МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION (ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения остаточного содержания макролидов, линкозамидов и плевромутилинов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2017

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия. обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 августа 2017 г № 102-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны no МК (ИС0 3166) 004-97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Киргизия KG Кыргызстандарт Россия RU Росстандарт Украина UA Минэкономразвития Украины

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 сентября 2017 г. № 1160-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34136-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (wwwgost.ru)

© Стандартинформ. 2017

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Таблица 4 — Параметры воздействия на ионы в режиме ММР с регистрацией положительных ионов

А на пит Ион- предшественник. rmz Ион-продукт. rmz Время удержи вания. мин Энергия соударений. эВ Ускоряющее напряжение на выходе иэ ячейки стопкновений.В Спирамицин 422,2 100,9 174.1 7,04 22 16 25 28 Эритромицин 734.5 158 576.3 8,09 35 21 27 32 Кларитромицин 748.5 590,3 158 8.78 25 24 33 24 Тулатромицин 807.0 577,3 158 6,42 33 27 48 8 Тилмикозин 869.6 174,2 696.3 7.53 55 23 53 35 Тилвалозин 1042,6 229 174 9.58 35 25 33 28 Тилоэин 916.5 772,1 174 8,20 49 22 39 36 Линкомицин 407.2 359,2 126 6.05 28 28 35 14 Клиндамицин 425.2 377,1 126 7.41 25 26 35 12 Пирлимицим 411.2 112 363 7.21 31 18 21 16 Валнемулин 565.4 263 147 8,96 21 30 51 26 Тиамулин 494,3 192 118.9 8.71 33 54 57 26 Рокситромицин-Д7* 844.7 686,4 — 8,79 31 — 30 — Азитромицин-ДЗ* 752.7 594,5 — 7.09 39 — 27 — Клиндамицин-ДЗ* 428.4 380 129 7,40 26 26 35 15 Валнемулин-Д6* 571.6 269,2 153.2 8.96 23 30 51 26 ‘ Внутренний стандарт

Примечание — Приведенные выше параметры хроматографического разделения и масс-спектромет-рического детектирования могут отличаться в зависимости от используемого оборудования

8.1.4 Контроль чувствительности хромато-масс-спектрометрической системы осуществляют введением в инжектор хроматографа 20 мм³ матричного градуировочного раствора 6₈ (см. 6.3.5). Полученное соотношение сигнал/шум для каждого аналита должно быть не менее 10.

8.2 Построение градуировочной характеристики

Построение и расчет градуировочной характеристики проводят в каждой серии анализов с помощью программного обеспечения хромато-масс-спектрометрической системы.

8.2.1    Проводят измерения не менее четырех матричных градуировочных растворов, выбранных исходя из ожидаемой массовой концентрации аналитов в анализируемом образце и приготовленных по 6.3.5. в порядке возрастания их концентраций. Каждый градуировочный раствор измеряют два раза. Определяют значения времени удерживания ион-продуктов аналитов и их внутренних стандартов.

8.2.2    Вычисление площади пика проводят для каждого ион-продукта анализируемых аналитов и их внутренних стандартов. Количественное определение макролидов, линкозаминов. плевромутили-нов проводят по одному, наиболее интенсивному, ион-продукту. Для подтверждения наличия аналитов рассчитывают отношения площади пика двух ион-продуктов для каждого аналита в градуировочном растворе.

Соответствие аналитов и их внутренних стандартов указано в таблице 1.

8.2.3    Градуировочную характеристику строят в координатах «отношение площади пика определяемого соединения к площади пика внутреннего стандарта этого соединения» — «отношение концентраций аналита и внутреннего стандарта». При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида у = а + Ьх, при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0,98. Построение градуировочной характеристики проводят при каждой серии измерений заново.

8.2.4    Построение линейного градуировочного графика и расчет концентрации макролидов, линко-замидов. плевромутилинов в анализируемых пробах выполняется системой обработки данных в автоматическом режиме.

