Государствекиое санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2331-08

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2331-08

МУК 4.1.2331-08

бочая длина волны 270 нм. Аналитическая колонка Spherisorb ODS2 (150 х 2.1) мм, 3 мкм (Waters) для анализа воды, почвы, клубней и ботвы картофеля. Подвижная фаза ацетонитрил - 0.05 % трифторуксусная кислота в соотношении 20:80. Скорость потока элюента 0.2 см³/мин. Дозируемый объем 20 см³.

Время удерживания клотианидина 8.2±0Л мин.

3. Обработка результатов анализа

Содержание клотианидина в образцах воды, почвы, клубней и ботвы картофеля (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S₂ С V

Si-Р

где S_r площадь пика клотианидина в стандартном растворе, (мВ* сек); S₂- площадь пика клотианидина в анализируемой пробе, (мВ*сек); V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г

С - концентрация стандартного раствора клотианидина, мкг/см³. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клотианидина 1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придела повторяемости(1):

Ъ |ХгХ₂М0О

------------------<_г (!)

(Xt +Х₂)

где Хь Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г = 2.8сг_г).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов Результат анализа представляют в виде:

__    (X    ± Д) мг/кг при вероятности Р=0.95,

где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных 10

МУК 4.1.2331-08

приемлемыми, мг/кг;

Д - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Д = 6*Х/100,

8 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде;

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0.005 мг/кг*, где *-0.005 мг/кг - предел обнаружения).

6, Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

6Л. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6,2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок. Величина добавки С₅ должна удовлетворять условию:

Сз *= А + АлД >

где ± А _л,х (± Д_л,х ) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Д _л - ± 0.84 Д , где А - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

Д = 5*Х /100,

6 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = Х'-Х-С_э,

где Х\ X, С₅ - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п.4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

11

МУК 4.1.2331-08

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

К = ^Д\_х.+А^гл,х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|К_к|<К,    (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

63. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

2- |Х₁-Х₂|- ЮО

----------------------<R,    (3)

(Х,+Х₂)

где Хь Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

7. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12,1.004-91.

8. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п.6..

12

МУК 4.1.2331-08

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

15 февраля 2008 г.

Дата введения: 10 апреля 2008 г.

4Л. Методы контроля. Химические факторы

Определение остаточных количеств клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2331-08

1* Вводная часть

Действующее вещество: клотианидин. Структурная формула:

СН2

(Е)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил -2-нитрогуанидин (ШРАС).

Мол. масса: 249.7.

Брутто формула: C₆H₈CIN₅02S.

Клотианидин представляет собой порошок без цвета и запаха. Температура плавления 176.8°С. Давление пара - 1.3x10"⁴ мПа (25°С). Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода Кo_W lgP = 0.7 (25°С). рКа= 11.09 (20°С).

Растворимость в воде (20°С) - 0.304 (pH 4), 0.34 (pH 10) г/дм³, Растворимость в гептане < 0.00104, в ксилоле 0.028, дихлорметане 1.32, метаноле 6.26, октаноле 0.938, ацетоне 15.2, этилацетате 2.03 г/л (25°С).

3

МУК 4.1.2331-08

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс LD₅₀ >5000 мг/кг, ингаляционная токсичность для крыс LC50 (4 ч) >6.1 мг/л. Не мутаген, не онкоген для крыс и мышей, не тератоген для крыс и кроликов. При прямом контакте опасен для пчел, не опасен при использовании в качестве протравителя и в случае обработок не непосредственно на цветущие культуры.

Область применения: инсектицид из группы неоникотиноидов для борьбы с сосущими и грызущими насекомыми на рисе, кукурузе, рапсе, овощных и фруктовых культурах. Используется для протравливания семян, обработки почвы и вегетирующей культуры.

Гигиенические нормативы для клотианидина в России не установлены.

