УТВЕРЖДАЮ Главный государственный

санитарный врач Российской Федерации-Первый заместитель Министра здравоохранения Российской /Федерации

.Онищенко

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение массовой концентрации клозантела в органах и тканях животных, плазме и молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК4.1.//ЯГ -04

1. Область применения

Методические указания по определению массовой концентрации клозантела в продуктах питания животного происхождения предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции органами и учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации/ а также могут быть использованы организациями, осуществляющими контроль качества пищевых продуктов в соответствии с санитарными правилами и нормами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. СанПиН

2.3.2.560-96», аккредитованными в установленном порядке.

2. Общие положения

Клозантел - противопаразитарный препарат обладает широким спектром активности против экто- и эндопаразитов. Действует на зрелые и личиночные стадии развития паразитов.

Проявляет ярко выраженную активность против трематод, желудочно-кишечного тракта нематод, личинок оводов, чесоточных клещей у крупного и мелкого рогатого скота. Клозантел обладает также высокой эффективностью при фасииолезе.

На основе клазантела и его натриевой соли производится ряд ветеринарных препаратов.

Настоящие    методические    указания    устанавливают

хроматографическую методику количественного анализа продуктов питания животного происхождения на содержание клозантела с нижним пределом измерения 0,1 мг/кг.

3. Физико-химические свойства, токсикологическая характеристика и гигиенические нормативы

C22H14CI2J2N2O    Мол.    масса:    663,08

Клозантел,    относящийся    к    классу    производных

салициланилидов,    представляет    собой порошок белого или

желтоватого цвета, не растворяется в воде, слабо растворяется в    низших    спиртах.

МУК 4.X

хлороформе, растворяется в демитилсульфоксиде, диметилформали-де, диметилацетамиде, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле. Натриевая соль клозактела - клозантела натрий дигидрат растворяется в низших спиртах.

Температура плавления (Тп._т) - 217,8®С.

Cl CN

Клозантел относится к умеренно опасным веществам 3 класса опасности: ЛД50 при пероральном введении Оелым крысам составляет 2300 мг/кг. В терапевтической (10 мг/кг) и повышенных дозах препарат не обладает эмбриотоксическими, тератогенными, мутагенными и аллергенным свойствами.

4. Погрешность измерения

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью не превышающей 22% при доверительной вероятности -0, 95.

5. Метод измерений

Измерения массовой концентрации клозантела основаны на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением УФ-детектора на колонке с обращенной фазой после экстракции его органическими растворителями из органов и тканей животных, плазмы с последующей очисткой экстрактов. Детектирование ведут при длине волны 237 нм.

Чувствительность метода составляет 0,1 мкг в пробе, нанесенной на колонку.

Л 90

МУК 4.1

6. Средства измерения, вспомогательные устройства, натариади,

реактивы, растворы

6.1. Средства измерения

•    аналитический хроматограф. Waters или аналогичный с УФ-детектором, инжектором с объемом дозирующей петли - 0,05 см*, с компьютерной системой обработки хроматографических данных (или с интегратором);

•    весы аналитические 2-го класса точности, ГОСТ 24104-88;

•    весы микроаналитические, точность взвешивания до 4-го десятичного знака, Chan (США) или аналогичные;

•    автоматические пипетки, ТУ 64-1-3329-81;

•    колбы мерные, вместимость» 100 мл, ГОСТ 1770-74;

•    цилиндры градуированные, вместимостью 100 мл, ГОСТ 1770-74;

•    шприц Гамильтона (Швейцария).

6.2 Вспомогательные устройства

•    центрифуга, центрифужные полиэтиленовые пробирки, вместимостью 50 и 15 мл;

•    ультразвуковой диспергатор УЗДН-1М или аналогичный;

•    миксер или гомогенизатор;

•    холодильник;

•    колонка аналитическая Диасорб-130-С16Т 250x4 мм, с размером частиц 6 мкм (фирма «БиоХимМак», Россия) или аналогичная;

•    аппарат для упаривания - Vortex, Evaporater и др.;

•    роторный испаритель с колбами;

•    сушильный шкаф;

•    патроны Cil (фирма «БиоХимМак», Россия);

•    сцинтиляционные флаконы («Сигма», каталог 2001-2002 гг.

» .)

МУК 4.1

6.3. Реактивы

•    ацетонитрил, хроматографически чистый ТУ ИРЕА 22-66 или импортный;

•    гексан;

•    спирт бутиловый третичный;

•    спирт этиловый, ГОСТ 5964-84;

•    спирт метиловый, ГОСТ 6995-67;

•    хлороформ;

•    стандартный образец - клозантела натрия дигидрат, поставляемый НБЦ «Фармбиомед», содержание действующего вещества указано на этикетке.

7.    Требования безопасности

7.1.    При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

7.2.    При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

7.3.    При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

8.    Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы на жидкостном хроматографе.

9.    Условия измерений

9.1.    Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±10) °С, атмосферном давлении 84-106 кПа и влажности воздуха не более 80%.

9.2.    Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

272

МУК 4.1

9.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

10. Подготовка к выполнению измерения

10.1.    Приготовление растворов

10.1.1.    Стандартный раствор дигидрата клозантела натрия

Готовят основной раствор клозантела натрия дигидрата в метиловом спирте таким образом, чтобы в 100 см³ раствора содержалось 4 мг клозантела. Раствор хранению не подлежит.

Из основного раствора следующие разведения градуировочных растворов: в стеклянные пробирки объемом 5 см³ вносят 1,0; 0,5; 0,1; 0,02 и 0,01 см³ основного раствора и доводят объем до 1 см³ метиловым спиртом.

