Методика зарегистрирована в Федеральном реестре методик выполнения измерений, применяемых в сферах распространения государственного метрологического контроля и надзора

(регистр, код ФР. 1.31.2004.01071;

МУ 08-47/141

(по реестру аккредитованной метрологической службы Томского политехнического университета)

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДОБАВКИ.

ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВИТАМИНОВ С, Bi₉ В₂, Е и КВЕРЦЕТИНА

взамен МУ 08-47/115

Томск

2

импульсный режим развертки потенциала и имеющий возможность дифференцирования вольтамперограммы в виде первой производной (использование по приложениям Б, В, Г, Д и Е).

Допускается использовать другое оборудование и приборы, позволяющие воспроизводить технические и метрологические характеристики, указанные в данной методике анализа.

7.1.2    Электроды (поставляются заказчику в готовом виде):

Для определения витаминов С, В₂ и кверцетина:

-    индикаторный электрод - стеклоуглеродный с рабочей поверхностью 25 -30 мм²;

-    электрод сравнения - хлоридсеребряный в насыщенном растворе хлорида калия

(нас.х.с.) [3] с сопротивлением не более 3,0 кОм.

-    вспомогательный электрод - хлоридсеребряный в насыщенном растворе хлорида

калия (нас.х.с.) [3] с сопротивлением не более 3,0 кОм.

Для определения витаминов В-,:

-    индикаторный электрод - ртутно-пленочный электрод на серебряной подложке с

толщиной пленки ртути 10-20 мкм и рабочей поверхностью 0,03 - 0,20 см²;

-    электрод сравнения - хлоридсеребряный в насыщенном растворе хлорида калия

(нас.х.с.) [3] с сопротивлением не более 3,0 кОм.

-    вспомогательный электрод - хлоридсеребряный в насыщенном растворе хлорида

калия (нас.х.с.) [3] с сопротивлением не более 3,0 кОм Для определения витамина Е:

-    индикаторный электрод - стеклоуглеродный с рабочей поверхностью 25 -30 мм²;

-    электрод сравнения - ртутный электрод;

-    вспомогательный электрод - стеклоуглеродный с рабочей поверхностью 25 -

30 мм².

7.1.3    Электролитическая ячейка, в состав которой входят:

-    сменные стаканчики из кварцевого стекла вместимостью 20 - 25 см³;

-    стеклянная или тефлоновая трубка с оттянутым концом для подвода инертного газа для удаления кислорода из раствора и его перемешивания.

7.1.4    Редуктор по ГОСТ 5381 с манометром (250 ± 1) атм по ГОСТ 8625.

7.1.5    Весы лабораторные аналитические общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности по ГОСТ 24104.

7.1.6    Дозаторы пипеточные емкостью 0,01 - 1,00 см³ (10 - 1000 мкл) типа П1 или другого типа.

7.1.7    Муфельная печь типа ПМ - 8 или МР - 64 - 02 15 по ГОСТ 9736;

или электропечь сопротивления камерная лабораторная, обеспечивающая поддержание заданного температурного режима от 150 °С до 600 °С с погрешностью + 25 °С;

или комплекс пробоподготовки “Темос-Экспресс” с диапазоном рабочих температур от 50 °С до 650 °С с погрешностью измерений +15 °С (изготовитель ООО “ИТМ”, г.Томск).

7.1.8    Аппарат для дистилляции воды АСД-4 по ГОСТ 15150.

7.1.9    Шланги резиновые для подвода газа к ячейке (при использовании инертного

газа).

7.1.10    Линейка чертежная мерительная по ГОСТ 17435.

7.1.11    Темный бокс или светозащитная бумага.

7.1.12    Щипцы тигельные [4].

> 7.2 Посуда

7.2.1    Пипетки мерные лабораторные стеклянные 2-го класса точности вместимостью 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 см³ по ГОСТ 29227.

7.2.2    Посуда мерная лабораторная стеклянная 2-го класса точности по ГОСТ 1770: колбы вместимостью, 25,0; 50,0; 100,0 см³, цилиндры вместимостью 25,0 см³.

7.2.3    Палочки стеклянные по ГОСТ 21400.

7.2.4    Воронки лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336.

7.2.5    Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 29225.

7.2.6 Аппарат Сокслета [5], состоящий из экстрактора, водяного холодильника, водяной

бани.

>    7.3 Реактивы и материалы

7.3.1    Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

7.3.2    Хлорид калия [3].

7.3.3    Кислота аскорбиновая (порошок) по ГОСТ 6245 (ИСО 6557/1-86 и ИСО 6557/2-84) или кислота аскорбиновая в ампулах жидкая Гос.фармакопея -10. ст.Ыб

7.3.4    Фармакопейный препарат: сухой порошок кверцетина с содержанием основного компонента не менее 99,5 %.

7.3.5    Фармакопейный препарат: сухой порошок витамина В(тиамин хлорид (бромид) с содержанием основного компонента не менее 99,5 %.

7.3.6    Фармакопейный препарат: сухой порошок витамина В₂ (рибофлавин) с содержанием основного компонента не менее 99,5 %.

7.3.7    ГСО а-токоферола ацетата ( ФС 42-1522-88 ).

7.3.8    Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 14261 ос.ч. или по ГОСТ 3118 х.ч.

7.3.9    Натрия гидроксид [6].

7.3.10    Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172.

7.3.11    Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

7.3.12    Хлороформ по ГОСТ 20015.

7.3.13    Ацетонитрил [7].

7.3.14    Натрий хлорнокислый [8].

