску измельченной пробы (10 г - зерно, корнеплоды: 5 г - зеленая масса, солома, ботва) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 40 см5 ацетоннтрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин. центрифугируют при скорости 4 000 об./мин в течение 10 мин. фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу. К остатку добавляют 30 мл ацетонитрила и проводят повторную экстракцию. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе при температу ре нс выше 40 °С. Остаток переносят в делительную воронку тремя порциями ацетонитрила по 10 см3, насыщенного гексаном, и дважды промывают гексаном по 10 см3. Ацетонитрильный слой собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температу ре нс выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.
9.2. Очистка на двух последовательных патронах для твердофазной жстракцни
Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1). количественно переносят двумя порциями гексана по 1 см3 на подготовленные патроны (п. 7.5). Промывают патроны 10 см3 гексана. Крсзок-сим-мстил элюируют 12 см3 смеси гсксан-этилацстат (9 : 1 по объему). Элюат количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см3 и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре нс выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50 : 50) и анализируют на содержание крезоксим-метила по п. 9.3.
11
9.3. Условия хроматографирования Ультраэффсктивный жидкостный хроматограф с быстросканирую-щим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка (100x2,1) мм, 1,7 мкм, заполненная сорбентом с функциональными группами С18. связанными этиленгибридными мостиками.
Температу ра колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50 : 50. Скорость потока элюента 0.2 см3/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.
10. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание крезоксим-метила в пробе (X мг/кг) вычисляют по формуле:
X_SXKV 100
р 'г
Sx - площадь пика крезоксим-метила на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU):
К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости:
К - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа. см3:
Р - навеска анализируемого образца, г:
/- полнота извлечения крезоксим-метила. приведенная в табл. 2. %.
Содержание остаточных количеств крезоксим-метила в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор крезоксим-метила с концентрацией 1,0мкг/см\ разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придел повторяемости:
2Щ- <52|ЧОО«5, + 02)
МУК 4.1.3055—13
XtlX2 - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г = 2.8аг).
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
( Г) ± Д) мг/кг при вероятности Р = 0.95. где
О - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг:
Д - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
бд
100
6 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций). %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещество в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0.01 мг/кг*. где * - 0.01 мг/кг - предел обнаружения крезоксим-метила в зерне).
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрнлабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Сд должна удовлетворять условию:
Я* = D,3 + D,,3r где
,йУ) ~ характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг: при этом:
Дл = ± 0.84 Д. где
13
А - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
S-0
S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций). %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
Кк.= ду-5-Сд. где
5 У, О, Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки. соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
*~W.o,+ DU (о
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
KJS*, (2)
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, нс должно превышать предел воспроизводимости (R):
Xjy Х2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг:
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.
МУК 4.1.3055—13
УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в с(|)срс защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
5 июля 2013 г.
Дата введения: с момента утверждения
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств крезоксим-метила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методические указания МУК 4.1.3055—13
Свидетельство о метрологической аттестации от 18.01.2013 № 01.5.04.121/01.0004343/2013.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэф(|>сктивной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации крезоксим-метила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций 0.01—0.1 мг/дм1.
Методические указания носят рекомендательный характер.
Название действующего вещества по ИСО: крезоксим-метил.
Название действующего вещества по ИЮПАК: (Е)-метил-2-мето-ксинмнно-2-{2-(о-толилокси-метнл)феннл}ацетат.
Структурная формула:
Эмпирическая формула: CigH^O*
Молекулярная масса: 313.4.
Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество со слабым запахом.
Температу ра плавления: 97.2—101.7 °С.
Давление пара при 20 °С: 2.3 * 10 3 мПа.
Растворимость (в г/дм3 при 20 °С): вода - 0.002. гептан - 1.7. толуол - 111. дихлорметан - 939. метанол - 14.9. ацетон - 217. этилацетат - 123.
Стабильность к гидролизу при 20 °С: DT50 = 34 дня (pH 7), 7 ч (pH 9). В биологически активных почвах в аэробных условиях крезок-сим-метил быстро разрушается: DT90 = менее 3 дней.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность LD50 для крыс более 5 000 мг/кг. острая дермальная токсичность LD*» для крыс превышает 2 000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, нс обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами. Нс токсичен для пчел, дождевых червей, полезных насекомых и птиц.
Область применения препарата
Синтетический фунгицид из класса строб илу ри нов. являющихся продуцентами гриба Slrobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых. технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и искореняющим действием.
В России для крсзоксим-метила гигиенические нормативы нс установлены.
1. Погрешность измерений
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и се составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности /> = 0.95 нс превышает значений, приведенных в табл. 1. для соответствующих диапазонов концентраций.
4
МУК 4.1.3055—13 Таблица 1
Метра пн ическис параметры |
Объект
анализа |
Диапазон оиреде.ля-емых конце! пра-ций, мг/кг |
1 Указатель повторяемости (относ тельное среднек ва.лраги-ческое отклонение повторяемости), аг, % |
Показатель внутри.лабораторной прецизионности, ол„ % |
11оказа-тель воспроизводимости.
Or-,% |
1 Указатель точности* (границы о п юс т ельной по-
ЦХ.Ч11НОСП1).