8.3 ВЭЖХ-МС/МС измерение

8.3.1 Для измерения содержания макролидов, линкозамидов. плевромутилинов проводят ВЭЖХ-МС/МС анализ в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации применяемого оборудования. Для каждого аналита проводят два параллельных измерения.

9

8.3.2    Анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы:

-    подвижную фазу А;

-    «чистую» пробу;

-    матричные градуировочные растворы (см. 6.3.5);

-    экстракты анализируемых проб, приготовленных по 7.2.

8.3.3    Определяют и регистрируют на хроматограмме время удерживания пиков двух ион-продуктов каждого аналита. соответствующее времени удерживания, найденному при измерении градуировочных растворов по 8.1.2.

9 Обработка результатов измерений

9.1    В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, проводят количественную обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения, получая значения массовой концентрации макролидов, линкозамидов. плевромутилинов в двух параллельных измерениях анализируемой пробы.

9.2    Содержание /-го аналита Х_г мкг/кг, вычисляют по формуле

где С,— массовая концентрация аналита в анализируемой пробе, найденная по градуировочному графику. нг/см³;

V,— объем, до которого разбавлена проба, од³; т,— масса анализируемой пробы, г.

9.3 За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений анализируемой пробы, если выполняется условие приемлемости по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).

10 Метрологические характеристики

Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение определения содержания макролидов, линкозамидов и плевромутилинов с относительной расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к = 2 и доверительной вероятности Р = 0.95. указанной в таблицах 5—7.

Таблица 5 — Показатели точности и прецизионности метода при определении содержания макролидов, линкозамидов, плевромутилинов в мясе, мясных продуктах и полуфабрикатах, рыбе, креветках

Аналит Диапазон измерений содержания, мкг/кг Значение относительной расширенной неопределенности и,, %, при коэффициенте охвата к = 2 Показатель повторяемости (относительное стандартное отклонение повторяемости) а,.% Предел повторяе мости г.% Показатель воспрои зводимости (относительное стандартное отклонение воспроизводимости) * Спирамицин От 2 ДО 160 ВКЛЮЧ 32 12 33 16 Се 160 до 320 включ 24 8 21 12 Эритромицин От 10 до 40 включ 34 12 33 15 Св 40 до 320 включ 19 6 17 9 Тилмикозин От 1 до 100 включ 30 8 23 14 Св 100 до 160 включ 18 5 13 9 Тилозин От 1 до 20 включ 33 12 34 16 Св 20 до 160 включ 18 4 10 8 Тилвалозин От 5 до 80 включ 32 12 34 16 Св 80 до 160 включ 16 4 12 8

ГОСТ 34136-2017

Окончание таблицы 5

Аиалит Диапазон измерений содержания, мкг/кг Значение относительной расширенной неопределенности и,, %. при коэффициенте охвата к = 2 Показатель повторяемости (относительное стандартное отклонение повторяемости) о,. % Предел повторяе мости Г% Показатель воспроизводимости (относительное стандартное отклонение воспроизводимости) oR. % Тулатромицин От 1 до 40 включ 43 16 44 22 Св 40 до 160 включ 22 6 15 10 Кларитромицин От 1 до 80 включ 37 14 38 19 Св 80 до 160 включ 22 7 19 11 Линкомицин От 1 до 160 включ 31 10 28 15 Клиидамицин От 1 до 20 включ 37 13 36 19 Св 20 до 160 включ 14 4 10 7 Пирлимицин От 1 до 80 включ 26 8 22 12 Св 80 до 160 включ 14 4 10 7 Валнемулин От 1 до 20 включ 67 26 71 34 Св 20 до 160 включ. 22 7 18 11 Тиамулин От 1 до 160 включ 28 10 28 14

Таблица б — Показатели точности и прецизионности метода при определении содержания макролидов, лин-козамидов, ллевромутилинов в субпродуктах