7.3.15    Азот газообразный по ГОСТ 9293 с массовой долей кислорода не более 0,03 %.

7.3.16    Фильтры беззольные любой марки по ГОСТ 12026.

7.3.17    Бумага масштабно-координатная.

Допускается использовать другое оборудование и приборы, позволяющие воспроизводить метрологические характеристики, указанные в данной методике.

ОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ

При подготовки к выполнению измерений проводят следующие работы:

>    8.1 Подготовка приборов к работе

Подготовку и проверку полярографа, самописца и цифрового вольтметра проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и техническому описанию соответствующего прибора.

8.1.1 Устанавливают режим работы приборов (на примере серийных поляро-графов):

Параметры	Определяемый компонент
	витамин С	витамин Bi	витамин Вг	кверцетин	витамин Е
- тип развертки потенциала	нако питель ный	дифферен циально- импульсный	нако пительный	постоянно токовый	постоянно токовый
- электроды: рабочий сравнения	СУЭ нас.х.с.э	РПЭ нас.х.с.э.	СУЭ нас.х.с.э	СУЭ нас.х.с.э	СУЭ РЭ*
- фоновой электролит	КС/, подкисленный HCI	Na2HPOi 0,1 моль/дм3	на 0,01 моль/дм3	на 0,1 моль/дм3	NaCI04 0,1 моль/дм3 в ацетонитриле

Параметры Определяемый компонент витамин С витамин Bi витамин Вг кверцетин витамин Е - потенциал накопления, В - 0,30 -0,80 -0,50 -0,10 +1,0 - диапазон развертки пот-лов (от начала регистрации ВА кривой до конечного напряжения развертки), В От - 0,10 до +1,00 От -1,00 до-1,60 От - 0,50 до 0,10 От-0,10 до +1,00 От +1,0 до +2,0 - скорость линейного изменения потенциала, мВ/с 15 10 15 25 30 - чувствительность прибора при регистрации вольтамперо-граммы, А/мм 4-Ю"9...5-Ю"10А/мм (в зависимости от содержания компонента в анализируемой пробе); - время электролиза, с 30 20 - потенциалы пиков, В от +0,45 до +0,98 в зависимости от pH раствора от -1,25 до -1,30 от -0,20 до -0,15 от +0,45 до +0,55 от +1,3 до +1,8

* Ртутный электрод для определения витамина Е

>    8.2 Проверка и подготовка лабораторной посуды

8.2.1    Лабораторную стеклянную посуду, сменные наконечники дозаторов, пипетки протирают фильтром с питьевой содой, промывают многократно дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

8.2.2    Проверку стаканчиков для анализа на чистоту проводят путем регистрации вольтамперограмм раствора фонового электролита по 9.1. Для этого их предварительно многократного ополаскивают дистиллированной водой (при анализе витамина Е - хлороформом) и раствором фонового электролита.

Оптимальными по чистоте являются реактивы и посуда, когда наблюдается практическое отсутствие аналитических сигналов органического соединения в растворе фонового электролита (пик менее 2 мм при чувствительности прибора 1-10"⁹ А/мм).

>    8.3 Приготовление и проверка работы индикаторного электрода и электрода сравнения

8.3.1    Подготовка индикаторного стеклоуглеродного электрода (СУЭ)

В работе используют игольчатый электрод. Игольчатый индикаторный электрод изготавливают из стекловидного графита, вклеенного в полиэтиленовую трубку. Индикаторный стеклоуглеродный электрод представляет собой стеклоуглеродный стержень диаметром 2 мм и длиной 10-15 мм, запрессованный в полиэтиленовый держатель (поставляется потребителю в готовом виде).

Перед работой боковую поверхность и торец электрода шлифуют на фильтре; выдерживают 2 - 5 мин в этиловом спирте (для удаления поверхностно-активных веществ, а также для очистки от адсорбированных частиц).

8.3.2    Подготовка индикаторного ртутно-пленочного электрода

Индикаторный ртутно-пленочный электрод представляет собой полиэтиленовый стержень с запрессованной серебряной проволокой диаметром 0,8 - 1,0 мм длиной 5-7 мм, площадь поверхности составляет около 0,16-0,20 см². Для подготовки электрода к работе проводят амальгамирование, то есть нанесение на поверхность серебра пленки ртути толщиной 10-20 мкм. Покрытие ртутью производят путем опускания рабочей части электрода (серебряной проволоки) в металлическую ртуть на 2 - 3 с, затем ртуть растирают фильтровальной бумагой для равномерного распределения по поверхности серебра. В том случае, если на конце серебряной проволоки "свисает" избыточное количество ртути в виде капли, ее удаляют мокрой фильтровальной бумагой или стряхиванием в бюкс со ртутью, покрытой водой. Электрод промывают бидистиллированной водой.

Процедуру амальгамирования рабочей поверхности электрода повторяют при появлении не амальгамированных участков на поверхности электрода. При образовании серого налета на поверхности, электрод протирают фильтровальной бумагой.

После проведения анализа электроды обмывают бидистиллированной водой и хранят в стаканчике с бидистиллированной водой.

8.3.3    Для определения массовой концентрации витамина Е в качестве электрода сравнения используют ртутный электрод. Внутреннюю пористую часть патрона электрода (предоставляется заказчику в готовом виде) заполняют перхлоратом натрия в ацетонитриле. Далее заполняют металлической ртутью (около 0,2 см³) и снова приливают раствор перхлората натрия в ацетонитриле. Электрод сравнения выдерживают не менее 2 ч в ацетонитриле.

