ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
НАЦИОНАЛЬНЫЙ
СТАНДАРТ
РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕОпределение содержания аминокислот (лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана) методом капиллярного электрофореза
Издание официальное
Москва
Стандартииформ
2005
Предисловие
Задачи, основные принципы и правила проведения работ по национальной стандартизации в Российской Федерации установлены ГОСТ Р 1.0-92 «Государственная система стандартизации Российской Федерации. Основные положения» и ГОСТ Р 1.2-92 «Государственная система стандартизации Российской Федерации. Порядок разработки государственных стандартов»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»), Научно-производственной фирмой аналитического приборостроения «Люмэкс» (НПФ АП «Люмэкс»), Федеральным государственным учреждением «Ленинградской межобластной ветеринарной лабораторией» (ФГУ ЛМВЛ)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 31 мая 2005 г. Ne 136-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе «Национальные стандарты», а текст этих изменений — в информационных указателях «Национальные стандарты». В случаях пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты»
© Стандартинформ. 2005
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
ГОСТ Р 52347-2005
Содержание
1 Область применения................................................................1
2 Нормативные ссылки................................................................1
3 Диапазоны измерений содержания аминокислот и метрологические характеристики метода----2
4 Требования техники безопасности.....................................................2
5 Отбор и подготовка проб к выпопнению измерений.......................................3
6 Определение содержания лизина, метионина, треонина и цистина..........................3
7 Определение содержания триптофана.................................................9
8 Контроль качества результатов измерений..............................................12
Приложение А (обязательное) Требования к обработке посуды и использованию оснастки,
необходимой для выполнения измерений...................................13
Приложение Б (рекомендуемое) Методика определения оптимальной рабочей длины волны
при анализе аминокислот................................................14
Библиография.......................................................................14
III
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ
Определение содержания аминокислот (лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана)
методом капиллярного электрофореза
Mixed fodders, raw mixed fodders Determination of amino acids (lysine, methionine, threonine, cystine and triptophane) content by method of capillary electrophoresis
Дата введения — 2006—07—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает экспрессный метод определения содержания аминокислот: лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана с помощью капиллярного электрофореза.
Метод основан на разделении в кварцевом капилляре под действием электрического поля ионных форм аминокислот и на их детектировании по собственному поглощению в ультрафиолетовой (УФ) области.
Идентификацию и количественное определение анализируемых аминокислот проводят с помощью установленного программного обеспечения.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4107-78 Бария гидроокись 8-водная. Технические условия
ГОСТ 4199-76 Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 10521-78 Кислота бензойная. Технические условия ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 13979.0-86 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия ГОСТ 17083-87 Электротепловентиляторы бытовые. Общие технические условия
Издание официальное
ГОСТ Р 52347-2005
ГОСТ 17681-82 Мука животного происхождения. Методы испытаний ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Метод отбора проб ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498—98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменек*ным (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Диапазоны измерений содержания аминокислот и метрологические характеристики метода
Диапазоны измерений содержания аминокислот (АК) и значения показателей повторяемости, воспроизводимости и точности приведены в табл. 1 (при вероятности Р = 0,95).
Таблица 1 |
Наименование определяемого компонента и диапазон измерений |
Показатель повторяемости (относительное среднеквадратичное отклонение повторяемости) ап % |
Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратичное отклонение воспроизводимости) о*. % |
Показатель точности (границы относительной погрешности) 18. % |
Лизин, г/дм3: от 0,25 до 1,0 в ключ |
20 |
25 |
50 |
се. 1.0 » 2.5 » |
15 |
20 |
40 |
» 2,5 » 10 » |
10 |
14 |
28 |
Метионин, г/дм3: от 0,3 до 1,0 включ |
20 |
25 |
50 |
се. 1.0 » 3.0 » |
15 |
20 |
40 |
Треонин, г/дм3: от 0.25 до 1.0 включ |
20 |
25 |
50 |
се 1,0 » 3.0 » |
15 |
18 |
36 |
Цистин, г/дм3: от 0.2 до 2.0 включ. |
20 |
25 |
50 |
Триптофан, г/дм3: от 0.1 до 2.0 включ |
11 |
15 |
30 |
|
4 Требования техники безопасности
4.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004, ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019.
ГОСТ Р 52347-2005
4.2 Помещение, в котором проводится выполнение измерений, должно быть снабжено приточновытяжной вентиляцией. Работу с реактивами необходимо проводить в вытяжном шкафу.
4.3 При работе с концентрированными кислотами и щелочами необходимо использовать резиновые перчатки.
5 Отбор и подготовка проб к выполнению измерений
5.1 Отбор проб —по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13979.0, ГОСТ 17681, ГОСТ 27262, ГОСТ 27668.