Аналит	Диапазон измерений содержания, мкг/кг	Значение относительной расширенной неопределенности иг %, при коэффициенте охвата к■ 2	Показатель повторяемости (относительное стандартное отклонение повторяемости) о,.%	Предел повторяе мости г.%	Показатель воспроизводимости (относительное стандартное отклонение воспроизводимости) a«.%
Спирамицин	От 20 до 3200 включ	34	11	30	17
Эритромицин	От 10 до 160 включ	48	12	33	24
	Св 160 до 320 включ	14	4	11	7
Тилмикозин	От 10 до 200 включ	48	18	49	24
	Св 200 до 1600 включ	28	9	25	14
Тилоэин	От 1 до 20 включ	48	11	31	24
	Св 20 до 160 включ	20	7	20	10
Тилвалозин	От 5 до 160 включ	52	19	52	26
Тулатромицин	От 20 до 400 включ	42	14	39	21
	Св 400 до 3200 включ	18	6	18	9
Кларитромицин	От 1 до 20 включ	72	12	34	32
	Св 20 до 160 включ	16	5	14	8
Линкомицин	От 15 до 2400 включ	43	15	40	21
Клиндамицин	От 15 до 300 включ	34	11	31	17
	Св 300 до 2400 включ	24	8	23	12
Пирлимицин	От 10 до 200 включ	85	14	40	38
	Св 200 до 1600 включ	23	8	22	10

Окончание таблицы 6

Анапит Диапазон измерений содержания, мкг/кг Значение относительной расширенной неопределенности и,, %, при коэффициенте охвата к = 2 Показатель повторяемости (относительное стандартное отклонение повторяемости) а,, % Предел повторяе мости г,% Показатель воспроизводимости (относительное стандартное отклонение воспроизводимости) Валнемулин От 5 до ЮОвключ 28 9 24 14 Св 100 до 800 включ 16 4 11 8 Тиамулин От 10 до 800 включ 58 11 29 26 Св 800 до 1600 вклкм 28 9 26 14

Таблица 7 — Показатели точности и прецизионности метода при определении содержания макролидов, лин-коэамидов, плевромутилинов в молоке, молочных продуктах, в том числе сыре

Значение от- Показатель Показатель вое- носи тельной повторяемости про изводи мости Диапазон измерений содержания, мкг/кг расширенной (относительное Предел (относительное Аналит неопределенности Ur %,при стандартное отклонение по- повторяемости г.% стандартное отклонение коэффициенте вторяемости) воспроизведи- охвата к = 2 «,.% МОСТИ) Од. % Спирамицин От 2 до 320 включ 21 6 18 10 Эритромицин От 10 до 40 включ 28 9 26 14 Св 40 до 320 включ 18 5 14 9 Тилмикозин От 1 до 20 включ 59 12 34 27 Се 20 до 160 включ 28 9 25 14 Тилозин От 5 до 20 включ 24 8 22 12 Св 20 до 160 включ 18 6 17 9 Тилвалозин От 1 до 160 включ 19 7 20 9 Тулатромицин От 1 до 40 включ 41 9 26 18 Св 40 до 160 включ 20 7 18 10 Кларитромицин От 1 до 80 включ 30 7 18 14 Св 80 до 160 включ 10 3 7 5 Линкомицин От 1.5 до 30 включ 33 8 23 15 Св 30 до 240 включ 16 5 14 8 Клиндамицин От 1 до 20 включ 27 9 26 14 Св 20 до 160 включ 12 4 12 6 Пирлимицин От 1 до 20 включ 22 7 20 10 Св 20 до 160 включ 17 5 13 8 Валнемулин От 20 до 160 включ 16 5 13 8 Тиамулин От 1 до 160 включ 24 6 15 11

11 Оформление результатов измерений

Содержание t-го аналита. мкг/кг, представляют в виде

Ху±0,01 U, Х_# при Р= 0,95,    (3)

гдеХ^ — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений содержания ьго аналита в анализируемой пробе, мкг/кг (см. 9.3);

ГОСТ 34136-2017

U, — значение относительной расширенной неопределенности содержания но аналита для соответствующего диапазона измерений. % (в соответствии с таблицами 5—7);

0.01 U_t X_t — значение расширенной неопределенности в абсолютных единицах, мкг/кг.

Числовое значение результата измерений должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение расширенной неопределенности, содержащее не более четырех значащих цифр и выраженное в микрограммах на килограмм (мкг/кг).