8.3.4    Подготовка к работе электрода сравнения

В качестве электрода сравнения используют насыщенный хлоридсеребряный электрод.

Электрод сравнения заполняют насыщенным раствором хлорида калия. При первом заполнении электрод выдерживают не менее 48 ч.

8.3.5    Проверку работы индикаторных электродов и электродов сравнения проводят в соответствии с 9.1 настоящей методики.

>    8.4 Приготовление растворов

8.4.1 Основной раствор (ОР) витамина С, содержащий 1000 мг/дм³ аскорбиновой кислоты

а)    Приготовление из ампул, выпускаемых медицинской промышленностью (5% раствора 1,0 см³)

В мерную колбу вместимостью 25,0 см³ вводят 0,5 см³ раствора аскорбиновой кислоты из ампулы и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

б)    Приготовление из сухого порошка аскорбиновой кислоты

На аналитических весах берут навеску (0,025+ 0,001) г аскорбиновой кислоты (витамина С) и переносят в мерную колбу вместимостью 25,0 см³ и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

Стандартные растворы, приготовленные из ампул и сухого порошка витамина С, идентичны.

Основной раствор готовят не ранее, чем за 2 ч до проведения измерений. Хранить долго не рекомендуется, т.к. аскорбиновая кислота неустойчива и с течением времени разлагается. Поэтому стандартный раствор готовят в малых объемах для работы с ним в течение одних суток.

Основной раствор содержащий 1000 мг/дм³ витамина С является одновременно аттестованной смесью (АС) этого компонента.

8.4.2 Основной раствор (ОР) витамина B_f, содержащий 1000 мг/дм³ витамина Bi

На аналитических весах берут навеску (0,050+ 0,001) г витамина В(тиамина хлорид или тиамина бромида), переносят в мерную колбу вместимостью 50,0 см³, добавляют

15

около 10-15 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0,10 моль/дм³, перемешивают до полного растворения порошка тиамина хлорида или тиамина бромида и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

Основной раствор, содержащий 1000 мг/дм³ витамина В_ь является одновременно АС этого компонента.

8.4.3    Основной раствор (ОР) витамина В₂, содержащий 100 мг/дм³ витамина В₂

На аналитических весах берут навеску (0,0100 + 0,0002) г витамина В₂ (рибофлавина), переносят в мерную колбу вместимостью 100,0 см³, добавляют 10,0 см³ раствора гидроксида натрия концентрации 0,10 моль/дм³, перемешивают до полного растворения порошка рибофлавина и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

Основной раствор, содержащий 100 мг/дм³ витамина В₂, является одновременно АС этого компонента.

8.4.4    Основной раствор (ОР) кверцетина, содержащий 200 мг/дм³ кверцетина

На аналитических весах берут навеску (0,010 + 0,001) г кверцетина, переносят в

мерную колбу вместимостью 50,0 см³, приливают приблизительно 30,0 см³ этилового спирта. После полного растворения кверцетина объем колбы доводят до метки этиловым спиртом.

Основной раствор, содержащий 200 мг/дм³ кверцетина, является одновременно АС этого компонента.

8.4.5    Основной раствор (ОР) витамина Е, содержащий 1000 мг/дм³ а-токоферола ацетата

На аналитических весах берут навеску (0,025+ 0,001) г а-токоферола ацетата (витамина Е), переносят в мерную колбу вместимостью 25,0 см³, приливают 10,0 см³ хлороформа и доводят объем до метки ацетонитрилом.

8.4.6    Раствор фонового электролита для витамина С - раствор хлорида калия концентрации 0,1 моль/дм³, подкисленный раствором соляной кислоты концентраций 0,1 моль/дм³ до pH 3 - 4

На аналитических весах взвешивают навеску (7,50+ 0,01) г хлорида калия, переносят в мерную колбу вместимостью 1,0 дм³, растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, приливают 20,0 см³ соляной кислоты концентраций 0,1 моль/дм³ и доводят бидистиллированной водой до метки.

8.4.7    Раствор соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100,0 см³ примерно на половину заполненную бидистиллированной водой вносят 0,80 см³ концентрированной соляной кислоты, тщательно перемешивают и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

8.4.8    Фоновый электролит для витамина В, - раствор натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного концентрации 0,10 моль/дм³

На аналитических весах взвешивают навеску (35,8 + 0,1) г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, переносят в мерную колбу вместимостью 1,0 дм³, растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

8.4.9    Фоновый электролит для витамина В₂ - раствор соляной кислоты концентрации 0,01 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100,0 см³ примерно наполовину заполненную бидистиллированной водой вносят (0,080 - 0,10) см³ концентрированной соляной кислоты, перемешивают и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

8.4.10    Фоновый электролит для кверцетина - раствор соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм³ приготовленный по 8.4.7.

8.4.11    Фоновый электролит для витамина Е - раствор перхлората натрия концентрации 0,1 моль/дм³ в ацетонитриле

В мерную колбу вместимостью 50,0 см³ вносят (0,610 ± 0,010) г перхлората натрия, растворяют в небольшом количестве ацетонитрила и доводят объем до метки ацетонитрилом.

8.4.12    Раствор гидроксида натрия концентрации 0,10 моль/дм³

Навеску (0,40 + 0,01) г гидроксида натрия переносят в мерную колбу вместимостью

100.0    см³, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.