5.2 Подготовка пробы к анализу — по ГОСТ Р 51419 с использованием сита с отверстиями диаметром 1 мм.
6 Определение содержания лизина, метионина, треонина и цистина
6.1 Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы
Система капиллярного электрофореза с диапазоном изменения рабочего напряжения от 1 до 25 кВ, системой поддержания рабочей температуры капилляра, спектрофотометрическим детектором, предназначенным для регистрации оптического поглощения в области 190—200 нм, снабженная кварцевым капилляром (эффективная длина 65 см, внутренний диаметр 0,05 мм), типа «Капель-105» по (1).
Программно-аппаратный комплекс для сбора и обработки хроматографических данных типа «МультиХром для Windows», версия не ниже 1.5.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ± 0,001 г и ± 0,02 г.
Холодильник бытовой по ГОСТ 16317 любой марки.
pH-метр лабораторный (основная погрешность измерения не более ± 0,05 единиц pH).
Центрифуга лабораторная марки ШХ 2.779.040 со скоростью вращения не менее 6000 об/мин.
Шкаф сушильный лабораторный с терморегулятором, обеспечивающим поддержание температуры (110 ±2) *С.
Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.
Вентилятор по ГОСТ 17083.
Эксикатор по ГОСТ 25336.
Баня водяная с регулятором нагрева.
Бутыли из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой вместимостью 10. 20, 100, 500 и 1000 см3.
Колбы конические со шлифом Кн-1-25(1000)-14/23(19/26. 24/29) по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 1(2>-25(50. 100, 1000)-2 по ГОСТ 1770.
Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-2-1(5,10) по ГОСТ 29227.
Пипетки с одной отметкой 1 (2)-2-1(5, 10, 20) по ГОСТ 29169.
Микродозаторы переменного объема 5—50 мм3, 50—200 мм3, 200—1000 мм3 и пределом допускаемой погрешности измерения не более ± 5 % по (2].
Пробирки П2Т-25ТС по ГОСТ 25336.
Пробирки для микропроб однократного применения (типа Эппендорфа) вместимостью 1,5 см3 по [3].
Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8(19/9, 24/10, 34/12) по ГОСТ 25336.
Воронки В-25(36)-36(80) ХС по ГОСТ 25336.
Ампулы стеклянные с перетяжкой вместимостью 20 см3 из стекла по ГОСТ 21400.
Виалы стеклянные с герметично завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см3 для кислотного гидролиза.
Фильтры целлюлозно-ацетатные, размер пор 0.2 мкм, диаметр 25 мм.
Фильтры обеззоленные «синяя лента» по (4).
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор молярной концентрации с (NaOH) = 0,5 моль/дм3.
L-лизин моногидрохлорид, L-метионин, L-цистин, L-треонин, L-аргинин квалификации не ниже «ч.». «Флука», Швейцария. (Допускается использовать D-, а также смесь DL-аминокислот).
Кислота соляная по ГОСТ 3118, растворы молярных концентраций с (НС1)= 1 моль/дм3, с (НО) = = 0.1 моль/дм3, с (НО) = 6 моль/дм3.
fj-циклодекстрин, «Флука». Швейцария.
Натрий тетраборнокислый. стандарт-титр (5].
Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199, растворы молярных концентраций с (Na2B407 ЮН20) = 0,05 моль/дм3 и с (Na2B407 ЮН20) = 0,02 моль/дм3.
3
Кислота бензойная по ГОСТ 10521.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечания
1 Допускается применение средств измерений и оборудования с такими же или лучшими метрологическими и техническими характеристиками, а также (материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х. ч или ч. д. а.
3 Требования к обработке посуды и использованию оснастки, необходимой для выполнения измерений, в соответствии с приложением А.
6.2 Подготовка к проведению измерений
6.2.1 Приготовление вспомогательных растворов
6.2.1.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 1 моль/дм3
8.3 см3 концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Возможно использование стандарт-титра соляной кислоты. Срок хранения не ограничен.
6.2.1.2 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации с (NaOH) = 0.5 моль/дм3
Навеску гидроокиси натрия массой 2,000 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3,
растворяют в 50—60 см3 дистиллированной воды и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой. Раствор хранят в емкости из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой не более 2 мес.
Растворы по 6.2.1.1 и 6.2.1.2 предназначены только для промывок капилляра.
6.2.1.3 Приготовление раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации с (Na2B4Or10H2O) = 0,05 моль/дм3.
Раствор готовят из стандарт-титра по прилагаемой к нему инструкции и хранят в полиэтиленовой посуде, закрыв пробкой. Срок хранения раствора — 2 мес.