12 Контроль стабильности результатов измерений

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3) с использованием контрольных карт Шухарта.

13

ГОСТ 34136-2017

УДК 637.07:614.3:006.354    МКС    67.050

67.100

67.120.10

67.120.20

67.120.30

Ключевые слова: пищевые продукты, продовольственное сырье, макролиды, линкозамиды и плеврому-тилины, метод определения содержания с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

БЗ 9—2017/91

Редактор /7 6 Коретникова Технический редактор И Е Черепкова Корректор О В Лазарева Компьютерная верстка Е О Астаимна

Сдано в набор 21 09 2017. Подписано в печать 12 10 2017 Формат 60«84¹/_в. Гарнитура Ариал Уел. печ. л. 1.86 УЧ.-изд л. 1.68 Тираж 27 экз Зак 1749 Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Издано и отпечатано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ». 123001 Москва. Гранатный пер . 4 www.gostnfo.ni info@gostinfo ги

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ    СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения остаточного содержания макролидов, линкозамидов и плевромутилинов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим

детектированием

Food products, food raw materials Method for determination of the residual content of macrolides, lincosamides and pleuromutilms by high performance

liquid chromatography — mass spectrometry

Дата введения — 2018—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и продовольственное сырье: мясо (все виды животных), в том числе мясо птицы, субпродукты, мясные продукты, полуфабрикаты, рыбу, креветки, молоко, молочные продукты, в том числе сыр и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее — ВЭЖХ-МС/МС) для определения остаточного содержания макролидов, линкозамидов и плевромутилинов.

Диапазон измерений для макролидов в мясе, мясных продуктах и полуфабрикатах, рыбе, креветках. молоке, молочных продуктах, в том числе сыре — от 1 до 320 мкг/кг, в субпродуктах — от 1 до 3200 мкг/кг; для линкозамидов в мясе, мясных продуктах и полуфабрикатах, рыбе, креветках — от 1 до 160 мкг/кг. в молоке, молочных продуктах, в том числе сыре — от 1 до 240 мкг/кг в субпродуктах — от 10 до 2400 мкг/кг; для плевромутилинов — в мясе, мясных продуктах и полуфабрикатах, рыбе, креветках, молоке, молочных продуктах, в том числе сыре — от 1 до 160 мкг/кг, в субпродуктах — от 5 до 1600 мкг/кг.

Примечания

1    Макролиды спирамицин, эритромицин, кларитромицин, тулатромицин. тилмикозин. тилозин. тилвалозин

2    Линкозамиды линкомицин, клиндамицин, пирлимицин

3    Плевромутилины валнемулин, тиамулин.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты'

ГОСТ 12.2.085-2002 Сосуды, работающие под давлением. Клапаны предохранительные. Требования безопасности

ГОСТ OIML R 76-1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83. ИС0 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1 019—2009

Издание официальное

ГОСТ 2603-79 Реактивы Ацетон. Технические условия

ГОСТ 4288-76 Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса Правила приемки и методы испытаний

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике’

ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 7269-2015 Мясо Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести

ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435—73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия ГОСТ 9792-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 22300-76 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты ГОСТ 26809 2—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные обьекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 31467-2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку

3    Сущность метода

Метод основан на извлечении макролидов, линкозамидов и плевромутилинов из анализируемой пробы, их идентификации и количественном определении методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме мониторинга множественных реакций (ММР). Количественное определение проводят методом внутреннего стандарта.