±3, % |
Зеленая масса |
0,01—0,1 |
6 |
8 |
10 |
20 |
Солома |
0,01—0,1 |
6 |
8 |
10 |
20 |
Зерно |
0,01—0,1 |
7 |
8 |
11 |
23 |
Ботва |
0,01—0,1 |
7 |
8 |
11 |
23 |
Корнеплода |
0,01—0,1 |
7 |
9 |
12 |
25 |
* Соответствуег расширенной неопределенности 1'^ при кодффшшеше охвата А-=2 |
|
Таблица 2 |
Полноia извлечении крезокенм-метила, стандартноеотклонение, доверительный интервал среднего результата для п - 20, /*= 0,95 |
Анализируемый обл>ект, мг/кг |
Предел обнаружения, мг/кг |
Диапазон определяемых кон-цешраний, мг/кг |
Сре;щее
значение
определе
ния,
% |
Стандартное отклонение.
S, % |
Доверительный интервал среднего результата. ±% |
Зеленая масса |
0,01 |
0,01—0,1 |
89,5 |
2,65 |
1,32 |
Солома |
0,01 |
0,01—0,1 |
89,8 |
2,36 |
1,18 |
Зерно |
0,01 |
0,01—0,1 |
91,0 |
3,37 |
1,68 |
Ботва |
0,01 |
0,01—0,1 |
92 Д |
3,31 |
1,65 |
Корнеплоды |
0,01 |
0,01—0,1 |
88,7 |
7,46 |
3,73 |
|
2. Метод измерений |
Методика основана на определении крезоксим-мстила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом. очистки экстракта промывкой гексаном и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.
Идентификация крсзоксим-мстила проводится по времени удерживания. количественное определение - методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства илмерепии Жидкостный хроматограф с быстросканнру-ющим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0.2 мг
Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0.1 г Колбы мерные на 10. 100 и 250 см3 Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1 000 мм3 и от 1 до 5 см3 Цилиндры мерные на 50 и 100 см3
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Ацетонитрил, хч
Вода для лабораторного анализа (бидистилли-рованная. деионизованная) н-Гсксан. хч
Кислота орто(|юс(1юрная (Н3Р04), хч Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0.005 М H^PO j в соотношении 50 : 50 Смесь н-гсксан-этилацстат в соотношении 9 : 1 по объему
Крсзокси.м-мстил. аналитический стандарт.
98.3 %
Этила цстат. хч
Примечание. Допускается иснользовашю реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
МУК 4.1.3055—13
3.3. Вспомогите.iьныеустройства и материи, im
Аналитическая колонка с функциональными группами С18. свя занными этиленгибридными мостиками (100 х 2.1) мм. 1.7 мкм Аппарат для встряхивания проб Воронки делительные, вместимостью 250 см3 Воронки химические конусные Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 25 и 100 см3
Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабо кислотным сорбентом на основе силикагеля. 0.4 г Пробирки полипропиленые центрифужные с крышками объемом 50 см3 Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар
Фильтры бумажные средней плотности Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4 000 об./мин
Примечание. Допускается применение оборудования аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007—76. требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009. а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе нс должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313—03 и 2.2.5.2308—07.
Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.
7
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методик) и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
6. Условия измерений
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности нс более 80 %:
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к определению 7. /. Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0.1—0.2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.
7.2. Приготовление растворов
7.2.1. 0,005X/ раствор ортофосфорной кислоты: в мерную колбу объемом 1 дм3 помещают (0.5 ±0.01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0.005 М раствором ортофос(|юрной кислоты в соотношении 50 : 50 по объему, используя мерные цилиндры.
7.2.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1. встряхивают в течение 2 мин. после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.
7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску крезоксим-метила (50 ± 0.5) мг помешают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
Градуировочные растворы с концентрациями крезоксим-метила 0.05: 0.1: 0.2: 0.5: 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного раз-
МУК 4.1.3055—13
давления по объему, используя раствор подвижной фаты (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50 : 50).
7.3.2. Раствор № I с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0.2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фатой.
7.3.3. Раствор ЛЬ 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фатой.
7.3.4. Раствор ЛЬ 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фатой.
7.3.5. Раствор ЛЬ 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фатой.
7.3.6. Раствор ЛЬ 5 с концентрацией 0,05мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0.5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фатой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0—4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.
При изучении полноты определения крезоксим-метила в зеленой массе, соломе и терне терновых колосовых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
7.4. Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация крстоксим-мстила в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (нс менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, нс менее 4 точек по диапазон) измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации крстоксим-мстила в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:
С = KS. где
S- площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
9
МУК 4.1.3055—13
Градуировочную характеристик) необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
IС-С Л
—~• НЮ где
С - аттестованное значение массовой концентрации крсзоксим-метила в градуировочном растворе:
Ск - результат контрольного измерения массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе:
АКонтр. - норматив контроля градуировочного коэффициента. % (к,онтр= 10 % при Р = 0.95).
7.5. Подготовка патронов для очистки жстрактов
Два последовательно соединенных патрона для твердофазной экстракции. заполненные гидрофильным слабо кислотным сорбентом на основе силикагеля промывают последовательно 6 см3 смесью гсксан-этилацетат (9 : 1, по объему) и 4 см3 гексана, после чего они готовы к работе.
7.6. Проверка хроматографического поведения крезоксим-метила па патронах
В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора крезоксим-метила с концентрацией I мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 гексана и переносят на подготовленные патроны. Колбу обмывают 1 см3 гексана и смыв тоже вносят на патроны. Промывают патроны К) см3 гексана, элюат отбрасывают. Затем элюируют крсзоксим-метил смесью гсксан-этилацетат (9 : 1 по объему) со скоростью 1—2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы (ацетонитрил-0.005 М Н^РСЬ. 50 : 50) и анализируют по п. 9.3.
Фракции, содержащие крезоксим-метил объединяют.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения мнкроколи-чсств пестицидов» (от 21.08.79 №2051—79). а также в соответствии с
10
1