Примечание — При отсутствии стандарт-титра раствор готовят из 10-водного тетраборнокислого натрия. Для этого навеску препарата массой 19.071 г растворяют в мерной колбе вместимостью 1 дм3 в свежелрокипяченной и охлажденной без доступа воздуха дистиллированной воде pH раствора при 20 *С должен быть 9.22 ± 0,10.
6.2.1.4 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 6 моль/дм3
100 см3 концентрированной соляной кислоты смешивают с равным объемом дистиллированной
воды. Срок хранения не ограничен. Раствор используют для гидролиза проб.
6.2.1.5 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 0,1 моль/дм3
Раствор готовят из стандарт-титра по прилагаемой к нему инструкции. Срок хранения не ограничен.
6.2.2 Приготовление буферных растворов
6.2.2.1 Приготовление рабочего буферного раствора молярной концентрации тетраборнокислого натрия с (Na2B407 ЮН20) = 0,02 моль/дм3
20 см3 раствора тетраборнокислого натрия, приготовленного по 6.2.1.3, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают и используют:
- для кондиционирования капилляра;
- для хранения капилляра в нерабочее время;
- в качестве ведущего электролита (рабочего буферного раствора) для определения лизина, треонина и цистина;
- для приготовления ведущего электролита при определении метионина.
6.2.2.2 Приготовление рабочего буферного раствора для определения метионина
Навеску [i-циклодекстрина массой 0,114 г растворяют в пробирке в 10 см3 раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации с (Na2B4(>7 ЮН20) = 0,02 моль/дм3 (6.2.2.1). Полученную смесь закрывают пробкой и слегка нагревают на водяной бане при температуре от 50 *С до 70 *С до полного растворения -ц и кло декстрина. Хранят в сосуде из полиэтилена не более 14 сут при температуре не ниже 18 вС.
6.2.2.3 Подготовка буферных растворов для проведения измерений
Непосредственно перед началом измерений рабочие буферные растворы необходимо:
- профильтровать через ацетатно-целлюлозный фильтр, отбросив первые порции фильтрата (1—2 см3);
- дегазировать центрифугированием. Для этого в пробирки Эппендорфа помещают 0.5 см3 соответствующего раствора (6.2.2.1 или 6 2.2.2), плотно закрывают пробками и центрифугируют в течение 2 мин при скорости вращения 6000 об/мин.
4
ГОСТ Р 52347-2005
6.2.3 Приготовление градуировочных растворов аминокислот (АК)
6.2.3.1 Приготовление запасных растворов АК с массовыми концентрациями, г/дм3:
- лизина — 2,50:
- метионина и треонина — 1,00;
- цистина — 0,50;
- аргинина —1,00.
Для приготовления растворов лизина, метионина, треонина и аргинина необходимую навеску каждой АК (см. таблицу 2) помещают в отдельную мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой.
Таблица 2 |
Аминокислота |
нэвесха. г |
Концентрация, г/дм3 |
L-лизин моногидрохлорид* |
0,3124 |
2,50 |
L-метионин |
0,1000 |
1,00 |
L-треонин |
0,1000 |
1,00 |
L-цистин |
0,0500 |
0,50 |
L-аргинин |
0,1000 |
1,00 |
* В случае L-лизина дигидрохлорида величина навески 0,3747 г, L-лизина моногидрата величина навески 0,2808 г. |
|
Для приготовления раствора цистина навеску массой 0,050 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в 10 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = = 0,1 моль/дм3 (6.2.1.5), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.
Срок хранения запасных растворов АК в герметично закрытой посуде — 6 мес при температуре от
4 вС до 6 вС.
6.2.3.2 Приготовление запасного раствора бензойной кислоты массовой концентрации 1,00 г/дм3
Навеску бензойной кислоты массой 0,100 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в 20 см3 раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации 0,05 моль/дм3 (6.2.1.3), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения — 6 мес.
6.2.3.3 Приготовление рабочего раствора бензойной кислоты массовой концентрации 5 мг/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,5 см3 запасного раствора бензойной кислоты массовой концентрации 1,00 г/дм3 (6.2.3.2), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения — 1 мес.
6.2.3.4 Приготовление смешанного раствора аргинина и бензойной кислоты
В мерную колбу вместимостью 25 см3 помещают 5 см3 раствора аргинина (6.2.3.1) и 0,625 см3 запасного раствора бензойной кислоты (6.2.3.2), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Массовые концентрации компонентов составляют: аргинина — 200 мг/дм3, бензойной кислоты — 25 мг/дм3.
Срок хранения — 3 мес.