2. Методика определения клотианидина в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.7./. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств клотианидина в воде водоемов в диапазоне концентраций 0.001-0.01 мг/кг, в почве - 0.05-0.5 мг/кг, в клубнях картофеля -0.01-0.1 мг/кг и в ботве картофеля - 0.02-0.2 мг/кг.

Методика основана на определении клотианидина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов ацетоном (ботва и клубни картофеля) или водно-ацетоновой смесью (почва) с последующей очисткой методом твердофазной экстракции.

2.7.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0.95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности), ±5, % Стандартное отклонение повторяемости, СГг, % Предел повторяемо сти, Г,% Предел воспроизводимости, R, % Вода 0.001 -0.01 100 4.2 11.8 16.5 Почва 0.05-0.1 50 5.0 14.0 19.6 Почва о \ о 25 4.8 13.4 18.7

4

МУК 4.1.23314)8

Ботва 0.02-0.1 50 5.4 15.1 21.1 Ботва 0Л -0.2 25 5.0 14.0 19.6 Клубни 0.01-0.1 50 5.9 16.5 23.1

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (п=20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения клотианидина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для п — 20, Р = 0.95

Анали зируе мый объект Предел обнаружения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Среднее значение определения % Стандартное оггклонение, S,% Доверительный интервал среднего результата, ±, % Вода 0.001 0.001-0.01 87.4 4.8 4.4 Почва 0.05 0.05-0.5 96.5 5.2 4.7 Ботва 0.02 0.02-0.2 81Л 5.6 5.1 Клубни 0.01 0.01-0.1 85.7 6.3 5.7

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения клотианидина достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

2*2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «Криохром», сорт 1 или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная или деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Клотианидин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.

Кислота трифторуксусная, ч, ТУ 6-09-3877-80, свежеперегнанная; 0.05 % водный раствор.

Метанол, хч, ГОСТ 6995-77.

Этилацетат, хч, ГОСТ 22300-76с изм. № 1,2,3.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,05М % триф-торуксусной кислоты (30:70 или 20:80, по объему).

Патроны для твердофазной экстракции Диапак С16 («БиоХимМак СТ»).

Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем 60 (0.040-0.063 шш), Merck.

5

МУК 4.1.2331-08

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстро-сканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или «Breeze» фирмы «Waters» или аналогичный.

Аналитические колонки ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100x2.1) мм, 1,7 мкм (Waters) и

ACQUITY UPLC ВЕН Phenyl (100x2.1) мм, 1,7 мкм (Waters) или Spherisorb ODS2 (2.1 х 150) мм, 3 мкм (Waters).

Баня ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008 или аналогичная.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001 или аналогичные.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, Buchi R-205 или аналогичный.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Испаритель одноканальный ^ППЭ-2300" для концентрирования экстрактов в токе азота.

Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2, ТУ 5.375-4261-76.

Бидистиллятор.

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами).

Шприц медицинский с разъемом Льюера, ГОСТ 22090.

PH-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25 336-82.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 см³, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50,100 и 1000 см³, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 см³, ГОСТ 22292-74.

Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 мм³ и от 1 до 5 см³.

Сито с диаметром ячеек 1 мм.

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 «Картофель свежий для переработки на продукты питания»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб». Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед ана-

МУК 4.1.23314)8

лизом сухую почву доводят до стандартной влажности и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остаточных количеств пестицидов хранят в морозильной камере при температуре -18°С.

2.5, Подготовка к определению

2.5. 1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.5.2. Кондиционирование колонки Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0.1 — 0.2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов Для приготовления 0.05 % раствора трифторуксусной кислоты 0.5 см³ свежеперегнанной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, доводят объем до метки бидистиллированной или деионизованной водой и перемешивают.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску клотианидина (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 см³, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0.5 мг/ см³). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1, 0.2, 0.5, 0.75 и 1.0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы ~ смесь ацетонитрила и 0.05 % трифторуксусной кислоты (20:80, по объему). При изучении полноты извлечения клотианидина используют ацетонитрильные растворы вещества.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизи-рованном или тефлоновом флаконе при температуре СМ-°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего

дня.