4    Требования безопасности и условия выполнения измерений

4.1    Применяемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности по ГОСТ 12.1.007. при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.

4.2    Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3    Приготовление градуировочных растворов проводят в вытяжном шкафу.

4 4 При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила по электробезопасности по ГОСТ 12.1.019 и правила безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением по ГОСТ 12.2 085.

4.5 Применяемые при определении остаточных содержаний макролидов, линкозамидов. плевромутилинов средства измерений должны иметь свидетельства о поверке, вспомогательное оборудование—-свидетельства об аттестации, оформленные в соответствии с требованиями национального за- ^{1 2}

ГОСТ 34136-2017

конодательства в области обеспечения единства измерений, действующего на территории государства, принявшего стандарт.

4.6    К выполнению измерений методом ВЭЖХ-МС/МС допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации применяемого оборудования.

4.7    При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха..............................................................от 15 °С до 30 °С;

- относительная влажность воздуха................................................................от 20 % до 80 %.

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы

5.1 Для определения остаточного содержания макролидов, линкозамидов и плевромутилинов применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и посуду:

-    весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с максимальной нагрузкой не более 150 г и пределами допускаемой погрешности не более ± 0,001 г;

-    весы высокого (II) класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0,02 мг;

-    масс-спектрометр, оснащенный источником ионизации с электрораспылением, квадрупольны-ми анализаторами, с диапазоном измерений от 100 до 1100 атомных единиц массы (а. е. м ). массовым разрешением не менее 0.7 а. е. м.. с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0.1 а. е. м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);

-    систему высокоэффективной жидкостной хроматографии, оснащенную бинарным насосом со смесителем, термостатом хроматографической колонки, обеспечивающим температуру нагрева до (50 ± 1) °С;

• колонку хроматографическую, заполненную обращенно-фазным сорбентом С18 размером частиц не более 5,0 мкм, длиной 150 мм и внутренним диаметром 2.1 мм;

-    компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов измерений;

-    модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 60 X;

-    устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

-    картриджи для твердофазной экстракции вместимостью не менее 3 см³, заполненные обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц сорбента от 20 до 50 мкм;

-    баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм³;

-    встряхиватель (шейкер) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм. диапазоном скоростей от 150 до 2000 об/мин;

-    генератор азота, с объемной долей азота не менее 90 % и производительностью 200 дм³/мин;

-    измельчитель-гомогенизатор лабораторный;

-    камеру лабораторную морозильную с рабочим диапазоном температур от минус 15 X до минус 25 X;

-    систему получения деионизированной воды высокой чистоты с удельным сопротивлением 18 МОм см;

-    холодильник бытовой с рабочим диапазоном температур от 2 X до 8 X;

-    центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения не менее 4000 об/мин и диапазоном температур от 4 X до 20 X с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см³;

-    центрифугу лабораторную с центробежным ускорением не менее 15000 об/мин и с адаптерами для пробирок вместимостью 1.5 см³;

-    шкаф сушильный с максимальной температурой нагрева не менее 200 С и погрешностью поддержания заданной температуры ± 5 X;

-    пробы, не содержащие макролиды, линкозамиды и плевромутилины. подготовленные и проанализированные ранее в соответствии с требованиями разделов 7 и 8. в зависимости от типа исследуемой матрицы («чистые» пробы*);

-    фильтры нейлоновые мембранные с размером пор 0,2 мкм;

-    пробирки микроцентрифужные полипропиленовые вместимостью 1.5 см³;

-    виалы (флаконы) для автоматического устройства ввода проб, вместимостью 2 см³, с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками 9 мм;

-виалы (флаконы) полипропиленовые или пробирки полипропиленовые вместимостью 15 и 50 см³ с завинчивающимися крышками;

-    колбы 1—25(1000)—2 по ГОСТ 1770;

-    пипетки 2—2—1—2(5.10) по ГОСТ 29227;

-пипетки одноканальные переменной вместимости 5—25. 20—100. 200—1000 мм³ с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более ± 1 %;

-    пробирки П—2—10—14/23ХС по ГОСТ 1770;

-цилиндры 1—25(1000)—1 по ГОСТ 1770.