6.2.3.5 Приготовление исходной градуировочной смеси № 1
В полиэтиленовом сосуде вместимостью 20 см3 смешивают по 2 см3 запасных растворов лизина, метионина, треонина и цистина (6.2.3.1) и раствора аргинина с бензойной кислотой (6.2.3.4). Массовые концентрации компонентов в растворе, мг/дм3:
- лизина — 500;
- метионина — 200;
- треонина — 200;
- цистина —100;
- аргинина — 40;
- бензойной кислоты — 5.
Срок хранения смеси в герметично закрытой посуде — 1 мес в холодильнике.
6.2.3.6 Приготовление рабочей градуировочной смеси Ns 2
В полиэтиленовом сосуде вместимостью 10 см3 смешивают 1 см3 смеси № 1 (6.2.35). 0.8 см3 смешанного раствора (6.2.3.4) и 3,2 см3 дистиллированной воды. Массовые концентрации компонентов в смеси, мг/дм3:
5
- лизина —100;
- метионина — 40;
- треонина — 40;
- цистина —20;
- аргинина — 40;
- бензойной кислоты — 5.
Примечания
1 Аргинин введен в состав смеси из-за частичного наложения пиков лизина и аргинина, чтобы нивелировать влияние несимметричности пиков Бензойная кислота может служить внутренним стандартом и одновременно реперным пиком, облегчающим разметку электрофореграмм
2 Допускается применение рабочих градуировочных смесей с другими концентрациями АК, при этом массовая концентрация бензойной кислоты должна быть 5 мг/дм3.
6.2.4 Подготовка капилляра к работе
6.2.4.1 Подготовка нового капилляра к работе
Подготовку нового капилляра к работе проводят в соответствии с руководством по эксплуатации системы капиллярного электрофореза.
Примечание — Необходимо следить за уровнем жидкости в пробирке для слива Не допускается перетекание жидкости из пробирки в прибор!
6.2.4.2 Ежедневная подготовка капилляра к работе
Если капилляр оставляли на ночь заполненным дистиллированной водой, то перед работой его необходимо промыть раствором соляной кислоты 10 мин (6.2.1.1), дистиллированной водой 3 мин, раствором гидроокиси натрия не менее 10 мин (6.2.1.2), снова дистиллированной водой 3 мин и затем рабочим буферным раствором (6.2.2.1) в течение 10 мин в условиях, предусмотренных таблицей 3 для режима «Анализ». Затем следует проконтролировать состояние капилляра, проанализировав рабочую градуировочную смесь № 2 (6.2.3.6) с использованием существующей градуировки по 6.2.5.
При этом, в первую очередь, обращают внимание на воспроизводимость по времени выхода. Если время выхода определяемых компонентов отличается более чем на 5 %, капилляр промывают рабочим буферным раствором повторно и снова проверяют стабильность градуировочной характеристики. Если время выхода совпадает, то проверяют найденные концентрации компонентов по 6.2.5.
В том случае, если накануне в капилляре был оставлен раствор ведущего электролита, его не промывают соляной кислотой и гидроокисью натрия. Растворы ведущего электролита в рабочих и промывочных пробирках заменяют свежими порциями и промывают капилляр только раствором ведущего электролита, после чего контролируют стабильность градуировочной характеристики.
6.2.4.3 Хранение капилляра
Порядок хранения капилляра при перерывах в работе зависит от интенсивности использования прибора.
При ежедневной работе рекомендуется после окончания последнего анализа промыть капилляр раствором тетраборнокислого натрия молярной концентрации с (Na2B407 ЮН20) = 0,02 моль/дм3 (6.2.2.1) в течение 10—15 мин и оставить на ночь заполненным этим же раствором.
При перерывах в работе на 2—7 сут капилляр следует промыть дистиллированной водой и оставить заполненным ею же.
При перерывах на срок более недели капилляр необходимо после тщательной промывки дистиллированной водой высушить и оставить в сухом состоянии. В этом случае для восстановления работоспособности капилляра его нужно подготовить к работе как новый капилляр.
6.2.5 Градуировка системы
Г радуй ровку системы капиллярного электрофореза проводят способом одного эталона для каждого из двух условий проведения анализа в соответствии с процедурой, описанной в 6.3.2.
С этой целью не менее трех раз анализируют рабочую градуировочную смесь № 2 в условиях, рекомендованных при определении метионина, аналогичную процедуру осуществляют в условиях, рекомендованных при определении остальных трех аминокислот. Полученные электрофоре граммы обрабатываются в соответствии с процедурой градуировки, описанной в руководстве пользователя программы обработки данных («МультиХром» или аналогичной) и рассчитывают средние величины градуировочных коэффициентов и их среднеквадратичные отклонения (СКО). Градуировку следует считать успешной, если величины СКО не превышают 5 %. Выбраковку неудовлетворительных градуировочных точек проводят в том случае, если отклонение площади пика и одновременно времени выхода пика данного компонента превышает 5 % от среднеарифметических значений.