10.1.2.    Раствор элюента готовят путем смешивания метилового спирта с ортофосфорной кислотой 0,01М в соотношении 9:1.

10.2.    Подготовка прибора

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.

10.3.    Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, включающую взаимосвязь величины хроматографического сигнала от массы анализируемого вещества в хроматографируемом объеме пробы, устанавливают по методу абсолютной калибровки с использованием серии подготовленных градуировочных растворов, содержащих 40; 20; 10; 4; 0,8 и 0,4 мкг клозантела/см³. На аналитическую колонку наносят по 0,05 см³ подготовленных растворов.

Условия детектирования:

Подвижная фаза - метиловый спирт:    ортофосфорная    кислота

0,01 М в соотношении 9:1.

Скорости потока - 1 см³/мин; давление 120-160 бар. Чувствительности детектора - 0,05.

Длина водны - 237 им.

МУК 4.1

На хроматограмме отмечают пик со временем удерживания 7

мин.

По результатам анализа калибровочных образцов строят калибровочный график - на оси абсцисс откладывают количество клозантела, нанесенного колонку, на оси ординат - площадь пика .

10.4. Отбор проб

Отбор проб, для анализа ведут в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения количеств пестицидов», № 2051 от 21.09.79 (Москва).

В день забоя животных пробы органов и тканей берут по 200-500 г, помещают в целлофановые пакеты (для каждого органа -свой пакет). Пакеты снабжают этикетками, на которых указывают: дату забоя животного, название органа.

Пробы для анализа хранят в морозильнике при температуре от -18®С до -20°С (допускается хранение до 2-х месяцев).

Кровь отбирают в пробирки с гепарином и центрифугируют. Супернатант хранят в морозильнике при температуре -20^вС.

10.5 Подготовка проб к определению

10.5.1 Экстракция и очистка экстрактов

Плазма

1 см³ плазмы помещают в сцинтиляционный флакон, туда же добавляют 2 см³ ацетонитрила и 4 см³ хлороформа. Пробы встряхивают на вортексе 10 мин., затем центрифугируют при 1000 g в течение 15 мин. Органическую фазу переносят в сцинтиляционный флакон объемом 20 см³ и упаривают досуха в вакуумном сушильном шкафу при температуре 50°С. Экстракцию плазмы проводят дважды. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды промывают 0,5 см³ гексана. Гексановые экстракты отбрасывают, а ацетонитрильный раствор упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 см³ метанола и обрабатывают ультразвуком в течение 1 минуты.

МУК 4.1

Раствор используют для хроматографии.

Мышцы, почки и печень

Полученные пробы ткани выдерживают в морозильной камере при Т “ -18°С в течение 1 суток. Затем медленно оттаивают при Т » 4 “С 8 течение 12 часов. Пробы вновь замораживают при Т - -18°С на 1-2 часа, оттаивают при комнатной температуре.

Навеску 5,0 г измельчают в гомогенизаторе (или острыми ножницами) и помешают в сиинтилляционный флакон, добавляют б см³ ацетонитрила, пробы обрабатывают на ультразвуковой бане в течение 5 минут. Затем встряхивают на вортексе 10 минут и центрифугируют 1000*д в течение 15 минут. Экстракт переносят в сцинтиляционный флакон объемом 20 см³, остаток повторно экстрагируют 4 см^э ацетонитрила и упаривают досуха в вакуумном сушильном шкафу при температуре 45"С (при упаривании добавляют небольшое количество третичного бутилового спирта для избежания вскипания, для удаления остатков воды добавляют небольшое количество ацетонитрила). Сухой остаток растворяют в 4 см³ ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды промывают 3 см³ гексана. Гексановые экстракты отбрасывают, а ацетонитрильный раствор упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила. Обрабатывают ультразвуком в течение 1 минуты. Раствор используют для хроматографии.

Экстракты из печени перед хроматографированием подвергают очистке на патронах С1 следующим образом: патрон С1 уравновешивают 5 см³ ацетонитрила. На патрон наносят образец экстракта из печени объемом 1см³ и элюируется 5 см³ ацетонитрила. Элюат упаривают досуха при температуре 45*С. Сухой остаток растворяют 1 см³ ацетонитрила. Раствор используют для хроматографии.

11. Выполнение измерений

Анализ включает не более 10 испытуемых образцов. Перед началом и в конце работы проводят анализ стандартного образца, чтобы убедиться в стабильности работы системы.

МУК 4.1

Объем наносимой на колонку пробы для всех объектов составляет 0/05 см³.

Условия проведения процесса хроматографирования описаны в разделе для стандартного образца.

12. Обработка результатов

Для обработки результатов хроматографирования используется программа «Мультихром». На хроматограммах исследуемых образцов определяют площадь пиков, по времени удерживания соответствую-тих пикам стандарта клозантела.

По калибровочному графику находят содержание клозантела в объеме инжектируемой пробы испытуемого образца.

Содержание клозантела в образце рассчитывают по формуле:

Скп.иУ,

УУ,к

Скп. - концентрация клозантела в образце, мкг/см³;

Скп.и - содержание клозантела в объеме инжектируемой пробы образца, определяют по графику, мкг;

V, - объем пробы, нанесенной на колонку, см^? (0,05 см³)

V; - объем пробы, подготовленной для ВЭЖХ, см³ (1 см³);

Vs - объем пробы плазмы, взятой для экстракции;

К - коэффициент, учитывающий степень извлечения клозантела (получен при постановке модельных опытов с внесением известных количеств клозантела, К ■ 0,8).

Разработчики:: к.м.н. В.Г. Тер-Симоняк, kjc.h. С.В. Авчук, к.б.н. 6.Б. Кругляк,.

(ООО НБЦ «Фармбиомед». Москва)

JL7£