5.2    При определении содержания макролидов, линкозамидов и плевромутилинов применяют следующие реактивы:

-    азот газообразный марки 60 по ГОСТ 9293. ос. ч.;

-    ацетон по ГОСТ 2603;

-    ацетонитрил для ВЭЖХ с массовой долей основного вещества не менее 99.9 %;

-    воду деионизированную для ВЭЖХ, полученную с использованием системы производства уль-трачистой воды из дистиллированной воды по ГОСТ 6709;

-    кислоту муравьиную по ГОСТ 5848, ч. д. а.;

-    метанол по ГОСТ 6995. х. ч.;

-    эфир этиловый уксусной кислоты (этилацетат) по ГОСТ 22300, ч. д. а.

5.3    При определении содержания макролидов, линкозамидов и плевромутилинов в качестве образцов сравнения применяют соединения с массовой долей основного вещества не менее 85 %.

5.3.1    Для приготовления исходных растворов:

-    спирамицин;

-    эритромицин;

-    кларитромицин;

-    тулатромицин;

-тилмикозин;

-    тилозин;

-тилвалозин;

-    линкомицин;

-    клиндамицин;

-    лирлимицин;

-    валнемулин;

-    тиамулин.

5.3.2    Для приготовления исходных растворов внутренних стандартов:

-    рокситромицин-Д7;

-    азитромицин-ДЗ;

-    клиндамицин-ДЗ;

-    валнемулин-Дб.

5.4    Допускается применение других средств измерений и посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения. а также оборудования, реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

6 Подготовка к проведению измерений

6.1    Подготовка лабораторной посуды и реактивов

6.1.1    Мойку и сушку посуды проводят в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы

6.1.2    Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дванзды).

4

ГОСТ 34136-2017

6.1.3    Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 °С до 110 °С.

6.1.4    Каждую новую партию реактивов проверяют на отсутствие контаминации анализируемыми соединениями путем проведения холостого опыта в соответствии с процедурой анализа.

6.2 Приготовление подвижной фазы А

Для приготовления подвижной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см³ приливают 300 см³ деионизированной воды и 5 см³ муравьиной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора деионизированной водой до метки на колбе.

Срок хранения раствора при температуре от 15 °С до 25 °С — не более 2 мес.

6.3 Приготовление градуировочных растворов

6.3.1 Приготовление исходных стандартных растворов макролидов, линкозамидов, плевромутилинов (растворы С₀) массовыми концентрациями 200 мкг/см³

Для приготовления исходных растворов С₀ с массовой концентрацией 200 мкг/см³ рассчитывают необходимую массу ьго вещества, мг, с учетом содержания основного вещества для каждого определяемого аналита по формуле

">,-сллМ.    *4—0.001.

П '”амалита /

где С— концентрация /-го аналита в стандартном растворе, мкг/см³;

V— объем мерной колбы, см³;

Р, — массовая доля основного вещества в на стандартном образце, %;

М, — молярная масса основного вещества в йм стандартном образце, г/моль;

^аналита i ~ молярная масса йго аналита. г/моль.

В мерные колбы вместимостью 25 см³ по отдельности вносят рассчитанные массы исходных веществ (взвешивание проводят с точностью до первого десятичного знака). Приливают по 15 см³ метанола, перемешивают и после полного растворения сухого вещества доводят объем растворов метанолом до метки на колбе. Помещают в ультразвуковую баню на 5 мин в режиме перемешивания.