6
ГОСТ Р 52347-2005
6.2.6 Контроль стабильности градуировочной характеристики
Каждый раз перед началом измерений необходимо после подготовки капилляра проанализировать рабочую градуировочную смесь № 2. При этом в рабочем журнале фиксируют время выхода определяемых компонентов и их массовые концентрации, рассчитанные по существующей градуировочной характеристике. Градуировка признается стабильной, если отклонение найденных массовых концентраций от заданных значений не превышает 5 % для метионина и цистина и 10 % — для лизина и треонина. В противном случае анализируют рабочую градуировочную смесь N® 2 еще два раза. При повторных отклонениях, превышающих указанные нормативы, градуировку системы проводят заново, начиная с приготовления нового раствора рабочей градуировочной смеси Nfi 2.
6.3 Проведение измерений
6.3.1 Проведение гидролиза и получение испытуемого раствора
Навеску исследуемого продукта массой 0.1000 г помещают в стеклянную виалу или ампулу с перетяжкой, добавляют 10 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 6 моль/дм3 (6.2.1.4). При гидролизе в стеклянной ампуле ее запаивают в пламени газовой горелки в месте перетяжки. Виалу с плотно завинченной крышкой или запаянную ампулу помещают в эксикатор, который ставят в сушильный шкаф на 14—16 ч при температуре 110 *С (оставляют на ночь).
По окончании гидролиза виалу или ампулу вынимают из эксикатора и охлаждают до комнатной температуры. Содержимое слегка перемешивают и фильтруют в коническую колбу со шлифом вместимостью 25 см3, отбирают в стеклянную бюксу 1 см3 фильтрата и выпаривают досуха в потоке теплого воздуха вентилятора. Бюксу охлаждают при комнатной температуре, сухой остаток растворяют в 1 см3 дистиллированной воды (испытуемый раствор).
В зависимости от объекта исследования и предполагаемого содержания АК проводят разбавление испытуемого раствора дистиллированной водой. Рекомендуемые разбавления: для зерновых культур в два раза (соотношение объемов испытуемого раствора и воды 1:1), для продуктов растительного (жмых, шрот) и животного происхождения, а также комбикормов в пять раз (соотношение объемов испытуемого раствора и воды 1:4). Отбор испытуемого раствора и воды производят с помощью микродозаторов или градуированных пипеток.
Критерием оптимальности разбавления является то, что концентрация АК в разбавленном испытуемом растворе не должна превышать их значений в рабочей градуировочной смеси № 2.
0,5 см3 полученного раствора помещают в пробирку Эппендорфз, центрифугируют для дегазации при 6000 об/мин в течение 5 мин (рабочий испытуемый раствор) и используют для электрофоретического анализа.
Примечание — При возникновении затруднений в разметке пиков АК на элоктрофореграммо сухой остаток растворяют в 1 см3 раствора бензойной кислоты массовой концентрации 5 мг/дм3 Разбавление испытуемого раствора проводят раствором бензойной кислоты массовой концентрации 5 мг/дм3 (6 2.3.3).
6.3.2 Анализ рабочего испытуемого раствора
Анализ рабочего испытуемого раствора проводят дважды: для определения лизина, треонина и цистина — в среде буферного раствора тетра борнокислого натрия (6.2.2.1) при температуре 20 °С, а для определения метионина — в среде буферного раствора тетраборнокислого натрия с добавкой Р-циклодекстрина (6.2.2.2) при температуре 40 *С. При анализе серии проб рационально проанализировать их сначала при одном составе буфера, а затем, поменяв буфер и температуру, проанализировать те же растворы повторно. Рекомендуемые условия анализа приведены в таблице 3.
Таблица 3 — Условия проведения анализа методом капиллярного электрофореза |
Параметр |
Определение лизина, троомима и цистина |
Определение метионина |
Длина волны, нм |
190—200 нм (конкретное значение устанавливается для каждого прибора по методике, приведенной в приложении Б) |
Ввод пробы |
Пневматический (давление 30 мбар, время 15 с) |
Режим анализа |
Напряжение плюс 20 кВ, время 17 мин (при определении метионина время анализа можно сократить до 10 мин) |
Рабочий буферный раствор |
По 6.2.2.1 |
По 6 2.2.2 |
Температура, *С |
20 |
40 |
|