2.5.4. Построение градуировочного графика Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация клотианидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для ка-

7

МУК 4.1.2331-08

ждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клотианидина в градуировочном растворе.

2.5.5.    Подготовка приборов и средств измерения Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.6.    Подготовка концентрирующих патронов

для очистки экстракта

2.5.6.1.    Кондиционирование патрона, заполненного гексадецилси-ликагелем - Диапак С16, осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 2 мл метанола и воды. Элюат отбрасывают.

2.5.6.2.    Кондиционирование патрона для дополнительной очистки экстрактов клубней и ботвы, заполненного Силикагелем 60 (0.5 г), осуществляют пропусканием 2 мл этилацетата.

2.6. Проведение определения

2.6. L Определение клотианидина в пробах воды Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 25 см³

пропускают через кондиционированный концентрирующий патрон, заполненный гексадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Клотиани-дин элюируют 5 см³ ацетона. Элюат выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С и сухой остаток растворяют в 0.25 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ. 10 мм³ раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение клотианидина в пробах почвы Образец почвы массой 10 г, предварительно просеянной через сито, помещают в коническую колбу емкостью 100 см³ с притертой пробкой, прибавляют 10 см³ воды и 40 см³ ацетона. Колбу помещают в ультразвуковую баню и экстрагируют клотианидин в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр «красная лента»), осадок на фильтре промывают 5 см³ ацетона. Экстракцию повторяют, используя в качестве экстрагента 50 см³ смеси ацетон — вода (4:1). Фильтрат упаривают на ротационном испарителе (40°С) до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный по п.2.5.6, патрон с октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Колбу ополаскивают дважды порциями по 3 мл ацетонитрила и смывы также пропускают через тот же патрон. Фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 см³ ацетона. Элюат собирают, выпаривают

МУК 4.1.2331-08

досуха на ротационном испарителе (40°С) и сухой остаток растворяют в 5 см³ подвижной фазы. 10 мм³ вводят в жидкостный хроматограф.

2,6.3. Определение клотистидина е пробах клубне и ботвы картофеля Навеску измельченных клубней или нарезанной ботвы картофеля массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 см³. Прибавляют 50 см³ ацетона и экстрагируют клотианидин на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром «красная лента». Экстракцию повторяют с 50 см³ ацетона, выдерживая в ультразвуковой ванне в течение 15 мин, суспензию фильтруют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40°С до полного удаления ацетона. Дальнейшую очистку проводят на патроне Диапак С16. Водный остаток пропускают через откондиционированный по п. 2.5.6. патрон, ополаскивают колбу 2 см³ воды и тоже пропускают через патрон. Объединенный фильтрат отбрасывают. Клотианидин элюируют 5 см³ ацетона в чистую круглодонную колбу объемом 10 см³ и отдувают ацетон в токе азота. Сухой остаток растворяют в 1 см³ этилацетата и выдерживают колбу в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Экстракт для дополнительной очистки вносят в подготовленный концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 2 см³ этилацетата. Фильтрат и промывку отбрасывают. Клотианидин элюируют 1 см³ ацетона. Ацетон удаляют из элюата током азота (с помощью испарителя одноканального). Сухой остаток при анализе клубней растворяют в 2 см³, а ботвы — в 4 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстро-сканирующим УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка 1 - ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100x2.1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе воды. Колонка 2 - ACQUITY UPLC ВЕН Phenyl (100x2.1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе проб почвы, клубней и ботвы картофеля. Температура колонки 30±1°С. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0.05 % трифторуксусная кислота в соотношении 30:70 и скорости потока 0,1 см³/мин (колонка 1) и 20:80 и скорости потока 0.15 см³/мин (колонка 2). Рабочая длина волны 270 нм. Объем вводимой пробы 10 мкл. Время удерживания клотианидина 4.4 ±0.05 мин (колонка 1) и 5.4±0.1 мин (колонка 2).

Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф «Breeze» фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Ра-

9