Срок хранения растворов при температуре от минус 15 °С до минус 25 °С — не более одного года.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.2 Приготовление рабочих стандартных растворов макролидов, линкозамидов, плевромутилинов массовыми концентрациями 10 мкг/см³ (раствор С,), 1 мкг/см³ (раствор С₂), 0,1 мкг/см³ (раствор С₃)

Рабочие растворы С,. С₂, С₃ готовят в мерных пробирках вместимостью 10 см³ в соответствии с рисунком 1.

Растворы C_v С₂. С₃ хранят при температуре от минус 15 °С до минус 25 “С.

Срок хранения раствора С, — не более 6 мес. С₂— не более 3 мес. С₃ — не более 1 недели. Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

5

6.3.3 Приготовление исходных растворов внутренних стандартов макролидов, линкозамидов, плевромутилинов массовыми концентрациями 200 мкг/см³ (растворы О₀)

6.3.3.1 Внутренние стандарты для макролидов, линкозамидов. плевромутилинов выбирают в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1 — Соответствие между аналитами и внутренними стандартами

Наименование а на лита Наименование внутреннего стандарта Спирамицин Азитромицин-ДЗ Тулатромицин Тилмикозин Эритромицин Рокситромицин-Д7 Кларитромицин Тилвалозин Тилозин Линкомицин Клиндамицин-ДЗ Клиндамицин Пирлимицин Валмемулин Валнемулин-Дб Тиамулин

6.3.3.2 Для приготовления исходных растворов О₀ массовой концентрацией 200 мкг/см³ рассчитывают необходимую массу Аго вещества, мг (взвешивание проводят с точностью до первого десятичного знака), с учетом содержания основного вещества во внутреннем стандарте по формупе 1.

В мерные колбы вместимостью 25 см³ по отдельности вносят рассчитанные массы исходных веществ. приливают по 15 см³ метанопа, перемешивают до попного растворения сухого вещества. Доводят объем растворов метанолом до метки на колбе, затем помещают в ультразвуковую баню на 5 мин.

Срок хранения растворов при температуре от минус 15 *С до минус 25 °С — не более одного года.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.4 Приготовление рабочих растворов внутренних стандартов массовыми концентрациями 2 мкг/см³ (раствор D_t) и 1 мкг/см³ (раствор 0₂) каждого внутреннего стандарта

Рабочие растворы внутренних стандартов D_t, 0₂ готовят в мерных пробирках вместимостью 10 см³ в соответствии с рисунком 2.

Рисунок 2 — Приготовление рабочих растворов внутренних стандартов Dv D2

Растворы О,. D₂ хранят при температуре от минус 15 °С до минус 25 °С.

Срок хранения раствора О, — не более 6 мес. 0₂ — не более 3 мес.

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.5 Приготовление матричных градуировочных растворов (растворы G₁—G₈)

Матричные градуировочные растворы G,— G₈ готовят в виапах или полипропиленовых пробирках вместимостью 15 см³ из «чистых» проб массой 1.0 г, в которые вносят рабочий раствор внутренних стандартов D₂ и рабочие растворы определяемых аналитов С,. С₂, С₃ в соответствии с таблицей 2.

6

Таблица 2 — Приготовление матричных градуировочных растворов G,—G8

Обозначение и массовая концентрация матрич-нота градуировочного раствора Вносимый объем рабочего раствора см3 с. С2 С3 02 G, (3200 нг/см3) 0.32 — — 0.05 G2(1000 нг/см3) 0.1 — — 0.05 G?(500 нг/см3) 0.05 — — 0.05 G4( 100 нг/см3) — 0.1 — 0.05 G5( 50 нг/см3) — 0.05 — 0.05 Ge(10 нг/см3) — — 0.1 0.05 G7(5 нг/см3) — — 0.05 0.05 G8(1 нг/см3) — — 0.01 0.05

Пробирки встряхивают в шейкере в течение 1 мин. выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин и проводят дальнейшую обработку растворов согласно разделу 7.

Растворы G,—G₈ используют свежеприготовленными.