> 8.5 Подготовка проб

8.5.1    Подготовка проб БАД для определения массовой концентрации витамина С

В фарфоровую ступку помещают 5 таблеток БАД, растирают фарфоровым пестиком до однородной дисперсной смеси. Берут навеску растертой смеси БАД в количестве

1.000    г, взвешенной с точностью до 0,001 г и переносят в коническую колбу вместимостью 200 - 250 см³. Добавляют 85 см³ бидистиллированной воды и 15 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм³, 1 - 2 г кристаллического хлорида калия, растворяют, перемешивают, выдерживают 10-15 мин и отфильтровывают полученный раствор через двойной бумажный фильтр. Объем фильтрата измеряют мерным цилиндром и доводят объем раствора до 100,0 см³ бидистиллированной водой. Фильтрат является подготовленной пробой для вольтамперометрического измерения массовой концентрации витамина С.

Если проба БАД содержит кверцетин, то пробоподготовку проводят аналогично описанному выше. Однако вместо 15,0 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм³ и 85 см³ бидистиллированной воды вводят 100,0 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм³, не разбавляя её бидистиллированной водой.

8.5.2    Подготовка проб БАД для определения массовой концентрации витамина В₁

В фарфоровую ступку помещают 3 - 5 таблеток БАД, растирают фарфоровым пестиком до однородной дисперсной смеси. Навеску растертой смеси БАД в количестве

1.000    - 3,000 г, взвешенной с точностью до 0,001 г переносят в коническую колбу вместимостью 200 - 250 см³. Добавляют 25,0 см³ бидистиллированной воды и 25,0 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0,10 моль/дм³, перемешивают и оставляют на 30 мин, периодически встряхивая содержимое колбы. Отстоявшийся раствор отфильтровывают через бумажный фильтр. Объем фильтрата измеряют мерным цилиндром и доводят объем раствора до 50,0 см³ бидистиллированной водой. Фильтрат является подготовленной пробой для вольтамперометрического измерения массовой концентрации витамина

8.5.3 Подготовка проб БАД для определения массовой концентрации витамина В₂

В фарфоровую ступку помещают 3 - 5 таблеток БАД, растирают фарфоровым пестиком до однородной дисперсной смеси. Навеску растертой смеси БАД в количестве

1,000 - 3,000 г, взвешенной с точностью до 0,001 г, переносят в колбу вместимостью 200 -250 см³. Добавляют 75,0 см³ бидистиллированной воды и 5,0 см³ раствора гидроксиди натрия концентрации 0,1 моль/дм³ , перемешивают и оставляют на 2 ч, периодически встряхивая содержимое колбы. Отстоявшийся раствор отфильтровывают через бумажный фильтр. Объем фильтрата измеряют мерным цилиндром и доводят объем раствора до 50,0 см³ бидистиллированной водой. Фильтрат является подготовленной пробой для вольтамперометрического измерения массовой концентрации витамина В₂.

8.5.4 Подготовка проб БАД для определения массовой концентрации кверцетина

17

В фарфоровую ступку помещают 3 - 5 таблеток БАД, растирают фарфоровым пестиком до однородной дисперсной смеси. Навеску растертой смеси БАД в количестве 0,100 - 1,000 г, взвешенной с точностью до 0,001 г переносят в колбу вместимостью 200 - 250 см³. Добавляют 25,0 см³ этилового спирта, перемешивают и оставляют на 2 ч, периодически встряхивая содержимое колбы. Отстоявшийся раствор отфильтровывают через бумажный фильтр. Объем фильтрата измеряют мерным цилиндром и доводят объем раствора до 25,0 см³ этиловым спиртом. Фильтрат является подготовленной пробой для вольтамперометрического измерения массовой концентрации кверцетина.

8.5.5 Подготовка проб БАД для определения массовой концентрации витамина Е

В фарфоровую ступку помещают 3 - 5 таблеток БАД, растирают фарфоровым пестиком до однородной дисперсной смеси. Навеску растертой смеси БАД в количестве

1,000 - 2,000 г, взвешенной с точностью до 0,001 г, помещают в футляр из фильтровальной бумаги. Экстракцию а-токоферола ацетата ведут в аппарате Сокслета. В верхнюю часть экстрактора аппарата Сокслета помещают навеску пробы в футляре, в нижнюю наливают 20 см³ хлороформа. Экстракцию проводят в течение 30 мин. Хлороформенный экстракт охлаждают, объем экстракта измеряют мерным цилиндром. Для вольтамперометрического определения берут аликвоту экстракта.

8.5.6 Обобщение этапов пробоподготовки при анализе проб БАД на содержание витаминов С, В_ь В₂, Е и кверцетина представлено на рисунке 2.

Рисунок 2. Схема пробоподготовки

8.5.7 При анализе проб биологически активных добавок «холостую» пробу делать не обязательно, так как витамины С, В_ь В₂, Е и кверцетин как загрязнение ни в реактивах, ни в воде не обнаружены. Посуда отмывается от витаминов С, В_ь В₂, Е и кверцетина очень легко по 8.2.

1П0ЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ

Выполнение измерений с использованием аналитического вольтамперометриче-ского комплекса СТА проводят по приложению Б, В , Г, Д и Е .

При проведении анализов проб БАД для определения массовых концентраций витаминов С, В1, В2, кверцетина и витамина Е методом ВА выполняют следующие операции (на примере серийного полярографа):

Полярограф предварительно должен быть подготовлен по 8.1.1.

> 9.1 Проверка стаканчиков, фонового раствора и электрода на чистоту

9.1.1    В подготовленный чистый кварцевый стаканчик (по 8.2) вместимостью 20 - 25 см³ с помощью пипетки вносят 10,0 см³ раствора фонового электролита:

-    раствора хлорида калия концентрации 0,1 моль/дм³ подкисленного раство

ром соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм³ до pH 3 - 4 для витамина С;

-    раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного концентрации

0,1 моль/дм³ для витамина В*;

-    раствора соляной кислоты концентрации 0,01 моль/дм³ для витамина В₂,

-    раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм³ для кверцетина,

-    ацетонитрила с добавлением 0,3 см³ раствора перхлората натрия в ацето

нитриле концентрации 0,1 моль/дм³ для витамина Е.

Стаканчик с раствором фонового электролита помещают в электролитическую ячейку или датчик.

9.1.2    Опускают в раствор индикаторный электрод, вспомогательный электрод и электрод сравнения.

Подключают к прибору электроды, устанавливают потенциал:

-    минус 0,30 В (для витамина С),

-    минус 0,80 В (для витамина В.,),

-    минус 0,50 В (для витамина В₂),

-    плюс 1,0 В (для витамина Е),

-    минус 0,10 В (для кверцетина).

9.1.3    Устанавливают чувствительность прибора 4-10"⁹...5-Ю"¹⁰ А/мм. Включают газ и в течение 180 с удаляют из раствора кислород пропусканием азота.

9.1.4    Проводят процесс электронакопления при потенциале:

-    минус 0,30 В (для витамина С),

-    минус 0,80 В (для витамина В.,), минус 0,50 В (для витамина В₂)

-    плюс 1,0 В (для витамина Е),

-    минус 0,10 В (для кверцетина), в течение 30 с при перемешивании раствора.

9.1.5    По окончании электролиза отключают газ и через 10 с начинают регистрацию вольтамперограммы в диапазоне потенциалов

-    от плюс 0,10 до плюс 1,50 В (для витамина С); от минус 1,00 до минус 1,60 В (для витамина ВО;

-    от минус 0,50 до плюс 0,10 В (для витамина В₂);

-    от плюс 1,00 до плюс 2,00 В (для витамина Е);

-    от плюс 0,10 до плюс 1,00 В (для кверцетина).

Потенциал анодного пика витамина С находится в диапазоне от плюс 0,45 В до плюс 1,00 В (в зависимости от содержания витамина С и pH раствора подготовленной пробы).

Потенциал катодного пика витамина B_f находится в диапазоне от минус 1,25 до минус 1,30 В (в зависимости от содержания витамина В1).

Потенциал анодного пика витамина В₂ находится в диапазоне от минус 0,20 до минус 0,15 В (в зависимости от содержания витамина В2 и pH раствора подготовленной про-

19

Потенциал анодного пика витамина Е находится в диапазоне от плюс 1,30 до плюс 1,80 В (в зависимости от содержания витамина Е).

Потенциал анодного пика кверцетина находится в диапазоне от плюс 0,45 В до плюс 0,55 В (в зависимости от содержания кверцетина).

9.1.6    После регистрации вольтамперограммы для витаминов С, В₂, Е и кверцетина стекпоуглеродный электрод вынимают из электрохимической ячейки, ополаскивают дистиллированной водой, опускают на 2 - 3 с в этиловый спирт (в стаканчике), протирают рабочую поверхность электрода фильтрованной бумагой (при анализе витамина Е рабочую поверхность стеклоуглеродного электрода протирают только фильтровальной бумагой) и снова подключают индикаторный электрод к прибору.

9.1.7    Повторяют операции по 9.1.4 - 9.1.6 три раза.

9.1.8    При наличии на вольтамперограмме сигнала определяемого компонента с высотой пика менее 2 мм стаканчик, фоновый раствор и электроды считают готовыми к проведению измерений. В противном случае проводят очистку электродов или стаканчика и повторяют операции по 9.1.1 - 9.1.7.

9.1.9    Отключают электроды от прибора, вынимают стаканчике раствором из ячейки или датчика и выливают содержимое стаканчика.

Примечание: При анализе проб на содержание витамина Е содержимое стаканчика выливают в склянку для слива органических веществ.

> 9.2 ВА измерения раствора подготовленной пробы БАД

9.2.1    В кварцевый стаканчик, подготовленный к проведению ВА измерений по 9.1, помещают:

для витамина С - аликвоту полученного фильтрата анализируемой пробы объемом (0,10 - 0,02) см¹ (подготовленного к измерению по 8.5 - для витамина С), доводят объем пробы до 10,0 см¹ раствором фонового электролита (хлорида калия концентрации 0,1 моль/дм¹ подкисленного раствором соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм¹ до pH 3 - 4); для витамина B_f - аликвоту полученного фильтрата анализируемой пробы объемом (1,00 - 3,00) см¹ (подготовленного к измерению по 8.5 - для витамина ВД доводят объем пробы до 10,0 см¹ раствором фонового электролита (раствор натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного концентрации 0,1 моль/дм¹);

для витамина В₂ - аликвоту полученного фильтрата анализируемой пробы объемом (0,10 - 0,02) см¹ (подготовленного к измерению по 8.5 - для витамина В₂), доводят объем пробы до 10,0 см¹ раствором фонового электролита (раствор соляной кислоты концентрации 0,01 моль/дм¹); для витамина Е - аликвоту полученного экстракта анализируемой пробы объемом (0,05 - 3,00) см¹ (подготовленного к измерению по 8.5 - для витамина Е), доводят объем пробы до 10,0 см¹ раствором фонового электролита (ацетонитрилом с добавлением 0,3 см¹ раствора перхлората натрия в ацетонитриле концентрации 0,1 моль/дм¹); для кверцетина - аликвоту полученного фильтрата анализируемой пробы объемом (0,10 - 0,02) см¹ (подготовленного к измерению по 8.5 - для кверцетина), доводят объем пробы до 10,0 см¹ раствором фонового электролита (раствор соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм¹).