7 Отбор и подготовка проб

7.1    Отбор проб

7.1.1    Отбор проб мяса, печени — по ГОСТ 7269.

7.1.2    Отбор проб мяса и печени птицы — по ГОСТ 31467.

7.1.3    Отбор проб мясных продуктов — по ГОСТ 4288, ГОСТ 9792.

7.1.4    Отбор проб рыбы, креветок — по ГОСТ 31339.

7.1.5    Отбор проб молока и молочных продуктов по ГОСТ 26809.1. сыра — по ГОСТ 26809 2.

7.1.6    Отобранные пробы по 7.1.1, 7.1.2. 7.1.4 при отсутствии возможности анализа вдень отбора замораживают и хранят при температуре от минус 15 °С до 25 °С до проведения анализа.

7.2    Подготовка проб

Подготовку проб молока и молочных продуктов проводят по ГОСТ 26809.1. сыра — по ГОСТ 26809.2. Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани. Рыбу предварительно очищают от крупных костей и кожи, креветки — от хитина и других нецелевых составляющих. Мясо, субпродукты, мясные продукты, рыбу, креветки измельчают на гомогенизаторе. Обработку проб проводят в соответствии с рисунком 3 (см. стр. 8).

7.3    Очистка подготовленных проб методом ТФЭ

Картриджи для твердофазной экстракции предварительно кондиционируют, последовательно пропуская 2 см³ метанола и 2 см³ деионизированной воды (вакуум или избыточное давление не применяют). Затем пропускают через картридж пробу, полученную в соответствии с 7.2. Промывают картридж 2 см³ деионизированной воды и сушат в вакууме водоструйного насоса в течение 10 мин. Элюируют определяемые вещества в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см³ с помощью 3 см³ метанола. Упаривают элюат до 0.1—0.2 см³ в токе азота при температуре не более 40 °С. добавляют 0.5 см³ подвижной фазы А (см. 6.2). перемешивают и переносят в полипропиленовую пробирку вместимостью 1.5 см³. Доводят объем раствора до 1.0 см³ подвижной фазой А. центрифугируют при 15000 об/мин и температуре 4 °С в течение 10 мин. Затем фильтруют через мембранный фильтр в ви-алу вместимостью 2 см³ и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

7

Рисунок 3 — Подготовка анализируемых проб

8 Порядок выполнения анализа

8.1    Условия хроматографического разделения

8.1.1    Масс-спектрометр и хроматограф включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры рабочих режимов масс-слектрометрического детектирования и хроматографического разделения.

8.1.2    Например, для колонки диаметром 2.1 мм. длиной 150 мм. с обращенно-фазным сорбентом С18 с размером частиц не более 5.0 мкм. соблюдают следующие условия хроматографирования:

-    температура колонки — 40 °С;

-    скорость потока подвижной фазы — 0.2 см³/мин;

-    объем вводимой пробы — 20 мм³.

Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление подвижной фазы А в соответствии с 6.2. в качестве подвижной фазы Б используют ацетонитрил) в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3 — Условия градиентного элюирования при регистрации положительных ионов

Время, мин	Подвижная фаза А. %	Подвижная фаза Б.%
0,0	100	0
1.0	100	0
11.0	5	95
11,1	100	0
20,0	100	0

8.1.3 Параметры режима ММР при измерении макролидов, линкозамидов. ллевромутилинов приведены в таблице 4.

Параметры настройки масс-слектрометрического детектора:

-    режим работы источника — ионизация электрослреем. ESI.

-    напряжение на распыляющем капилляре (IS) 5500 В при регистрации положительных ионов;

-    температура источника 450 °С;

-    разрешение квадруполей Q1 ЮЗ — единичное;

-    давление газа для фрагментации (CAD) — 6 кПа.

1

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002

2

* Срок хранения «чистых» проб при температуре от минус 15 X до минус 25 X — не более 3 мес

3