9.2.2    Помещают стаканчик с анализируемым раствором в электролитическую ячейку или датчик.

9.2.3    Повторяют последовательно операции по 9.1.2 - 9.1.7.

9.2.4    Если высота анодных пиков витаминов С, В₂, Е и кверцетина или катодного пика витамина В_: превышает 200 мм, то уменьшают чувствительность прибора.

Если высота анодного пика витаминов С, В₂, Е и кверцетина или катодного пика витамина В₁ будет меньше 5 мм, то увеличивают чувствительность прибора.

ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ВНЕДРЕНЧЕСКАЯ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ ФИРМА “ЮМХ” АККРЕДИТОВАННАЯ МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ СЛУЖБА ТПУ

(аттестат об аккредитации № РОСС RU 01,00143-03 от 24.12.01)

СВИДЕТЕЛЬСТВО ОБ АТТЕСТАЦИИ МВИ № 08-47/141

(взамен №08-47/115)

Методика выполнения измерений массовых концентраций витаминов С, Bi, Bt, Е и кверцетина методом вольтамперометрии, разработанная в Томском политехническом университете и ООО «ВНП Ф «ЮМХ» и регламентированная в МУ 08-47/141 (по реестру аккредитованной метрологической службы Томского политехнического университета)

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДОБАВКИ. ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВИТАМИНОВ С, В_ь В* Е и КВЕРЦЕТИНА

аттестована в соответствии с ГОСТ Р 8.563 (ГОСТ 8.010).

Аттестация осуществлена по результатам теоретического и экспериментального исследования МВИ.

В результате аттестации МВИ установлено, что данная МВИ соответствует предъявляемым к ней метрологическим требованиям и обладает следующими основными метрологическими характеристика ми: ¹

1 Диапазоны измерений, относительные значения показателей точности, повторяемости и воспроизводимости методики при доверительной вероятности Р=0,95

Компонент Диапазон определяемых концентраций Показатель повторяемости (среднеквадратическое отклонение повторяемости), Показатель воспроизводимости (среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), Показатель точности (границы, в которых находится погрешность методики), 8.% витамин С 10 000 - 200 000 мг/кг Или 10 - 200 г/кг Или 1,0 - 20,0 % масс витамин Bi 50-10 000 мг/кг Или 0,05-10,0 г/кг Или 0,005 - 1,0 % масс витамин в| 100-3 000 мг/кг Или 0,1 - 3,0 г/кг Или 0,01 - 0,3 % масс. 8 12 25 витамин Е 2 000 - 30 000 мг/кг Или 2-30 г/кг Или 0.2 - 3,0 % масс кверцетин 100-150 000 мг/кг Или 0,1 до 150 г/кг Или 0.01 до 15 % масс.

9.2.5    Операции по 9.1.4- 9.1.7 повторяют три раза.

9.2.6    Измеряют линейкой высоты пиков определяемого компонента.

9.2.7    В стаканчик с анализируемым раствором с помощью пипетки или дозатора вносят добавку аттестованной смеси соответствующего компонента (витамина С, или В_ь или В₂, или Е, или кверцетина) в таком объеме, чтобы высота пика на вольтамперной кривой увеличилась примерно в два раза по сравнению с первоначальной.

Добавку вносят в малом объеме, чтобы предотвратить изменение концентрации фонового раствора. Рекомендуемые добавки аттестованной смеси известной концентрации приведены в таблицах 2а, 26, 2в, 2г и 2д.

Для возможности представления значений содержания компонента в пробах биологически активных добавок диапазоны определяемых концентраций в таблице 2а приведены в мг/кг, г/кг и в % масс., в остальных таблицах - только в мг/кг.

Таблица 2а- Рекомендуемые добавки аттестованных смесей витамина С при анализе проб биологически активных добавок

Диапазон определяемых концентраций компонента, мг/кг	10000 -50000	50000 -100000	100000 -200000
Диапазон определяемых концентраций компонента, г/кг	10-50	50 - 100	100- 200
Диапазон определяемых концентраций компонента, % масс.	1,0 - 5,0	5,0 - 10,0	10,0 - 20,0
Время электролиза, с	30	30	30
Навеска пробы, г	1,0	1,0	1,0
Объем аликвоты растворенной пробы для измерения, см3	1,0 - 0,05	0,05	0,02
Концентрация аттестованной смеси для добавок, мг/дм3	1000	1000	1000
Рекомендуемый объем добавок аттестованных смесей, см3	0,1 - 0,025	0,025 - 0,05	0,02 - 0,05

Таблица 26- Рекомендуемые добавки аттестованных смесей витамина В1 при анализе проб биологически активных добавок

Диапазон определяемых концентраций компонента, мг/кг 50 - 1000 1000 - 10 000 Время электролиза, с 30 30 Навеска пробы, г О 1 о со 1,0 - 0,50 Объем аликвоты растворенной пробы для измерения, см3 о 1 о со 0,10 - 0,20 Концентрация аттестованной смеси для добавок, мг/дм3 1000 1000 Рекомендуемый объем добавок аттестованных смесей, см3 0,025 - 0,020 0,02

Таблица 2в- Рекомендуемые добавки аттестованных смесей витамина В2 при анализе проб биологически активных добавок

Диапазон определяемых концентраций компонента, мг/кг 100 - 1000 1000 - 3 000 Время электролиза, с 30 30 Навеска пробы, г 3,0 1,0 Объем аликвоты растворенной пробы для измерения, см3 0,3 - 1,0 0,10 - 0,03 Концентрация аттестованной смеси для добавок, мг/дм3 100 100

6

1 НАЗНАЧЕНИЕ Vi ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий документ (МУ 08-47/141) устанавливает методику выполнения измерений массовых концентраций витаминов при анализе проб биологически-акгивных добавок (БАД):

❖    БАД - источников: углеводов и сахаров (кисели др.),

пищевых волокон, водорастворимых витаминов, макро- и микроэлементов;

❖    БАД на растительной основе (сухие, жидкие);

❖    БАД на основе переработки морепродуктов;

❖    БАД - бактериальные препараты;

❖    БАД, изготовленных в виде таблеток, капсул, гранул, растворов.

Методика выполнения измерений устанавливает порядок определения массовых концентраций витамина С (аскорбиновой кислоты), витамина В₁ (тиамина хлорида или бромида), витамина В₂ (рибофлавина), витамина Е (a-токоферола ацетата) и кверцетина методом вольтамперометрии (ВА).

Диапазоны содержаний определяемых компонентов представлены в таблице 1.

Если содержание компонентов в пробе выходит за верхнюю границу диапазона определяемых содержаний, допускается разбавление подготовленной к измерению пробы или уменьшение навески анализируемой пробы.

[АТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящей методике использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 ССБТ. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 2156-76 Реактивы. Натрий двууглекислый. Технические условия ГОСТ 2405-88 Манометры, вакуумметры, мановакуумметры, напоромеры, тягомеры и тягонапоромеры. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4172-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 5381-72 Редуктор. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7047-55 Витамины А, С, Д, В_ь В₂ и РР. Отбор проб, методы определения витаминов и испытания качества витаминных препаратов ГОСТ 8625-77 Манометр. Технические условия

ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия ГОСТ 9736-68 Муфельная печь типа ПМ-8 или МР-64-0215. Технические условия ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 15150-69 Машины, приборы и другие технические изделия. Исполнения для различных климатических районов. Категории, условия эксплуатации, хранения и транспортирования в части воздействия климатических факторов внешней среды ГОСТ 17435-72 Линейки чертежные. Технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия ГОСТ 20015-88 Реактивы. Хлороформ. Технические условия.

ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия.

7

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические условия ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28165-89 Приборы и аппараты лабораторные из стекла. Аквадистилляторы. Испарители. Установки ректификационные. Общие технические требования

ГОСТ 29225-91 (ИСО 1775-75) Посуда и оборудование фарфоровые лабораторные. Общие требования и методы испытаний.

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 8.563-96 Методики выполнения измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ЩНОСТЬ МЕТОДИКИ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ И ОСОБЕННО*    _ ГОТОВКИ

> 3.1 Витамин С

Сущность методики выполнения измерений состоит в переводе проб биологически активных добавок (БАД) в раствор путем растворения навесок соответствующих проб в воде или растворе соляной кислоты с последующим вольтампе-рометрическим определением массовой концентрации витамина С (аскорбиновой кислоты).

Пробо под готовка биологически активных добавок имеет свои особенности:

-    при анализе БАД в форме таблеток, содержащих флавоноиды (например, кверцетин в «Скин Лайн», производитель ООО «Арт Лайф» г.Томск), пробу растирают в фарфоровой ступке, затем измельченную навеску пробы переводят в раствор путем растворения в соляной кислоте концентрации 0,1 моль/дм³ при перемешивании с добавлением кристаллического хлорида калия. Полученный осадок отделяют фильтрованием раствора через двойной бумажный фильтр с последующим вольтамперометрическим определением (ВА) массовой концентрации витамина С в фильтрате;

-    при анализе БАД в форме таблеток, не содержащих флавоноиды (типа кверцетина), таблетки растирают в фарфоровой ступке, затем измельченную навеску пробы переводят в раствор путем растворения в соляной кислоте концентрации 0,01 моль/дм³ при перемешивании. Полученный осадок отделяют фильтрованием раствора через двойной бумажный фильтр с последующим ВА определением массовой концентрации витамина С в фильтрате.

Метод ВА измерения основан на способности витамина С окисляться на индикаторном стеклоуглеродном электроде при определенном потенциале, характерном для данного органического вещества (компонента).

Процесс электрохимического окисления витамина С проводят в растворе хлорида калия концентраций 0,1 моль/дм³, подкисленном соляной кислотой до значения pH примерно 3-4, либо в растворе соляной кислоты концентраций 0,1 моль/дм³ (если в БАД присутствует кверцетин), на индикаторном стеклоуглеродном электроде в области потенциалов от плюс 0,45 В до плюс 0,98 В относительно насыщенного хлорсеребряного электрода (нас.х.с.э.) в зависимости от pH среды. Регистрация аналитического сигнала на вольтамперограмме проводится при линейно-меняющемся (в сторону положительных значений) потенциале на полярографах или при накопительной развертке потенциала с использованием аналитического вольтамперометрического комплекса СТА в дифференциальном режиме записи вольтамперограмм. Массовая концентрация витамина С в пробе определяется методом добавок аттестованных смесей витамина С.

3.2 Витамин Bi

Сущность методики выполнения измерений состоит в переводе проб биологически активных добавок в раствор путем растворения навесок соответствующих проб в раство-

8

ре соляной кислоты с последующим ВА определением массовой концентрации витамина В-, (тиамина хлорида или бромида).

Метод ВА измерения основан на способности витамина В₁ восстанавливаться на индикаторном ртутно-пленочном электроде при определенном потенциале, характерном для данного органического вещества (компонента).

Процесс электрохимического восстановления витамина Впроводят в растворе натрия фосфорнокислого двузамещеиного концентрации 0,1 моль/дм³ на индикаторном ртутно-пленочном электроде при потенциале, равном (минус 1,25 - минус 1,30) В относительно нас.х.с.э. в зависимости от содержания витамина Вв пробе. Регистрация аналитического сигнала на вольтамперограмме проводится при линейно-меняющемся (в сторону отрицательных значений) потенциале на полярографах или при дифференциальноимпульсной развертке потенциала с использованием аналитического вольтамперомет-рического комплекса СТА в дифференциальном режиме записи вольтамперограмм. Массовая концентрация витамина Вв пробе определяется методом добавок аттестованных смесей витамина В_ь 3.3 Витамин В₂

Сущность методики выполнения измерений состоит в переводе проб биологически активных добавок в раствор путем растворения навесок соответствующих проб в воде с последующим ВА определением массовой концентрации витамина В₂ (рибофлавина).

Метод ВА измерения основан на способности витамина В₂ окисляться на индикаторном стеклоуглеродном электроде при определенном потенциале, характерном для данного органического вещества (компонента).

Процесс электрохимического окисления витамина В₂ проводят в растворе соляной кислоты концентрации 0,01 моль/дм³ на индикаторном стеклоуглеродном электроде при потенциале, равном (минус 0,20 - минус 0,15) В относительно нас.х.с.э. в зависимости от содержания витамина В₂ в пробе. Регистрация аналитического сигнала на вольтамперограмме проводится при линейно-меняющемся (в сторону положительных значений) потенциале на полярографах или при накопительной развертке потенциала с использованием аналитического вольтамперометрического комплекса СТА в дифференциальном режиме записи вольтамперограмм. Массовая концентрация витамина В₂ в пробе определяется методом добавок аттестованных смесей витамина В₂.

>    3.4 Витамин Е

Сущность методики выполнения измерений состоит в переводе витамина Е из проб биологически активных добавков в раствор путем экстракции его хлороформом с последующим вольтамперометрическим определением массовой концентрации витамина Е (а-токоферола ацетата).

Метод ВА измерений основан на способности а-токоферола ацетата окисляться на индикаторном стеклоуглеродном электроде при определенном потенциале, характерном для данного органического вещества (компонента).

Процесс электрохимического окисления а-токоферола ацетата проводят в ацетонитриле на фоне перхлората натрия на индикаторном стеклоуглеродном электроде.

Регистрация аналитического сигнала на вольтамперограмме проводится при линейно-меняющемся (в сторону положительных значений) потенциале на полярографах или при постоянно-токовой развертке потенциала с использованием аналитического вольтамперометрического комплекса СТА в дифференциальном режиме записи вольтамперограмм. Потенциал пика регистрируют в диапазоне от плюс 1,3 В до плюс 1,8 В относительно ртутного электрода сравнения. Массовая концентрация витамина Е в пробе определяется методом добавок аттестованных смесей а-токоферола ацетата.

>    3.5 Кверцетин

Сущность методики выполнения измерений состоит в переводе проб биологически активных добавок в раствор путем растворения навесок соответствующих проб в этиловом спирте с последующим вольтамперометрическим определением массовой концентрации кверцетина.

Метод ВА измерения основан на способности кверцетина окисляться на индикатор-

ном стеклоуглеродном электроде при определенном потенциале характерном для данного органического компонента.

Процесс электрохимического окисления кверцетина проводят в растворе соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм³ на индикаторном стеклоуглеродном электроде при потенциале, равном (плюс 0,45 - плюс 0,55) В относительно нас.х.с.э. в зависимости от содержания кверцетина в пробе. Регистрация аналитического сигнала на вольтамперо-грамме проводится при линейно-меняющемся (в сторону положительных значений) потенциале на полярографах или при постоянно-токовой развертке потенциала с использованием аналитического комплекса СТА в дифференциальном режиме записи вольтам-перограмм. Массовая концентрация кверцетина в пробе определяется методом добавок аттестованных смесей кверцетина.

Общая схема анализа проб методом вольтамперометрии представлена на рисунке

1.

Рисунок 1. Основные этапы анализа проб методом ВА

4 ПРИПИСАННЫЕ ХАРАКТЕРНО!!!    Ш1НОСТИ    ИЗМЕРЕНИЙ    И

ЕЕ СОСТАВЛЯЮЩИХ

4.1 Методика выполнения измерений массовых концентраций витаминов С, В₂, Е и кверцетина в пробах биологически активных добавок методом вольтамперометрии обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в таблице 1.

Таблица 1 - Диапазоны измерений, относительные значения показателей точности, повторяемости и воспроизводимости методики при доверительной вероятности Р=0,95

Компонент	Диапазон определяемых концентраций	Показатель повторяемости (среднеквадратическое отклонение повторяемости),	Показатель воспроизводимости (среднеквадратическое отклонение вос-производимо-сти)- %	Показатель точности (границы, в которых находится погрешность методики), 5, %
витамин С	10 000-200 000 мг/кг Или 10 - 200 г/кг Или 1,0 - 20,0 % масс	8	12	25
витамин	50 - 10 000 мг/кг

1